Yöntem makalesi

Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

DOI:

10.3791/54880

⸱

31 Aralık 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

yama kelepçe tekniğiyle hücreleri elektrofizyolojik kayıtları ateş şekillerine göre, farklı nöronal türlerinin tanımlanması için mümkün hale gelmiştir. Kayıt elektrot biocytin / neurobiotin dahil dendritik arborization ve kaydedilen nöronların akson hedef bölgeleri belirlemek için gerekli olan morfolojik detaylar, post-hoc kurtarma izin verir. Bununla birlikte, farklı bir nörokimyasal kimlikleri ve işlevleri, hücre tipi özel proteinler için immünohistokimyasal boyama ile morfolojik olarak benzer nöronların varlığı göz önüne alındığında kesin nöronlar tespit etmek şarttır. Ağ bağlantısı sağlamak için, fizyolojik kayıtlar için beyin kesitleri 300 um ya da daha büyük bir kalınlıkta hazırlanır. Ancak, bu kalınlık genellikle doku geriden kestirmeye gerektiren nedeniyle antikor penetrasyon ile ilgili sorunlar immünohistolojik postprocessing engellemektedir. dilim rezeksiyon genellikle resul, zorlu bir sanattırdoku ve hücre morfolojisi kaybına ting başka elektroifzyolojik veriler gereksiz verilerin işleme elde edilmiştir. nöronal belirteçlerin seçiminde veri kaybı ve rehber sınırlayacak morfoloji kurtarma yana, ikincil immün tarafından takip ilk hücre morfolojisi kurtarma stratejisini, kabul ettiler. Biz fizyolojik kayıtları ve nörokimyasal kimliğini belirlemek için bölümlerin restaining ardından morfoloji geri kazanılması için daha sonraki seri immün sırasında dolum biocytin için pratik bir yaklaşım getirmektedir. Biz, (PFA) paraformaldehid ile sabitlendi, koyulaştınldı ve kaplandı biocytin ile doldurulmuştur bölümleri ayrılmış ve daha sonra, ikinci bir birincil antikor gün ile tekrar boyanmış olabilir bildirmektedir. Bu restaining lamel kaldırılmasını, bir tampon çözelti içinde bölümlerin yıkama ve nörokimyasal kimlik ortaya çıkarmak için birincil ve ikincil antikorlar kuluçka içerir. yöntem, DAT ortadan kaldırmak için avantajlıdırmorfolojisi kurtarmak için bir yetersizlik nedeniyle ve nörokimyasal belirteçlerinin daraltarak için bir kayıp morfolojiye göre test edilecek.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin bireysel nöronal elementlerin yapısal ve işlevsel özellikleri çeşitlilik için bilinir. beyin fonksiyonu ve patoloji farklı nöron tiplerinin rolleri anlamak karakterizasyonu ve nöronların kesin kimlik gerektirir. aksonal arborization desen potansiyel postsinaptik hedefleri tanımlar iken Yapısal, somato-dendritik yere göre tanımlanan morfolojik özellikleri, belirli bir nöron alır potansiyel girişleri belirler. Nöronların yapısal çeşitlilik Ramon y Cajal seminal histolojik çalışmalar 1 günlerinden beri takdir edilmiştir. Tek hücreli kayıt tekniklerinin ortaya çıkışı, yapısal olarak farklı nöron ayrıca fırınlama desen ve sinaptik karakteristikleri bakımından farklılıklar gösterir ortaya koymuştur. Yapı ve fizyolojisi çeşitlilik GABAerjik inhibitör nöronlar 2,3 özellikle belirgindir. Buna ek olarak, bu structurall giderek daha açık hale gelmiştiry benzer nöronlar işlevsel farklılıkları 4 gelen farklı nörokimyasal işaretleri ve gösteri ifade edebilir. Benzer şekilde, aynı nörokimyasal işaretleri ile nöronlar farklı yapılar ve fonksiyonları 5-10 olabilir. Dolayısıyla, uygulamada, ağ nöronların işlev özelliklerinin analizi ve rolü, hem morfolojik ve nörokimyasal kimlik tanımlama gerektirmektedir. Hatta belirli nörokimyasal belirteçleri hedefleyen raportör fare hatları gelişine, o immünohistoloji 11 dayalı morfoloji ve alt tipi kimliğini belirlemek için genellikle gereklidir.

akut beyin dilimleri kaydedilen hücreleri karakterize etmek için kullanılan standart yöntem, kayıt sırasında biocytin veya neurobiotin ile doldurun kayıtları aşağıdaki paraformaldehid bölümleri (PFA) düzeltmek ve morfolojisi ve sinir kimyasını ortaya çıkarmak için immünhistokimya kullanmaktır. dilim fizyolojisi için bölümlerin kalınlığı bu yana 300 mikron tipik olarakBir çok antikor bu derinlik tüm yol boyunca nüfuz başarısız daha çünkü veya dilimler biocytin ve nöro-kimyasal işaretlerin 12-14 için eş zamanlı olarak immün izin vermek için 60 um ya da daha az yeniden kesitli olması gerekir. Ne yazık ki, rezeksiyon zahmetlidir; Kesit sırasında doku kaybı riskini; ve morfolojik rekonstrüksiyon komplike doku farklı büzülmeden yol açabilir. Ayrıca, morfoloji ön bilgi hücreleri tarafından ifade edilmesi muhtemeldir aday işaretlerini daraltmak yardımcı olabilir. Biz ilk morfoloji geri kazanımı için ve daha sonra olası nörokimyasal belirteçlerin tanımlanması için bölümlerin seri işleme izin vermek standart biocytin immünohistolojisi protokolleri değiştirdiniz.

İmmünohistokimya dokular ya da hücrelerin antijen dağılımının çalışmadır ve bir enzim, floresan etiketler, radyoaktif elementler, veya altın kolloid partiküller 15 ile görselleştirilebilir. prosedür Iözel olarak görselleştirme için birincil antikor hedefleme, ışıltılı ikincil antikorlar kullanılarak, ardından bir veya daha fazla spesifik antijenler, etiket ve yükseltmek için primer antikorlar kullanılarak nvolves. çakışma olmadan her bir ikincil antikorun flüoresans spektrumunu ayırt ihtiyacı nedeniyle, antijenlerin, sadece sınırlı sayıda eş zamanlı olarak kontrol edilebilir. Böylece, morfolojisi ön bilgi hücre sınıflandırma için aday nörokimyasal belirteçleri seçiminde yararlı olabilir. Kavramsal olarak, daha önce lekeli bölümlerinin seri işleme arkasındaki mantık, bir protein veya peptid için immün bir yapısal olarak bağımsız peptid 16 antijenite ve daha sonra immunolabeling engel olmamalıdır prensibine dayalıdır. müdahalenin olmaması, bir antijen üzerindeki belirli bir protein epitopa antikorların bağlanma nedeniyle ve bu nedenle aynı dokuda birden fazla antijene eşzamanlı boyama sağlar. antijenlerin sayısı revealeimmün D floresan ikincil antikor örtüşmeyen spektrumları için olan ihtiyaç ile çapraz reaktivite 17,18 ortadan kaldırmak için, farklı türlerde antikorlarla bağımsız antijenleri hedeflemek için ihtiyaç tarafından sınırlıdır. Bu monte bölümlerde bir veya birden fazla antijenler için immunolabeling tamamlandıktan sonra rapor edilmemiştir ikinci bir antijen için immün, bildiğimiz kadarıyla, etkileşebilir iki ayrı antikorlar ile seri ziyade eş zamanlı etiketleme arkasındaki mantık iken. Burada, daha önce boyanmış ve monte edilmiş bölümlerinin seri immün için bir yöntem tarif eder. detaylardaki kalınlığında kesitler protein / peptid belirteçleri için boyanarak, ardından morfolojisinin geri kazanımı için bir seri immün prosedürü için bu işlemi yaparken, aynı işlemler ince histolojik kesitler de bir standart olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, biocytin ve çıkarmak için işlem ile kaydedilen nöronların doldurmak için pratik bir yaklaşım tarifBizim son çalışma 6,8 sunulduğu gibi kayıtların tamamlanmasından sonra hücreden elektrot, akson ve nöronların dendritik milleri doldurulmasını optimize etmek.

Burada anlatılan prosedürün en önemli avantajı kaydedilen hücrenin morfolojisi tamamen iyileşti ve rezeksiyon veya dilimler immunostain çalışmadan önce görüntülü olabilir olmasıdır. Bazı antikorların penetrasyonu ile ilgili sorunlar ikincil immün için rezeksiyon dilimleri gerekli hale olsa da, burada ayrıntılı prosedürler birden fazla bölüm karmaşık nöronlar yeniden ihtiyacını ortadan kaldıracaktır ve yeniden tehlikeye hangi doku kaybı ve diferansiyel büzülmesine bağlı sorunları önleyeceğini geriden kestirmeye et. Bir avantajı süreci immün ve biocytin dolu nöronlar kurtarıldı edildiği dilimleri yeniden kesit sınırlayarak maliyet, zaman, çaba ve pahalı antikorların azaltılması olacaktır. En pratik yönü reklamdırYukarıda belirtilen teknik kullanılarak daha önce kesitler lekeli ay yapılabilir ditional immün. Özellikle, morfoloji kurtarma ölçüde hücrelerden fizyolojik veriler nedeniyle hücre tipi bir temel morfolojik karakterizasyon elde etmek için bir yetersizlik atılır bu potansiyeli azaltacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizyoloji sırasında 1. Biocytin Dolum

NOT: okuyucular burada üzerine özenli değil temel yama-kelepçe kayıt teknikleri ve enstrümantasyon 19-22, alternatif kaynaklara başvurabilirsiniz. Burada ayrıntılı adımlar yama-kelepçe kayıtları için ekipman ve prosedürler zaten kurulmuş olduğunu varsayalım ve açıklama biocytin doldurma ve post-hoc immün ilgili ayrıntılar ile sınırlı olacak. Bu yazıda belirtilen tüm deneyler fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir.

  1. 350 um 23 - bir vibratome kullanarak, 300 bir kalınlıkta, arzu edilen bölgenin canlı beyin kesitler hazırlamak.
  2. İç çözeltisi 6 1 ml biocytin 2 mg eklenerek% 0.2 biocytin içeren bir iç çözelti hazırlayın. biocytin tamamen eriyene kadar 15 dakika - En iyi sonuçlar için, 10 iç çözüm sonikasyon. Daha sonra, bir 0.2 ile donatılmış bir 1 ml şırınga içinde, iç çözüm yük# 160; mikron gözenek boyutu polipropilen filtre ucu Microloader bağlı. iç çözümü Mg-ATP ve Na-GTP istikrarı korumak için soğuk paketi üzerinde bu yükleme şırınga tutun.
    Not: bir iç çözelti içeren bir potasyum glukonat (126 mM K-glukonat, 4 mM KCI, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na-GTP, 10 mM fosfokreatin), bazı nöro-kimyasal işaretlerin geri kazanımı için uygun bir immün sırasında parvalbumin dahildir. bizim deneyim, Sezyum ve klorür bazlı iç çözümleri kullanarak belirli nörokimyasal belirteçler için immün kurtarmak için yeteneğini azaltır. Neurobiotin ya biocytin bir Alexa Fluorofor birleştiren bir hücre geçirgenliği olmayan, tamir edilebilir polar iz biocytin alternatif olarak kullanılabilir.
  3. Kızılötesi diferansiyel girişim kontrast altında kayıt için uygun hücre görselleştirmek. akson kesintileri en aza indirmek için, "yaklaşım" f kullanarak ekseni boyunca pipet düşürerek hücre gövdesi yaklaşımEn Mikromanipülatörler mevcuttur unction. Patch-kelepçe fizyolojisi protokolleri 19-22 kullanarak kızılötesi diferansiyel girişim kontrast altında tam hücre kayıtları kurmak.
    NOT: kesik ucuna (Şekil 1'de yeşil ok) bir bleb olarak görüntülenmiştir akson, sever gibi, varsayılan akson yönden hücreyi yaklaşan kaçının. Ayrıca, yüksek arka plan boyama neden olacaktır biocytin ve dökülme, en aza indirmek için hücreyi yaklaşırken kayıt pipet yüksek pozitif basınç uygulamaktan kaçının.

figure-protocol-1
Şekil 1. Biocytin doldurur için Hücreleri yaklaşırken için Plane önerdi. Resim (594-konjuge streptavidin kullanılarak kırmızı), bir granül hücre (GC) biocytin ortaya çıkarmak için işlendikten kayıt sırasında biocytin dolgu göstermektedir. GC XY düzleminde odaklı olarak dendrit vardır. kopmuş granül hücre dikkatakson nedeniyle XY düzlemi boyunca pipet hareketine (yeşil ok). o XZ düzlemi boyunca bu nöron yaklaşım ideal olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu: 50 mikron.

  1. gerilim kelepçe yapılandırmada, küçük (5 mV) yanıt olarak tüm hücre kapasitans ve seri direnç, kısa (30 ms) gerilim belirlemek, bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımı banyo modunda membran testi işlevini kullanarak kullanarak adımlar. Bu biocytin-dolum sağlamak için tüm hücre kayıt koşullarına kurulmasını sağlayacaktır.
  2. gerektiği gibi ya akım-veya voltaj-kelepçe modunda fizyolojik kayıtları yürütün. 34 ° C de> 10 dk bir minimum kayıt süresi idealdir.
    NOT: Daha uzun kayıt süreleri, oda sıcaklığında gerçekleştirilen çalışmalar için gerekli olabilir.
  3. Fizyolojik kayıtların tamamlanmasının ardından, yavaş yavaş (Z ekseni boyunca) yukarı alternatif, küçük adımlarla kayıt pipet hareket ettirerek yama-kelepçe yapılandırmasını yeniden kurmak vedışarı doğru voltaj-kelepçe modunda (X ekseni boyunca).
  4. Eş zamanlı olarak hücrenin yeniden sızdırmazlık ve bir dış-çıkış kurulmasını gösteren kapasitif geçici kaybı ve düz bir çizgi mevcut yanıtların çöküşünü görselleştirmek için "membran testi" fonksiyonunu kullanarak kapasite ve giriş direnci izlemek pipet ucunda yama. bir depolarize potansiyeli (-40 mV) hücreyi Holding yeniden mühürleme işlemini kolaylaştıracaktır.
    NOT: Bir hücrenin uzaklaştırılması için Bu prosedür genellikle soma ve dendritler tam iyileşme sağlar. Bu işlem sırasında ya da pipetle hücreyi ayırarak kayıt sırasında pipet pozitif basınç uygulamayın. dilim kaydedilen hücrenin soma Görselleştirme başarılı ayrılmasını gösterir. Hücresel enkaz veya müstakil ucu sonunda bir zar yama varlığı genellikle soma çıkık gösterir ve tam hücresel morfoloji vermez.
  5. kıçtaDistal dendritik ve aksonal süreçleri boya taşınmasını sağlamak için 5 dakika - hücreden pipet ayrılmakta er, 3 kayıt odasına dilim korur.
  6. tespiti için% 4 PFA ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka dilimleri aktarın.
    UYARI: PFA kanserojen ve eldiven ve yüz maskesi dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımlar, olduğu, cilt tahrişine ve inhalasyon önlemek için kullanılmalıdır. PFA yanıcı ve yangın ulaşamayacağı tutulmalıdır. PFA drenaj bertaraf asla ve kimyasal atık olarak toplanan gerekir. PFA tespit transferi pipetler dahil fizyoloji kurulum kirlenmesini önlemek için canlı dilim hazırlanması için kullanılan alanlar, izole edilmelidir.
  7. 24-48 saat PFA tespit sonrasında önce immün depolama için 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) dilim aktarın.
    NOT: İdeal olarak, kurtarma ve immün biocytin boyama per rağmen, kısa bir süre tespit sonrasında gerçekleştirilir en iyi zaman sabitleme verimleri iyi sonuçlar 7 gün içerisinde kurdu. Bu nedenle ameliyat sonrası gün 90 üzerinde kadar gerçekleştirilen boyama için,% 0.05 sodyum azid - Dilimler 0.02 PBS içinde muhafaza edilebilir. PFA gece boyunca tespiti en antikorlar için iyi çalışmasına rağmen, sabitleyici inkübasyon süresi azalır bazı antikorlar, en iyi sonucu olasıdır. 48 st için PFA Tespit antijenlerin kullanılabilirliğini azaltır ve nörokimyasal belirteçler için başarılı ikincil immün şansını azaltmaktadır.
    DİKKAT: Sodyum azit son derece tehlikeli ve yenmesi veya inhalasyon cilt veya gözlerle veya üzerine temas halinde tahriş edicidir. Şiddetli aşırı maruz kalma ölümle sonuçlanabilir. bileşik kanserojenliği ve mutajenisite bilinmemektedir. eldiven, gözlük sıçrama, bir laboratuvar önlüğü ve toz solunum dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. Sodyum azit drenaj bertaraf asla ve kimyasal atık olarak toplanan gerekir.
Ana birincil antikor ve Biocytin arasında e_title "> 2. Boyama

(1.gün)
Not: Aşağıdaki immüno-boyama prosedüründe serbest yüzen bölümler için ve inkübasyon adımları için bir çalkalayıcı üzerinde düşük bir hızda (2 devir / dakika, rpm) sürekli bir şekilde çalkalanarak gerektirir.

  1. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika her biri için, doku 3x yıkanır.
    Not: NaCl 8 g, KCI, 0.2 g, Na 2 HPO 4 1.44 g, ve KH 2 0.24 g PO4, 1: aşağıdaki şekilde, 0.1 M PBS, ticari olarak laboratuarda satın alınabilir ya da yapılabilir (1 L) yapar dH 2 0 L.
    Not: İstenilen nörokimyasal işaretçi biliniyorsa, bir protein için boyama / peptid biocytin boyama ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir (2.2 adım - 2.4). Sadece biocytin için boyama ise 2.5 adıma geçin.
  2. İSTEĞE BAĞLI:% 10 serum engelleme Blok (bs, oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ile seyreltilmiş normal keçi serumu (NGS)).
    NOT: Her iyi olmalıçözeltinin aynı hacmi içerir; / Kuyu 500 uL - tavsiye hacmi 250 arasındadır. Engelleme serum seçimi ikincil antikorlar (örneğin, NGS boya-konjüge edilmiş keçi anti (ilgili primer antikor türleri) için kullanılır) yetiştirilir olan türlere dayanmaktadır. başlıkların immunostain farklı türlerde ortaya sekonder antikor kullanımı ortaya çıkarsa, adım (2) bloke etmek üzere, her normal serum% 10 ve birincil ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, her normal serum% 3 arasındadır.
  3. (İSTEĞE BAĞLI) primer antikor bölümleri inkübe RT O / N 0.1 M PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS CB1 R (poliklonal hamster). CB1 R kanabinoid reseptör tip 1 ekspresyonunu tespit etmek için kullanılır.
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve biocytin dolum ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Şekil 2, ilk boyama işlemi sırasında biocytin ve CB 1 R etiketli bir bölümü göstermektedir. O / N incuOda sıcaklığında Bation birincil antikor çok için yeterlidir; inkübasyon 5 d - ancak, CB 1 R dahil olmak üzere bazı birincil antikorlar, 3 gerektirir. İnkübasyon daha uzun 1 D olması gerekir, Triton X-100 dilimleri geçirgenliği ve oda sıcaklığında uzun süreli inkübasyon sırasında doku tahrip olmasına yol açmaktadır, çünkü 4 ° C'de inkübe etmek önerilir. İkinci antikorun, belli bir kontrol olarak deney, her dizi için, en az bir bölümünde primer antikor içermeyen bir negatif kontrol içerir. Negatif kontroller için ilk antikor ihmal edilir ancak% 0.3 Triton 0.1 M PBS içinde X-100 ve BS eklenir.

figure-protocol-2
Şekil 2. Başarılı CCK Boyama Biocytin Boyama ve C Kurtarma ardından 1 Hafta Reseptör Tip 1 (CB 1 R) annabinoid - etiketleme. (A - C) ok ile gösterilen biocytin doldurulmuş nöron (A) ve CB1 R immünoreaktivitesi (B) gösteren 60X konfokal ve görüntüler. Aynı bölümü 1 hafta (C), sonra, CCK immün işlenmiştir. Görüntü bindirme D 'de gösterilmiştir. CCK immunreaktivitesine uzak-kırmızı kullanılarak ortaya çıktı ve camgöbeği pseudo-boyandı. (E) biocytin ve CB 1 R boyama hatta ikinci CCK immün sonra belirgin olduğu A. Not biocytin dolu hücrenin morfolojik yeniden yapılanma. Ayrıca CB 1 R ve CCK immün desen beklenen dağılımı not edin. (F - H) A olarak hücreden akson Büyütülmüş görüntü, biocytin gösterisi yakın işbirliği yerelleştirme ve akson CB 1 R (ok başları). Ölçek çizgisi: 50 um (A - D), 100 um (E) ve 10 um ( ve ark çoğaltılamaz edilir. 2015 9. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(2. gün)

  1. 0.1 M PBS (pH = 7.4) bölümler 10 dakika her biri için 3x beyin yıkayın.
  2. streptavidin kırmızı boya birleşmişi 'bölümleri inkübe (konsantrasyon: 1: 1000, eksitasyon: görünür tayfta emisyon 594 nm)' de, 4 ° CO 0.1 M PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS / K koyu (alüminyum folyo ile sarılmış) biocytin ortaya çıkarmak için. Aşama 2.3 isteğe bağlı primer inkübasyonun ardından yukarıdaki inkübasyon: (yeşil 488 nm ve emisyon uyarım 500: 1 konsantrasyon): İsteğe ikincil antikor, keçi anti-kobay içerir.
    Not: İkincil antikor isteğe bağlı birinci antikor, boyama (2.3 aşama) yerine getirilmesi durumunda gerekli olacaktır. Bir stre biocytin görselleştirmek içino (- 3 Şekil 1) detaylı ve daha iyi kontrasta sahip ince aksonlar görselleştirmek için yardımcı olarak kırmızı bir emisyon spektrumu ile ptavidin-flüorofor konjuge tavsiye edilir. iki ya da üç immün sırasında birbirleri ile sekonder antikorların çapraz reaktivite önlemek için, seri bir şekilde (antikorlar seri eklemeler arasında 2 saat aralığı yeterlidir) peş sekonder antikorlar, bir ekleyin. Şekil 3A, isteğe bağlı birinci antikor boyama işlenip rezeksiyon önce görüntülü bir biocytin dolu bir hücreyi göstermektedir.

figure-protocol-3
Şekil 3. Biocytin Morfoloji ve rezeksiyon ve Kurtarma aşağıdaki Başarılı İkinci immün. Bir biocytin dolu hücrenin dendritik morfoloji kurtarma gösteren 300 mikron dilim (A1) Konfokal görüntü. (<500 ve -100 pA akım enjeksiyonları cevaben nöron strong> A2) Membran gerilim izleri. Montaj ve görüntüleme sonrası (A1) 300 mikron bölüm rezeksiyon sonrası elde edilen 50 mikron bölümünde biocytin dolu soma (B) Kurtarma. (B2) ince bölümün sonraki immün CCK (orta panel) ile biocytin dolu soma (sağ panel) ko saptandı. Birleştirilen görüntü sağ panelde gösterilmektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron. Panel A2 Yu ve ark izni ile yeniden üretilir. Basın 25. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(Gün 3)

  1. Yıkama beyin kesitleri 0,1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika her biri için 3 kat.
  2. floresan korumak ve gelecekte yeniden boyama kolaylaştırmak için, sek montajSu esaslı bir montaj ortamı içinde sonuçlarını ve şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarlarını kapatırlar.
    NOT: nedeniyle cam slayt montaj orta kaçak slayt, kalıp istila ve doku dehidratasyon oje kaldırarak zorluklar önlemek için mümkün olduğunca erken bölümleri restain en iyisidir. Mikrobiyal kirlenme PBS içinde% 0.02 sodyum azid ile önlenebilir.
    DİKKAT: su ile temas halinde olduğunda, sodyum azid oldukça toksik ve yanıcı değildir. Tehlikeli kimyasalların taşınması ve bertarafı için standart işletim prosedürlerine bakınız.
    (Gün 4-7)
  3. 594 ve 488 nm ve yeşil, kırmızı ve nöro-kimyasal işaretlerin (CB1 R) 'de biocytin doldurulmuş nöronlar ortaya çıkarmak için 20X ya 40X bir büyütmede eksitasyonla confocal görüntüleme gerçekleştirin. (Şekil 2) colabeling değerlendirin.
  4. photobleaching ve obta önlemek için en az 100 ms Kamera pozu ayarlamakTüm nöronun akson ve dendritik milleri konfokal görüntü yığınlar. Kullanım konfokal görüntü yığınları ve nöron izleme yazılım paketleri nöronal morfoloji yeniden.

İkinci primer antikor 3. boyanması

NOT: İkinci immün adımı ilk boyandıktan sonra 90 d yapılabilir iken ikinci primer antikor boyama 7 içinde yapılırsa, optimum boyama elde edilir - 10 d.

(7 Sonra - 90 d)

  1. Bir pamuklu çubukla için aseton uygulayın ve cam slayt kapalı oje şerit.
  2. ince uçlu forseps kullanılarak dikkatlice lamel çıkarın ve bölümlerde 0.1 M PBS birkaç damlacıklar koydu.
  3. Dikkatle ince bir boya fırçası kullanarak slayt bölümleri çıkarmak ve 24 için 0.1 M PBS içinde yıkayın - 4 o C'de düşük ışıkta alüminyum folyo kaplı bir çalkalayıcı üzerinde 48 saat
    NOT: bir ile bölümleri kapsayacak şekilde önemlidirluminum folyo photobleaching önlemek için.
  4. 10 dakika her biri için 0.1 M PBS ertesi günü 2x - montaj orta tümüyle kaldırılmasını sağlamak için, bölümlerinin 1 yıkayın.
  5. Ikinci birincil antikor inkübasyon ile devam (örneğin, kolesistokinin, belirli bir GABAerjik internöronlar (CCK bulunan bir nöropeptid, konsantrasyon: 1: 1,000; fare monoklonal antikoru)) 1 gün (Şekil 2) dir.
    NOT: Bu işlem 2.3 adıma benzer ama farklı antikor kullanılır. Ayrıca, engelleme adımı yeniden boyama esnasında göz ardı edilir.
  6. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika için her beyin kesitlerinde üç kez yıkayın.
  7. fluorofor-konjuge sekonder antikor keçi anti-fare ile Leke (konsantrasyon: 1: 500; dalgaboyu: 647 nm), ikincil antikor uyarma-emisyon spektrumları streptavidin (konsantrasyon ile örtüşmeyen emin: 1: 1.000; eksitasyon dalga boyu: 594 nm) ve önceden immünofloresanlekeleri.
  8. Sulu montaj ortamında bölümleri monte edin ve şeffaf tırnak cilası ile kapak kayma kenarları mühür.
    Not: floresan korumak için opak muhafaza kutusu içinde 4 ° C'de bölümleri saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

başarı ile tamamlayan bölümler biocytin dolgu ve immün 2. adımda gerçekleştirilen ve konfokal veya Epifloresans mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir korur. Buna ek olarak, işleme bölümleri de Şekil 2'de gösterilen bölümde 3. adımda takip eden işlemler sırasında etiketli antijen için immün gösterir, kalın bir bölüm (300 um) bir biocytin doldurulmuş nöron morfolojisi streptavidin kullanılarak ortaya çıkarılmıştır kırmızı ve ilk birincil (CB 1 R) görüntülen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

biocytin ile yamalı hücreyi Dolum morfoloji tam iyileşme sağlamak için en önemli adımdır. Hücrenin tam iyileşme için, dilimleme sırasında süreçlerin kopardığınızı en aza indirmek için en uygun dilim yönünü seçmek için esastır. Bu yönelim, inceleme altındaki devre ve hücre tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha sonra, biocytin dendrit ve akson yayılmaya için yeterli zaman tanımak esastır. Böyle neurobiotin gibi bazı boyalar, aynı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar VS NIH / NINDS R01 NS069861 ve NJCBIR CBIR14IRG024 destek kabul etmek istiyorum

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaClSigmaS7653İmmün Boyama
KClFluka60129İmmün Boyama
Na2< / sub>HPO4< / sub> SigmaS7907İmmün Boyama
KH2PO4 Sigma229806İmmün Boyama
Triton X-100SigmaT8787İmmün Boyama
Gine domuzu anti CB1  SigmaAf530-1İmmün
Boyama Fare anti CCKCURE, UCLAG. Ohning'in izniyleİmmünostaining
Tavşan anti ParvalbuminSwantPV27İmmünostaining
Streptavidin, Alexa Fluor konjugeMoleküler ProblarS11227İmmün Boyama
Normal keçi serumu (NGS)SigmaG9023İmmün boyama
Vectashield Vector LabsH-1000İmmün Boyama
İkincil AntikorlarInvitogen Moleküler problarAlexa Fluor konjuge boyalarİmmün boyama
Labnet orbit düşük hızlı çalkalayıcıBioexpressS-2030-LSİmmün
Boyama ForsepsDumont11231-30İmmün
Boyama Slayt klasörleriEMS71520İmmün boyama
Vibratom VT 1200 SLeica14048142066Elektrofizyoloji
Multiclamp 700B amplifikatörMoleküler cihazlarMulticlamp 700BElektrofizyoloji
pCLAMP 10 YazılımMoleküler cihazlarpCLAMP 10 Elektrofizyoloji
SayısallaştırıcıMoleküler CihazlarDigidata 1440 sayısallaştırıcıElektrofizyoloji
Filtre uçlarıNalgene171-0020Elektrofizyoloji
SonikatörFisher Scientific15-335-100Elektrofizyoloji
Mikro yükleyicilerEppendorf930001007Elektrofizyoloji
BiyositSigmaB4261Elektrofizyoloji

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  3. Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  4. Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
  5. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553(2013).
  6. Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
  7. Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
  8. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
  9. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
  10. Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
  11. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109(2015).
  12. Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
  13. Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
  14. Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17(2011).
  15. Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
  16. Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
  17. Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
  18. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358(2015).
  20. Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
  21. Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
  22. Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
  23. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  24. Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
  25. Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
  26. Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109(2013).
  27. Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
  28. Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biocytin Doldurmamm nohistokimyasal BoyamaMorfoloji Geri Kazan mYama Kenetleme KaydSeri mm nboyamaBeyin Kesiti Haz rlamaAntikor PenetrasyonuKonfokal G r nt lemeH cre Morfolojisi

İlgili makaleler