Vagus sinir stimülasyonunun periferik inflamasyonu azaltmada güçlü bir etkinliği olduğu kanıtlanmıştır. Burada, sınırlı inflamatuar yanıtlarda kolinerjik antiinflamatuar mekanizmaların daha ileri incelemelerine olanak tanıyan modifiye bir vagus sinir stimülasyon protokolü sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kurtarma Zamanı Artan ve Sınırlı Enflamatuar Yanıtları içinde Vagus sinir stimülasyonu Mekanizmaları Eğitim için LPS İdaresi Azalmış
Bu makalede
Özet
Özet
Enflamasyon, sitokinleri ve diğer inflamasyon mediatörlerini serbest bırakan aktive makrofajlar, monositler ve diğer bağışıklık hücrelerinin aracılık ettiği enfeksiyon ve doku hasarına lokal bir yanıttır. Uzun bir süredir, humoral ve hücresel mekanizmalar, immün yanıtı düzenlemedeki rolleri nedeniyle incelenmiştir, ancak immünoloji ve sinirbilim alanındaki son gelişmeler, ilginç terapötik potansiyele sahip spesifik nöral mekanizmaları da çözmüştür. Kolinerjik antienflamatuar yol (CAP) olarak adlandırılan, doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini ve iltihabı çok güçlü bir şekilde kontrol etmek için tanımlanmıştır. 2000'li yılların başında, Tracey ve işbirlikçileri vagus sinirini uyaran ve yolun etkisini taklit eden bir teknik geliştirdiler. Metodoloji, kalp atış hızı değişkenliğinin deregülasyonu gibi aşırı stimülasyonun herhangi bir yan etkisinden kaçınmak için vagus sinirinin düşük voltaj ve frekansta elektriksel stimülasyonuna dayanmaktadır. Stimülasyon için elektrikli cihazlar artık mevcuttur, bu da laboratuvarda metodolojinin kurulmasını kolaylaştırır. Bu araştırmanın amacı, prostaglandinlerin OTP'ye potansiyel katılımını araştırmaktı. Ne yazık ki, daha önceki denemelere dayanarak, indüklenen enflamatuar yanıt ya çok yüksek ya da enzimatik metabolizma özellikleri için uygun olmadığı için orijinal protokolü kullanamadık. Orijinal cerrahi protokolünün farklı ayarları çoğunlukla değişmeden kaldı, ancak enflamatuar indüksiyon ve fedakârlıktan önceki zaman noktası ile ilgili koşullar amaçlarımıza uyacak şekilde iyileştirildi (yani, CAP'ın daha sınırlı inflamatuar yanıtlarda katılımını araştırmak için).
Burada sunulan orijinal protokolün değiştirilmiş versiyonu, vagus sinir stimülasyonu ve analizi arasında daha uzun bir zaman aralığı içerir, bu da inflamatuar yanıtların daha düşük bir indüksiyonu ile ilişkilidir. Ek olarak, enjekte edilecek lipopolisakkaritlerin (LPS) seviyesini düşürürken, dalakta mekanik özelliklerle ilgili yeni gözlemlerle de karşılaştık.
Giriş
Doğuştan bağışıklık organizmaların geniş bir alanda enfeksiyonlara ve hastalıklara karşı savunma derhal ilk satırı sağlar. Bu tehlike ortadan kaldırmak için primer bağışıklık tepkisi başlatır değil, ama aynı zamanda aktif hale patojen-spesifik bir şekilde ikincil bağışıklık karşılıklarını gerçekleştirir adaptif bağışıklık eğitiminde önemli bir rol oynar. Enflamasyon sırayla enfeksiyon alanına diğer bağışıklık hücrelerini çekme kabiliyetine sahip ve bu tür kızarıklık, şişlik, ağrı, fonksiyon kaybı ve ateş gibi inflamasyon kardinal belirtileri, ikna etmek sitokin ve kemokin bir bolluk, tarafından orkestra edildiği . süresi ve inflamasyon yoğunluğu çeşitli faktörlere bağlıdır, ancak iltihap çözme ve homeostazı geri kronik iltihaplı hastalıkların başlamasını önlemek için önemli bir adımdır. nörobilim ve immünoloji alanında son gelişmeler iltihaplanmayı kontrol etmek muazzam bir terapötik potansiyeli olan belirli sinirsel mekanizmaları açığa çıkarılmamışhem merkezi sinir sisteminde hem de çevresinde amasyon. Bu mekanizmalardan biri, otonom sinir sisteminin 4, 5 tarafından tahrik edilen enflamatuar refleks olarak bilinen kolinerjik, anti-enflamatuar yolu (CAP) olup.
Şu anda, inflamatuar mediatörler, merkezi sinir sistemine iltihabı durumuna ilişkin sinyaller duyu sinirleri aktive ve gönderme olduğu düşünülmektedir. Bir refleks yanıt sonra efferent vagus siniri tarafından etkinleştirilir. CAP anatomik detayları kapsamlı bir çalışma iki sinir oluşan bir parasempatik-sempatik modeli, vagus siniri ve dalak sinir sırasıyla 6 ortaya çıkarmıştır. CAP, aktive kolinerjik efferent vagus siniri henüz keşfedilecek bir mekanizma ile adrenerjik dalak sinir aktivasyonu ile sonuçlanan, çölyak-mezenterik ganglion sona erer. Bu şekilde aktive edilmiş dalak sinir, iç bilinmektedirbeyaz maddesinde bağışıklık hücreleri yakın, marjinal bölge ve CAP 7, 8, dalak, asil ve zorunlu organın kırmızı pulpunda vate. Dalak sinir uçlarından norepinefrin (NE) dalak T lenfositleri üzerinde eksprese gelen β 2 adrenerjik reseptörlere bağlanır. Bu da, bu şekilde sitokin üretimi ve iltihap 2 sınırlayıcı makrofajlar üzerinde α7 nikotinik asetilkolin reseptörleri (a7nACh), aktive kolin asetil transferazı (ChAT) aracılık ettiği asetilkolin (Ach) salınmasını tetikler. Sonuç olarak, sinir sistemi, periferik dokularda inflamasyonu düzenleyen ve yerel immün homeostasisi geri mümkün olduğu açıktır.
yolunun Adından da anlaşılacağı gibi, ACh sistemi bu nöro-immün düzenleyici yolunun işleyişi için merkezi öneme sahiptir. İlginç bir şekilde, mekanizma aktivasyonuna katılanCAP çevresi ve merkezi sinir sisteminde, farklı gibi görünmektedir. Dalakta nikotinik reseptörlerin önemi (α7nAChR) daha önce 9 gösterilmiştir edilmiş olsa da, muskarinik reseptörleri (mAChR) yolu 10, 11 merkez aktivasyonu için zorunludur. Öldürücü murin endotoksemi sırasında Daha yakın zamanda, merkezi olarak hareket eden M1 muskarinik agonist periferik olarak verilmesi önemli ölçüde bastırdı serumu ve dalak tümör nekroz faktörü α (TNFa), 12 sinyal sağlam vagus siniri ve dalak sinir gerekli bir eylem. Ayrıca, prostaglandin E 2 yoksun fareler (PGE2) Vagus sinir uyarımına yanıt mümkün değildi ve serum ve dalak 3 sitokin LPS ile uyarılan salımını aşağı regüle yoktu son göstermiştir. Bu nedenle, CAP aynı zamanda ana ACh pathw dışındaki sistemler tarafından düzenlenir olabiliray.
Vagus siniri, çünkü vücut dolanımı tabii gibi seçildi, karaciğer, akciğer, dalak, böbrek ve bağırsak 13 de dahil olmak üzere başlıca organların innerve. Bu büyük innervasyon ve vagus sinirinin çok kuvvetli immünosupresif etkisi göz önüne alındığında, CAP terapötik potansiyeli enflamatuar durumların geniş bir kapak olabilir. Uyuşturucu gövdeye eklenmiş Vagus siniri, elektriksel olarak (ya da mekanik olarak) geleneksel tedaviye voltaj ve frekans, aksine üzerinde kontrolü ile, aktive edilmiş olabilir. Denemeler kronik enflamasyonu 14 tedavisinde VNS klinik önemi test etmek için, örneğin, romatizma hastalarında halen devam etmektedir. Özet olarak, nöro-immün iletişim ve enflamasyon düzenleme geleneksel tedaviye olası bir alternatif tedavi sağlayacaktır araştırma, halen vardır. Bu nedenle, vagus sinirinin analizi stimülasyonn farklı innerve organlardaki etkisi ancak kronik enflamasyon hayvan modellerinde potansiyel terapötik etki de karakterizasyonu, kesinlikle verilerini kullanarak elde edilmesi ve yeni potansiyel tedavi edici hedefler için umut ediyorum.
Tracey ve meslektaşları 4 tarafından geliştirilen özgün metodoloji nedeniyle (LPS öldürücü dozda yoluyla) inflamatuvar yanıt aşırı uyarılması ve CAP aktivasyonu ve okuma-out arasında çok kısa bir zaman aralığına araştırma alanımızla aktarılmamıştır edilemedi. Mevcut yazıda, orijinal protokole yapılan değişiklikleri sunacak sitokin seviyeleri üzerinde iki farklı yöntemler karşılaştırın ve hedef organ (dalak) yeni ve karşı gözlem vurgulamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri bakımı ve Karolinska Enstitüsünde, Stockholm yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış hayvanların kullanımı için kurallarına göre yapılmıştır. Yerel Etik Komitesi hayvan bakımı konusunda Avrupa Birliği direktiflerini takip eder.
NOT: cerrahi (6 saat ile 1 saat karşı) ve LPS seviyesi (15 mg / kg karşı 2 mg / kg) enjekte sonra orijinal protokolden temel değişiklikler iyileşme süresi vardır. Aksi takdirde, ameliyattan kendisiyle ilgili farklı ayarlar değiştirilmedi.
1. Stimulation Malzeme hazırlama
- Bilgisayar ve uyarıcı elektrot (Şekil 1A) ile bağlantılı veri toplama sistemi açın.
- Acknowledge programına girin.
- 5 mg / 1 x PBS içinde ml, kısım o konsantrasyonda LPS bir stok çözeltisi hazırlandı ve -20 ° C'de saklayın. Deney günü, bir kısım Çözülme ve bir ade hazırlamakağırlığına göre, hayvana, yaklaşık 100 ul enjekte etmek için bir LPS (0.5 mg / ml) quate örneği.
2. Anestezi Hayvan hazırlanması
- C57BL / 6 fareleri kullanın. , 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile iklim kontrollü şartlar altında onları korumak, onlara standart kemirgen yemi yem ve onlara istedikleri kadar su verir.
- Deney günü yaklaşık 25 g ağırlığında fareler üzerinde ameliyat gerçekleştirin.
NOT: enflamatuar reaksiyonların neden olduğu zaman, düzenli kontrolleri ve hayvanlarda klinik reaksiyonların gözlemler gerçekleştirmek için özellikle önemlidir. Hayvan durumu etik kriterleri sağlamadığı takdirde CO2 inhalasyonuyla ötenazi erken gereklidir. - anestezik makineyi ayarlayın.
- boru doğru bağlandığını ve herhangi bir şekilde zarar görmemiş olduğundan emin olun. havalandırmalı alan düzgün çalıştığından emin olun. izofluran şişe anahtarı filtreyi bağlayın ve Vapo doldurmakizofluran yeterli bir miktarı ile Rizer.
- Gaz arzı (hava ve oksijen) açın ve şişeler deney için yeterli gaz içerdiğinden emin olun. Üç yollu konnektör sonra indüksiyon odasına veya maske izofluran akışını göndermek mümkün olduğunu.
- indüksiyon odasına üç yönlü konektörü çevirin. ev kafesten bir fare seçin ve odasına hayvan yerleştirin. 1.0 L / dakika, oksijen ve 1.0 L / dak hava akış düzenleme ayarlayın. % 5 - 4 izofluran konsantrasyonu ayarlayın.
- anestezi istenen seviyeye ulaşıldığında, anestezi istenilen düzeyde ulaşıldığında, cerrahi alan tıraş ve maskeye odasından hayvan taşımak. Maske akışına üç yönlü konektörü çevirin. 0.25 L / dak, oksijen ve 0.25 L / dak hava akış düzenleme ayarlayın.
- % 2.5 - 1.5 izofluran konsantrasyonu ayarlayın. ameliyat edilen başlamadan önce refleks kontrolü ve solunum oranı ile anestezi seviyesini kontrole.
- yapışkan bant kullanılarak çalışma tezgahına fare bacakları sabitleyin. Hayvanın burun hala dikkatle maskesi yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
Vagus sinirinin 3. Cerrahi ve stimülasyonu
- % 70 etanol ile cerrahi alan dezenfekte edin.
- bir neşter kullanarak dikkatli bir şekilde boyun (yaklaşık olarak 1 ila 1.5 cm'lik bir kesi) seviyesinde cilt insizyon.
Not: Protokolde, cerrahi prosedür SHAM çalışan hayvanlar için burada biter. Gerçekten de, sadece bir metal araç ile sinir dokunmadan önce bir dereceye kadar uyarır olduğu gösterilmiştir. LPS az miktarda kullanıldığında nedenle, daha doğru bir ameliyat kontrol hayvanı almak için, bu adımda ameliyatı durdurun. - mikroskop (12,5X objektif) yardımı ile, kesme forseps kullanılarak karotid arterden sol vagus sinirinin izole edilmesi. İlk cilt ve yağ tabakalarını kaldırarak sternocleidomastoid kas bulun ve sonra onu geri çekmeksinir ve arter hem arkasında forseps koymak sipariş.
Not: Sinir ve arter yakın birbirine yapışık olarak aşağıdaki adımı, oldukça zordur. Nedenle, gemiyi kesip hayvanı öldürmek çok kolaydır. Bununla birlikte, sinir ve arter arasında çok dikkatli bir şekilde forseps yerleştirerek, sonunda ayrı ve sinirinin izole edilmesi mümkündür. - Vagus sinir altında elektrot (Şekil 1B) yerleştirin. iğne elektrot oldukça uzun, yani sinir stimülasyonu sırasında hafifçe hareket etse bile, her zaman elektrot ile temas halinde olacaktır.
- (Sitokin seviyeleri üzerinde okunması için, yani, aşağı regüle etkisini ölçmek için), bir şırınga yardımı ile LPS intraperitonal (ip) enjeksiyon (2 mg / kg) uygulayın.
- uyarı başlatılmadan önce 5 dakika bekleyin.
- Onaylama programında, düğmeye basılması ile 5 V ve 1 Hz, 5 dakika için vagus siniri stimüle eder.
- Yenidenelektrodu taşımak ve cerrahi dikiş ipliğinin ile hayvanın yarasını sütür.
- sipariş iyileşmesini geliştirmek ve enfeksiyonlara karşı korumak için de yaranın üzerine bir yok Sting Bariyer Film (NSBF) püskürtün.
Hayvan 4. Kurtarma
- Ameliyattan sonra uyanış ve kurtarma için geri kafesine hayvan taşımak. vücut ısısını korumak için kızıl ötesi ışık altında, tam bilinç kazanmış kadar hayvan izlemek için emin olun.
- Hayvan analizi için kurban öncesi 6 saat süreyle kafesine geri alalım.
Not: Vagus siniri, uyarım etkisi çok hızlı ve aynı zamanda (en fazla 48 saat için) uzun ömürlü olduğu gösterilmiştir, bu nedenle iyileşme süresi çalışma gereksinimlerine göre deneyi tarafından ayarlanabilir.
Daha fazla analiz için 5. Kurban
- Bir CO2 uygulama cihazına bağlanmış bir kafeste hayvan yerleştirin.
- 5 Cihazı ayarlamaCO2 inhalasyonu -min döngüsü.
- Ötanazi yapılır, ilgi organları toplamak doğrudan daha fazla analiz için kuru buz üzerinde dondurma (örneğin, bir fare TH1 ile dalak özleri sitokin düzeylerinin ölçülmesi / TH2 9-Plex tahlili) 3.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TNFa ve interlökin-1 P (IL-1β) Düzeyi LPS Doz Cerrahisi sonra Zaman Atl Artan ve Azalan sonra
Daha önce gösterildiği gibi, orijinal protokol kullanılarak, ki burada VNS TNFa seviyelerini ve IL-1 p (360.0 ± 40.21 ug / mg (39.7 ± 10.8 pg / VNS de mg, p <0.001 versus SHAM içinde 169.3 ± 24.9 ug / mg) azalır intraperitoneal LPS enjeksiyonundan (15 mg / kg) (Şekil 2A) sonra dalak VNS içinde 191.7 ± 27.2 ug / mg, p ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
2000'li yılların başında keşfinden beri OTP mekanizmaları iyice çalışılmıştır. Şimdi yolunun iyi bir resim var ve özellikle de hedef organ, dalak, çok verimli bir ekip olarak NE, hafıza T hücrelerinin, ACH ve makrofajlar çalışma inflamatuar mediatörler 2 aşağı düzenleyen nerede. Ayrıca, yakın zamanda tabii ki CAP 3 aktivasyonundan sonra dalak ACh salgılanması için zorunlu bir bileşenidir, özellikle fareler, işlevsel bir prostaglandin sisteminin önemini, PGE2,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Romatizma Derneği, Karolinska Enstitüsü Vakıfları, Stockholm İl Meclisi, Wallenberg Vakfı ve GV 80 Yıllık Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca el yazmasını düzelttiği için Hannah Aucott'a teşekkür eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bilgisayar | Toshiba-Herhangi | bir bilgisayar aslında | |
| uyumludur MP-150 veri toplama sistemi | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Accept yazılımı | Biopac Systems | ||
| Fareler C57Bl / 6 | Charles River Anestezik | ||
| makinesi | Simtec Mühendislik | ||
| Tıbbi oksijen tüpü | AGA | 107563 | |
| Medikal hava şişesi | AGA | 108639 | |
| Vetfluran (1.000 mg / g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Salin | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | 10 kez seyreltilmiş |
| Şırınga (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| İğneler 23 G | KD-FINE | 0,6 x 30 mm (mavi) | |
| Mikrodiseksiyon forseps (kavisli) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Diseksiyon makası | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Cerrahi sütür 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Ötenazi ünitesi | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Bariyer Filmi | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex tahlil, ultra hassas kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Uyarıcı elektrot cihazı | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis tıraş makinesi | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Lantmannen, Stockholm, İsveç'ten kemirgen diyeti |
Kaynaklar
- Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
- Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
- Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
- Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
- Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
- Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
- Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
- Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
- Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
- Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
- Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
- Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
- Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. Psychoneuroimmunology. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).
- Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3(2012).
- Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
- Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
- Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
- Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530(2014).
- Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
- Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
