Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak Drosophila Larva Tarama Davranış

Özet

Drosophila larva davranış nöral kontrolünü incelemek için güçlü bir model sistem. Bu yayın, tekrarlanan tarama davranışı sırasında, larva yapılarının dinamik ölçmek için lineer tarama ve yöntemler sürekli nöbetleri ortaya çıkarmak için, doğrusal agaroz kanallarının kullanımını tarif eder.

Özet

Drosophila larva tarama sensorimotor davranış nöral kontrolünü incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmaktadır. , Duraklatma dönüm ve dolambaçlı: Ancak, düz açık yüzeylerde larva tarama davranışı da dahil olmak üzere, karmaşıktır. Hareketin repertuarında Bu karmaşıklık, tek bir tarama adım döngüsü sırasında meydana gelen olayların ayrıntılı analizini engellemektedir. Bu engeli aşmak için, doğrusal agaroz kanallar düz, sürekli, ritmik tarama larva davranış sınırlamak olduğunu yapılmıştır. Agaroz kanalları ve Drosophila larva vücut hem optik açıktır, çünkü prensip olarak, genetik olarak kodlanmış floresan problar ile etiketlenen larva yapıların hareket bozulmamış, serbestçe hareket eden larva izlenebilir. Geçmişte, larva lineer kanal içine yerleştirildi ve bütün organizmada kısım düzeyinde tarama ve kas ¹ analiz edilmiştir. Gelecekte, kanallarda tarama larva nöro izlemek için kalsiyum görüntüleme için kullanılabilirNAL aktivitesi. Ayrıca, bu yöntemler, bir genotip larvalarına ve herhangi bir araştırmacı tasarlanmış kanal birlikte kullanılabilir. Böylece aşağıda sunulmuştur protokol motor kontrolünü anlamak için bir model olarak Drosophila larva kullanan çalışmalar için yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

Bu yöntemin genel amacı ayrıntılı olarak Drosophila larva tarama incelemektir. Lokomosyon üzerinde deneyler geliştirilmesi ve motor kontrolü ² teorileri test önemli bir rol oynamıştır. Geleneksel olarak hareket su hayvanları (örneğin, sülük taşemen, larva) ³ incelenmiştir. bu hayvanlarda hareketin tekrarlayan doğa lokomosyon sürüş biyofiziksel olayların analizi için, ve lokomosyon eşlik nöral ateşleme desenleri izlenmesi için, ritim yaratılışına çalışması için izin verdi.

Yüzeysel genetik, iyi karakterize geliştirme, birinci ve ikinci instars de optik açık bir gövde ve entire devam eden bir transmisyon elektron mikroskobik yeniden: hareketin çalışmaları için Drosophila larva kullanımı diğer model sistemler üzerinde avantaj benzersiz bir bileşimini sunuyor sinir sistemi ^4-6. Ancak, Drosophila larva locodüz açık yüzeylerde hareket, duraklamalar da dahil olmak üzere biraz karmaşık döner ve kıvrımlı ⁷ tarar. Bu yayın larva, düz, ritmik tarama davranışı sürekli gerçekleştirmek şekilde Drosophila larva lokomotor davranışını yönlendirmek için doğrusal agaroz kanalları kullanmak için bir yöntem sunar.

Bunun yerine düz açık yüzeylerde davranış, agaroz kanallarda Drosophila larva davranış incelenmesi, çeşitli avantajları vardır. Birincisi, araştırmacılar özellikle larva davranışsal repertuar bir parçası olan pek çok hareketlerinden davranışı tarama seçmenizi sağlar. İkinci olarak, larva vücut büyüklüğü karşısında kanalın genişliğini ayarlayarak, tarama hızı ayarlanabilir. Üçüncü olarak, kanallar larva larva yüklenir ve kanal içinde nasıl yönlendirileceğini bağlı dorsal, ventral ya da yan tarafında görülebilir için izin verir. ilgi herhangi bir yapı tarama sırasında sürekli olarak görünür olması için larva yönde Bu çok yönlülük sağlar. Dördüncü,kanallar mikroskoplar ve hedeflerinin geniş bir yelpazede kullanım için müsait. Örneğin, doğrusal kanal / veya eğirme disk konfokal mikroskoplar ¹ yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve parlak alan stereoskop düşük çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir. Beşinci olarak, bu yöntem, herhangi bir genetik arka Optogenetic / thermogenetic nöronal manipülasyonlar ile bir arada kullanılabilir. (Birinci ve ikinci instars at) larva vücut ve agaroz kanallar hem optik açıktır, çünkü genetik olarak kodlanmış floresan problar ile etiketlenen larva yapıların floresan yoğunluğu dinamik hareketleri veya değişiklikleri inceleyerek Son olarak, kanallar kullanılabilir.

Tarif edilen yöntem olup, ilk ve ikinci instar Drosophila larva özelliklerinin detaylı kinematik çalışmalar için uygundur. Bu yayın kanallarının kullanımını göstermek için ileri larva tarama sırasında MSS floresan yoğunluğu dinamik değişiklikleri analiz ve bir habercisi olarak Neu içinronal kalsiyum görüntüleme.

Protokol

Larva 1. Hazırlık

1. Bir hafta davranışı kaydetmeden önce, bir haç (25 bakireler ve 5 erkek en az) kurdu. 25 ° C'de tüm haçlar ve soyunu korumak.
   Not: kültür koşulları sıcaklığı değiştirilebilir, ancak aşağıda tarif edilen zaman aralığı gelişim hızı değişiklikleri hesaba ayarlanması gerekir.
2. 5 gün sabah ilk şey kaydetmeden önce, bir agar / suyu kapağı ve ağar / suyu kap merkezinde maya hamur dab (0.5-1 ml) ile bir toplama kafes içine ortasını yerleştirin.
   1. Bir koleksiyon kafes yapmak için, bir 6 oz içine delik karıştırmak. Kare polietilen Drosophila şişe.
   2. , Ağar / suyu kapaklar hale konik bir şişe içinde 600 ml su ile agar 18 g karıştırın. 200 ml elma suyu ayrı bir şişeye karışımı 20 gr sakaroz. katılar kadar mikrodalga çözülür. Karışım, 60 ° C'ye kadar soğumaya bırakıldıktan, birleştirin ve karıştırın. % 95 etanol içinde 20 mL% 10 metil-p-hidroksibenzoat ekleyin ve karıştırın. Ekle ~ 735 x 10 mm yuvarlak petri kabı alt yarısına mi. Agar / suyu oda sıcaklığında 1 saat boyunca katılaşmaya izin verin. 4 ° C'de saklayın.
   3. , Maya salçası yapmak hacim kuru maya ve su eşit parçaya ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
3. Larva koleksiyonları sağlığını kontrol edin.
   1. Sabah, 4 ve 3 gün kayıttan önce, kapağı çıkarın ve kafes taze bir kap yerleştirin. 24 hr yumurta toplama ve yumurtadan yeni çıkmış larva elde etmek için her gün aynı saatte kapaklarını değiştirin.
   2. Her kapak kaldırıldıktan sonra, çapraz döşeme kaç yumurta görmek için inceleyin. Yani 500-2.000 yumurta arasında bekleyin. Gerekirse, yetişkinlerin sayısını ayarlayın.
      NOT: Bir kaç yumurta larva haline yumurtadan gerekirdi, ve yeni yumurtadan larva uzak maya macunundan bulunacaktır.
   3. 24 saat boyunca her kap yaş. Larvalar sağlıklı olup olmadığını belirlemek için kapağını yeniden inceleyin.
      NOT: Çoğu yumurta larva haline yumurtadan gerekirdi, ve larva siz içine sürünerek gerekirdiast yapıştırın. kötü sağlık belirtileri bir bağışıklık reaksiyonu gösteren karın önemli koyu yamalar ile bir çıkmamış yumurta çok sayıda uzak maya hamur ölü larva organları ve larvaları içerir. Larvalar sağlıksız ise, kafes değiştirmek taze kapakları / maya hamur yapın ve genotipi kontrol edin.
   4. Eski kapaklar atın.
4. Davranışsal kayıtları için larva toplayın.
   1. kaydetmeden önce de 2 ve 1 gün, kapağı çıkarın ve taze bir kapak ile değiştirin.
   2. Her çıkarıldı sınırı etiketi ve 25 ° C de devam edin. Bu davranış kayıtları için larva aşamalı dizi üretecek. İkinci instar (24-48 saat posthatch) ila (0-4 saat posthatch) yeni yumurtadan larvaları kanallar kullanılabilir. gün üst üste kayıtlar için kapaklar kaydedin.
   3. 48 saat sonra tüm kapakları atın.
   4. Gerekirse, en fazla 5 ek d 1.4.1-1.4.3 adımları tekrarlayın. Bu az sonra döllenmiş yumurtalar üretilir.

2. Kanallar hazırlanması

1. Doğrusal kanal PDMS (polidimetilsiloksan, bir silikon elastomer) döküm kalıp (Şekil 1A) hazırlayın. Döküm PDMS istek üzerine Heckscher laboratuarında temin edebilirsiniz.
   1. izopropil alkol ile döküm kalıbı temizleyin. Hava kuru, dab laboratuvar mendil ile kuru veya konserve hava kullanın.
   2. Bir 10 sm Petri kabı kapağı veya başka bir kap içine döküm kalıbı yerleştirin.
2. Hazırlayın ve agaroz çözüm dökün.
   1. tamamen çözünene dek mikrodalga tarafından su içinde% 3 agaroz çözeltisi (100 ml, 3 g) sağlayın.
   2. 55 ° C'ye soğutun, kabarcıklar yüzeye yükselmesini bırakarak.
   3. kalıp sadece kaplıdır, böylece döküm kalıbı içeren petri içine agaroz karışımı dökün. katılaşmış kadar agaroz set edelim.
3. döküm kalıp agaroz kanalları çıkarın. Bir jilet ile agaroz diskin kenarları kırpın.
   1. kanal koymaksu içine batırılmış bir 10 santimetrelik bir petri tabağına s. Bunlar, 7 gün boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

Kayıt Davranışlarına bir kanal içine larva yükleme 3.

NOT: 4 ° C'de kanallar saklamak durumunda, kanallar davranışsal kayıt için kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.

1. Aşama 2 (Şekil 2A) 'da hazırlanmış olan tek bir kanal kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanma.
2. Bir cam lamel (Şekil 2B) kanal yivli yan yukarı yerleştirmek için forseps bir çift kullanın. lamel çapı ve derinliği görüntüleme için kullanılan spesifik kapsama bağlıdır.
3. Adım 1'de hazırlanan ağar / meyve suyu kapağından bir larva seçin ve kesme kanalı (Şekil 2C) içine yerleştirmek için ince forseps kullanın.
   1. Larva sıkmak yok. forseps tine ucu ile hafifçe toplayın. Iyi bir noktaya sahip bir fırça ile larva işlemek de mümkündür.
      NOT: Bu önemli larva olarak çok sen olandokunmak sas. bunlar dikkatle ele değilseniz, nosiseptif tepkiler denemenin ilk birkaç saniye boyunca davranışlarını hakim olabilir.
   2. kısaca suyla daldırarak larvaları yıkayın.
   3. kesim kanalı üzerine larva yerleştirdikten sonra, yavaşça kanal koru içine larva kızdırmak için forseps tine ucunu kullanın.
      NOT: Bir çok uygulama için larva genişliği ve kanal genişliği aynı olmalıdır. Farklı gelişim aşamalarında larvaların ortalama genişliği aşağıdaki gibidir: 0 saat posthatch - 140 mikron, 24 saat posthatch - 180 mikron, 48 saat posthatch - 320 mikron, 72 saat posthatch - 500 mikron, 96 saat posthatch - 750 mikron ^8. Aşağıdaki genişliklere girmektedirler kanallar 100, 150, 200, 250 ve 300 mikron, ve bütün kanallar 150 um derindir.
   4. kanal içinde larva konumunu ayarlamak için bir forseps tine ya da fırça ucu kullanın. Bu, herhangi bir yönde yönlendirilmiş olabilir: ventralyukarı, ventral aşağı ventral bir tarafı, ne yapısına bağlı olarak, görüntülenecek olan.
4. Forseps kullanarak, hafifçe larva kapak camına şimdi olduğu gibi üzerinde kanalı çevirin. Bu, su (Şekil 2D) ile doldurur ve böylece kanalın ucunda su, bir veya iki damla yerleştirin.
   1. Yavaşça herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için kanalın kenarlarına kaldırın.
   2. larva yönünü ayarlayın. Bunu yapmak için, hafifçe kanalı değil larva rulo cam kapak dürtmek. Bu yönünü değiştirmek değilse, kapak camı kaldırın ve larva konumunu ayarlamak. Larva yansıması hazırdır.
   3. Görüntü kanal / ters bir mikroskop lamel. dik bir mikroskop görüntüleme, sadece kanal / lamel ters çevirin.

Davranış Kayıt İlgi 4. Tedbir Özelliği

1. Ilgi bir yapı için (örneğin, kuyruk, MSS), ilgilenilen bir özelliği ölçmek (örnZamanla, flüoresan yoğunluğu, yer).
   NOT: baş ve kuyruk gibi yapılar elle açıklamalı edilebilir. Örneğin, baş koyu H-şekilli ağız kanca içeren olarak tespit edilebilir ve kuyruk arka trakeal spiricles içerdiği tespit edilebilir. Bu yazıda sinir kablosu üzerinde duruluyor. Floresan merkezi sinir sistemini (MSS) etiketlemek için bir UAS-myr-GFP transgen (elav> GFP) ^9,10 sürmek için nöronal GAL4 hat elav-GAL4 kullanın. MSS posterior (Şekil 3) kadar uzanır sinir kablosu, bağlı iki ön beyin lobu içerir.
2. Her zaman noktasında (t) sinir kordonu (f _(NC)) piksel yoğunluğunu ölçün. Aşağıda manuel açıklama yaklaşımı açıklar, ancak bu adımı otomatik olabilir.
   1. 'Analiz' menüsünden Fiji (veya benzer yazılım) ortalama gri değeri ve dilim ve rapor "ayarla Ölçümler ..." diyalog kutusunu kullanıne konumu.
   2. El ile film (Şekil 3) ilk karesine sinir kablosu merkezinde bir kutu çizin. Bu adım aynı zamanda görüntü segmentasyonu ve kayıt algoritmaları ile otomatik olabilir.
   3. ilgi kutulu bölgedeki ortalama piksel yoğunluğunu rapor 'Analiz' menüsünden "Tedbir" komutunu kullanın. Bu bir "Sonuçlar" penceresi oluşturur.
   4. Bir sonraki çerçevede, elle ok tuşlarını kullanarak yeniden boyutlandırma olmadan kutuyu yeniden konumlandırmak. Yine "Tedbir" komutunu kullanın. güncellenmiş sonuçlar "Sonuçlar" penceresinde gösterilir. ilgi her kare için bu adımı yineleyin.
   5. Dosya menüsünden kullanarak "Sonuçlar" 'Save As ...' komutunu kaydedin. Sonuçlar bir .xls dosyası olarak ihraç edilecek.

5. Ölçümleri analiz

1. <0 ve 1 (z _(t arası bir değere _{(NC) değeri)} her bir F normalize/ Em>).
   1. e-tabloya (veya başka bir program) olarak Results.xls dosyasını açın. Bu dosya çerçeve numarası ve ortalama floresan yoğunluğu temsil eden iki sütun vardır.
   2. Yeni bir sütun yapmak ve _{([NC] f)} normalize floresan değeri oluşturmak için formül z _(t) = f _{(NC [t])} -Min _{(f [NC])} / max _{(f [NC])} -Min kullanın her bir zaman noktasında karşılık gelir.
2. Kayıtta her adım için adım süresini belirleyin.
   NOT: Bir adım döngü ileri için tekrarlayan tüm vücut hareket birimidir (ve tersi) tarama. Kongre tarafından bu tür bağırsak veya MSS ¹ olarak kuyruk, baş ve diğer iç organların ileri hareketi ile ileri adım başlar (ve biter).
   1. El ile her adım başlanması sürelerini (i) davranışsal kayıt incelemek ve kayıt (i _{(Stride Döngüsü [n])).}
      NOT: Aşağıdaki örnekte, ileri hareketCNS bir adım çevriminin başlatılması (Şekil 3) gibi.
   2. Her adım süresini hesaplamak: Δ t _{(Adım döngüsü) =} i _{(Stride Döngüsü [n + 1])} -i _{(Stride Döngüsü [n]).}
3. Kaydın her bir zaman noktası için geçen adım döngüsünün yüzdesini hesaplayın.
   1. Bir adım döngüsü (c) başlangıcından beri geçen süreyi temsil eden tablo dosyasında ek bir sütun olun. Saati ayarla her adım başlangıcında sıfıra adım başlatılması beri (c _{(Stride Döngüsü [n])} = 0). buna göre başladıktan sonra kere ayarlayın.
   2. . Geçen yüzde adım döngüsü (% adım döngüsü) geçtikten temsil tablo dosyasında ek bir sütun yapmak adım dönemi ayarlanmış kez bölün ve adım döngüsünün yüzdesine dönüştürmek için 100 ile çarpın:% adım döngüsü = (c _{(Stride Döngüsü [n] ))} / (Δ t ₍Adım döngü) * 100).

6. Polar Tarama Döngüsü üzerinden İlgi Yapıların Dinamikleri Temsil Arsalar Koordinat üret

1. MATLAB, güncellenmiş Results.xls almak için Giriş sekmesinde 'İthalat Verilerini' diyalog kullanın.
2. Make a yeni bir dizi "Teta" içeren yüzde adım döngüsü değerleri (% adım döngüsü). (Q1% adım devrini temsil eder "teta = var1").
3. Yeni bir dizi "Rho" normalize floresan değerleri (z _(t)) içerirler olun. (Var2 z _(t temsil eden "Rho = _var2")).
4. açı olarak yüzde adım döngüsü ve yarıçapı ( "PolarPlot (Teta, Rho)") olarak floresan ile kutupsal koordinat çizimleri yapmak için 'PolarPlot' komutunu kullanın.

Sonuçlar

Bu makalede, agaroz kanalları kullanarak Drosophila larva davranış rehberlik ve bir tarama döngüsü boyunca larva yapıların dinamiklerini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Doğrusal kanallarda Larvalar ritmik tarama (Şekil 3) sürekli nöbetleri gerçekleştirin. larva ve kanallar hem de optik açıdan berrak olduğu için, kanalların larva çıkar yapıda ifade floresan probları ifade ile birlikte kullanılabilir. Biz (elav-Gal4 / +; UAS MYR-GFP / +) her nöronlarda ...

Tartışma

Bir mikroakışkan cihaz Drosophila larvaları ağırlayacak doğrusal agaroz kanalları (Şekil 1) yapmak için inşa edilmiştir. Drosophila larvaları, bu lineer agaroz kanallarda yerleştirildiğinde davranışsal repertuarı tarama döngüsü boyunca larva yapıların dinamikleri ayrıntılı gözlem için izin veren, tarama ile sınırlıdır.

Bir larva (Şekil 3) ritmik adımlar bir dizi gerçekleştirdiğinizde Başarılı bir kayıt oluşur. Bu oluşmazsa, kanalda bir hava...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 oz kare Drosophila şişesi	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sükroz	sigma	S9378
elma suyu			konsantreden değil
Tegosept	Fisher	T2300	metil-p-hidroksibenzoat
35 x 10 mm yuvarlak petri kabı	Fisher	351008
ekmek mayası
PDMS döküm kalıbı	FlowJem		yazarlardan talep edilebilir
İzopropil alkol	Fisher	A417-1
laboratuvar mendilleri	Fisher	06-666-11
konserve hava	Fisher	18-431
10 cm petri kabı	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
tıraş bıçağı	Fisher	12-640
forseps	FST	11241-40
22 x 40 kapak camı, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (sürüm 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Matematik İşleri		www.mathworks.com