Method Article

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

DOI:

10.3791/54897

⸱

December 14th, 2016

 ,  , 
1Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, bir açıklar görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-nötralizasyon (MN) testi, influenza virüsünün enfektivitesini ve virüs replikasyonunun inhibisyonunu ölçmek için standart bir tekniktir. Bu çalışmada, virüsler arasındaki gerçek antijenik ilişkileri ölçmek için görüntüleme tabanlı bir MN testinin protokolünü sunuyoruz. Görünür plaklara dayanan tipik plak azaltma testlerinin aksine, bu test her bir oyuğun tüm enfekte hücre popülasyonunu nicelleştirir. Protokol, görüntüleme ve görüntü işleme sırasında numune kontrastını artıran maksimum bulaşıcılığı elde etmek için virüs tipini veya alt tipini hücre hatlarının seçimiyle eşleştirir. Kantitatif titrasyonun kullanılmaya başlanması, nötralizasyonun giriş virüslerinin miktarını tanımlar ve farklı deneylerden elde edilen sonuçların karşılaştırılabilir olmasını sağlar. Düz yataklı bir tarayıcı ve ücretsiz indirilebilir yazılımla görüntüleme kurulumu, yaklaşımı yüksek verimli, uygun maliyetli, kullanıcı dostu ve çoğu laboratuvarda kurulumu kolay hale getirir. Çalışmamız, geliştirilmiş MN testinin, A (H3N2) virüslerinin nöraminidaz (NA) içindeki amino asit ikamelerinden önemli ölçüde etkilenmeden, mevcut dolaşımdaki influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalıştığını göstermektedir. Düşük HA titresine kadar büyüyen ve / veya kültürlenmiş hücrelerde plak oluşturamama ile sonuçlanan düşük bir enfeksiyon geçiren virüslerin karakterizasyonu için özellikle yararlıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-nötrleştirme (MN) tahlilleri nötralize edici antikor miktarının belirlenmesi için ve antiviral etkinlikleri viroloji kullanılır. Hemaglutinasyon engellenmesinin bir alternatif olarak (HI) deneyleri, MN deneyleri HI yorumlanması 1,2,3 sonuçları karmaşıklaştırabilir reseptör bağlanma influenza virüsleri içinde afinite değişiklikler, etkilenmiş antijenik olmayan etkileri üstesinden gelebilir. Yakın zamana kadar, en çok MN deneyleri sitopatik etkiler (CPE) veya enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) 4,5 dayandırılmıştır. Odak ve plak azalmasına dayalı MN deneyleri 1990 6,7,8 geliştirilmiştir. Plak redüksiyon deneyleri enfektiviteyi ölçmek için görünür plaket sayma güveniyor. Ancak, görsel sayıları sadece plakların çoğunluğu küçük ve birçok güncel dolaşan virüs görünmez olsa, insan gözü tarafından çözülebilir olan büyük plaklar kapsamaktadır. Bu eksik kapsama i lider, sınav arasında ve deneyler arasında önemli varyasyon neden olabilirncomparable sonuçlanır. Bazı virüsler tek hücre ya da çok küçük plaklar başarısız enfeksiyon gösterdiğinizde yöntemi kullanmak da mümkün değildir.

fakir sayım çözünürlük, bir görüntüleme tabanlı protokol girişi ile geliştirilebilir. Teknoloji, optik mikroskop ve yüksek verimlilik gelişmeler ile iyi plaka okuyucu enfekte hücreleri 9 saymak doğru araç sağlayabilir. trans-aydınlatmalı mikroskobu altında belirli bir belirteç ile etiketlenmiş enfekte olmuş hücreler alt-hücresel çözünürlükte absorpsiyon veya floresan Buna karşılık görüntülenebilir. Bir numune, bir bilgisayar ekranı üzerinde analiz edilebilir.

Ne yazık ki, görüş alanı içinde sınırlama, yüzden fazla kiremitli görüntüleri tek bir kuyu kapağı için gereklidir. 96 çukurlu bir plaka analiz yaklaşık on bin görüntülerin görüntüleme ve işlem gerektirir. Bu zahmetli bir proses zaman alıcı ve pahalıdır ve elde edilen çözünürlük Cinslerviral enfeksiyonların rutin karakterizasyonu için gereksiz l. sınırlı bir bütçe ile laboratuvarlar bir masaüstü tarayıcı etrafında inşa yaklaşım maliyetli, yüksek hacimli bir alternatif sunuyor bulabilirsiniz.

Bu yazıda, virüs büyük bir sayıda antijenik karakterizasyonu için ve nicel olarak, antiviral aktiviteleri ve nötralizasyon antikorları ölçmek için uygun olan bir gelişmiş diştaşı azaltma MN deneyi tarif eder. Deney çeşitli avantajları vardır: ilk olarak, ne olursa olsun, plak boyutu, hücresel seviyede virüs enfeksiyonları ölçebilir bir görüntüleme bazlı deneyidir. iyi içinde toplam enfekte hücre popülasyonu (ICP) Sayma büyük ölçüde mümkün düşük enfeksiyon ile virüsleri karakterize etmek için yapım, algılama hassasiyetini artırır. İkinci olarak, daha kesin bir niceliksel titrasyonu, giriş virüsünün miktarını belirlemek için nötrleştirme öncesi ilave edilir. Kantitatif giriş virüsü anlamlı değişkenden azaltırFarklı deneyler arasındaki laboratuarlarında arasındaki sonuçlar daha karşılaştırılabilir hale getirir. Üçüncüsü, nötralizasyon titreleri, görüntüleri analiz hızlı kantitatif yapma ve kullanıcı dostu doğrudan belirlenebilir. Son olarak, protokol gerekli çözünürlük ve doğruluk ile düşük maliyetli ve yüksek verimli bir alternatif sunuyor. kantitatif bir flatbed tarayıcıya ve ücretsiz veri işleme yazılımı dayanmaktadır. Tüm kurulum küçük bir ayak izi vardır ve çoğu laboratuvarlarda konuşlandırılabilir.

Bu çalışmada sunulan protokol virüs titrasyon, titrasyon kantitatif, virüs nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört ana adımlardan oluşur. Virüs titrasyonu girişi virüs miktarı nötrleştirme kullanılacak belirleyen bir preparat denemedir. Bir titrasyon sırasında viral konsantrasyonları bir dizi 96 oyuklu bir plaka içerisinde, hücre mono tabakaları uygulanır. Enfekte hücreler daha sonra bölüm 2. Viral Dilu olarak nicelendirilir% 20-% 85 üretir tion ICP da karşılık gelen nötralizasyon giriş virüs olarak uygulanır bölüm 3. nötralizasyon protokolü titreleri bölüm yukarıdaki protokoller Temsilcisi Sonuçlar sunulmuştur ardından 4. Deneyleri kullanılarak ölçülür. Tahlil gibi A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri gibi güncel dolaşan influenza virüsleri, çoğu ile son iki yılda iyice test edilmiştir. İnfluenza virüsü karakterizasyonu sonuçları 2016 yılında Güney Yarımküre ve 2016-2017 yılında Kuzey Yarımküre'de kullanılmak üzere influenza aşılarının önerileri verdi DSÖ istişare toplantısı için raporlara dahil edilmiştir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Aşağıdaki protokol için biyogüvenlik düzeyi (BSL) potansiyel pandemik influenza virüs mevsimsel grip virüsleri ve BSL 3+ BSL 2 'dir. Viral titrasyon, kontrol (VC) viral konsantrasyona karar vermek için bir nötralizasyon deneyi önceden gereklidir.

1. Virüs titrasyonu

NOT: (1) viral seyreltme satırların veya sütunların (Şekil 1) ya birlikte düzenlenebilir: virüslerin sayısı ve çiftleri sayısına bağlı olarak, bir kuyu plaka aşağıdaki esneklikleri ile kurulabilir. Her virüs ayrı bir satır / sütun işgal etmelidir. (2) viral seyreltme artış esnektir, ancak sol üst köşedeki en yüksek viral konsantrasyona ile başlamalıdır. (3) çiftleri sayısında herhangi bir sınırlama yoktur.

NOT: Madin Darby köpek böbrek (MDCK) ve MDCK-SIAT1 (SIAT) hücreleri nazikçe M. Matrosovich, Marburg, Ger tarafından sağlanmıştır10 çok. SIAT hücreleri kararlı bir şekilde insan CMP-N-acetylneuraminate ile transfekte MDCK hücreleri: sialik asit (SA) geliştirilmiş ekspresyon için olan B-galaktosid α-2,6-sialil-transferazı geni α2-6Gal terminasyonlu oligosakaritler.

  1. Kısım yeterli MDCK hücreleri veya MDCK SIAT hücreler 8 96 oyuklu plakalara (200 | al / ul). Izdiham ulaşmak için 2 ya da 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri. % 10 ısıyla inaktive edilmiş cenin dana serumu (FCS) ve antibiyotik (100 U / ml penisilin ve / ml streptomisin, 100 ug) ile desteklenmiş DMEM içerisinde hücrelerin yayar. % 5 CO2 ve 1 mg / ml G418 sülfat ile 37 ° C 'de SIAT hücreleri inkübe edin.
    NOT: seyreltme faktörü deneyim ve kullanılan hücre hattı bağlıdır. Hücre tek tabaka birleştirilebilmeli gerekir (yani, hiçbir hücre duvarı ya da MDCK hücreleri ve MDCK-SIAT1 hücreleri için sıkıca paketlenmiş düzeni görebilir anahat) virüs aşılama sırasında. dilüsyonları örnekleri dayalıMDCK veya MDCK SIAT1 hücrelerinin konfluent şişe alt kültür Tablo 1 'de verilmiştir.
  2. oyuk başına virüs büyüme ortamında (BYM) 200 ul hücreleri 3 kez yıkayın. 30 dakika boyunca% 70 EtOH ile çok katlı levha yıkayıcı sterilize ve yıkamadan önce steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ya da VGM durulayınız.
  3. VGM aspire ve hemen her kuyuya VGM 50 ul ekleyin.
  4. (Test virüs ve çiftleri sayısına bağlı olarak, ya da daha az) 6 steril tüplere her birine VGM 900 ul ekleyin. Her bir seyreltme ile uçlarının değiştirilmesi, seyreltik seri birinci tüp içine virüsün 100 ul pipet karıştırın ve. her bir virüs için tekrar titre edilmesi.
    NOT: Bu 10 -6 10 -1 virüs dilüsyonları verecektir.
  5. En yüksek dilüsyon başlayarak her bir virüs, seyreltme 50 ul ekle 9 çoğaltılmış oyuklara (Şekil 1 'de Sütun 9 ve 10) ile (Şekil 1' de 1 x 10 -5),6-çukurlu plaka.
  6. Virüs hücreleri enfekte izin 2-3 saat boyunca 37 ° C'de plaka koyun.
    NOT: 2 ila 3 saat inkübasyon inokulum virüsler tek tabaka ulaşmak için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak için gereklidir.
  7. kaplamayı hazırlayın (10 ml / plaka)
    NOT: Kaplama 2x DMEM, Tripsin (2 ug / ml nihai konsantrasyon), 20, 1 mg / ml stok ul, ve selüloz, pamuk linterleri, 5 ml (Malzeme Listesi bakınız), 5 ml oluşur.
  8. inokulum çıkarın.
  9. bindirme (her bir kuyunun 200 ul) ekleyin. Bozulmamış, 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
    NOT: Virüs tomurcuklanan sonra yaklaşık 4 saat gerçekleşir, bu nedenle plaka bu saatten sonra rahatsız değil önemlidir.
  10. Kuyulardan kaplamayı aspire.
  11. PBS A buz soğukluğunda% 4 paraformaldehid ekleyin (200 ul / oyuk). 30 dakika ya da 20 dakika süre ile, oda sıcaklığında, 4 ° C'de yerleştirin.
    Not: PBS 10 hareket doğal pH fosfat tamponlu serum fizyolojikF NaCl, KCl 0.25 g, Na 2 HPO 4 1.437 gr KH 2 PO 4 0.25 g, ve distile su 1 L (Malzeme listesine bakınız).
    NOT: Solunduğunda ve yutulduğunda yanıklara neden olabilir zaman Paraformaldehyde zararlıdır. Orada Kanserojen etki sınırlı kanıt da, ve cilt temasından sonra hassasiyete neden olabilir.
  12. paraformaldehit aspire ve PBS A ile iki kez plakaları yıkaması (200 ul / oyuk).
  13. ileride kullanım için 4 ° C'de, PBS A plakaları mağaza ya da aşağıdaki adımlarla devam et.
  14. permeabilizasyon tamponu ekleyin (100 ul / oyuk). 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
  15. PBS A ile iki kez plaka yıkaması (200 ul / oyuk).
  16. oyuk başına: (ELISA tamponu 1.000 1) birinci antikor, 50 ul, influenza A karşı fare mAb ekleyin. çalkalanarak 1 saat (ya da 4 ° C sıcaklıkta gece), oda sıcaklığında inkübe edin.
  17. Yıkama tamponu (% 0.05 Tween 80, PBS, A, hacim / hacim olarak) p 100 ul 3 kez yıkayıniyi er. Yıkamalar arasında 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, kuyu başına 300 ul kullanarak inkübasyon olmadan o 3 kere yıkayın.
  18. ikinci antikor, 50 ul ekle • Keçi anti-fare IgG (H + L) HRP konjügatı (1: ELISA tamponu 1000) ile sabitleştirilir. çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  19. Adım 1.17 açıklandığı gibi o 3 kere yıkayın.
  20. alt-tabakanın (50 ul / oyuk) ilave edin. 30 dakika süre ile ya da mavi bir renk gelişimi görülene kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
  21. Yıkamalar arasında 2 -3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, reaksiyonu durdurmak oyuk başına damıtılmış su, 200 ul iki kez plakayı yıkayın için.
  22. Plaka Hava kurutun ve karanlık bir yerde (örneğin, alüminyum folyoya sarın) saklayın.

2. Titrasyon miktar tayini

  1. Şekil 2a'da gösterildiği gibi, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanında iyi olarak plaka koyun. L-şekil pozisyon limiti kullanoptimum ve tekrarlanabilir görüntüleme konumunu sağlamak.
    Not: Bu, bir tarama görüntü iki gözlü plakalara mümkündür.
  2. bir görüntüyü taramak.
    NOT: Ayarlar Tablo 2'de gösterilmiştir.
  3. Gerekli virüs konsantrasyonu (Şekil 3) hesaplamak için "well plate Reader" yazılımını çalıştırın.
    1. Bir resim yüklemek için "Load görüntü" butonuna tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için "Küresel Eşik" sekmesinin histogram kırmızı çubuk kaydırın. görüntü üzerindeki etkisini incelemek için "Güncelle" düğmesine tıklayın.
    2. "Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon" kutusunu işaretleyin. ICP ölçmek için "Örnekleme" düğmesine tıklayın. istendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
      NOT: "Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon" kutusu işaretli ise örnekleme sürecinin ardından, "Nötralizasyon & Titrasyon Hesaplama" olarak adlandırılan yeni bir pencere otomatik olarak belirir.
    3. Yük veya giriş iyi plaka tanımlama haritası. ": Optimal Virüs Nüfus (%) Titrasyon" in eşiğine (örneğin,% 30) belirtiniz. titrasyon sonuçları hesaplamak için "Titrasyon Süreci" sekmesini seçin. titrasyon sonuçlarını kontrol edin. titrasyon sonuçlarını kaydetmek için "Kaydet & Kapat" düğmesine tıklayın.
      NOT: Yazılımın ilgili daha ayrıntılı talimatlar için Ek S1 bakın. ısmarlama yazılımının bir kopyası istek üzerine mevcuttur.
      NOT: Genellikle, her bir kuyunun 11 içinde% 50 (20-85%) toplam hücre ICP etrafında plak azaltma tahlil getirileri için en iyi virüs seyreltme.

3. Virüs Nötralizasyon

Not: nötralizasyon tayini için gereken levha sayısını hesaplayın. Her plaka bir virüs ve antiserumlar bir dizi barındırabilir.

Not: antiserumlar sayısı ve çiftleri sayısına bağlı olarak, bir yuvalı plaka th ayarlanabilirE, aşağıdaki esneklikleri: (1) serum seyreltisi, ya arka arkaya ya da bir sütun (Şekil 4) boyunca ayarlanabilmektedir. Her serum ayrı bir satır veya sütun işgal gerekir. (2) serum seyreltme artış esnektir, ama bir plakanın sol üst köşesinde en yüksek serum konsantrasyonu ile başlamalıdır. (3) çiftleri sayısı antiserumlar sayısını dengeler. Daha çiftleri deneysel varyasyonları düzeltmek için yardımcı olabilir. (4) VC sayısı ve hücre kontrolü (CC) çoğaltır esnek, ama onlar da ayrı satır veya sütun olmalıdır sayısı. VC çiftleri sayısının antiserumlar önemli ölçüde daha yüksek olduğunu tahmin edilmektedir.

  1. önceden 1.1-1.3, 2 ya da 3 gün adım olarak, hücre tekli tabakası hazırlayın.
  2. plakanın her oyuğuna VGM 50 ul ekle.
  3. sırasıyla, VC ve CC Sütunlar 11 ve 12 kullanın. Colum ilk satırında (A) ila 1:20 reseptör imha edici enzim (RDE) ile tedavi edilen, serum 50 ul alikotları eklemens 1-10.
    Not: her bir virüs, ve serum kombinasyonu için, deney iki kopya halinde gerçekleştirilir, bu nedenle bir levha, örneğin, bir virüs, beş antisera karşı test içerebilir.
  4. Satır H. 50 ul (Şekil 4'te Sütunlar 1-10) H Satır Satır A 50 ul aktarılması ve atarak seri seyreltiler 2 kat gerçekleştirin
  5. CC kolonu (Şekil 4'te Sütun 12) her bir kuyu için seyreltici 50 ul ekle.
  6. CC sütun hariç plakanın her oyuğuna virüsün 50 ul ekle (sütun 1-11, Şekil 4'te satır H.).
  7. 2-3 saat boyunca 37 ° C 'de inkübe edin. inokulum çıkarın. her kuyuya kaplamayı (200 ul) ekleyin. Bozulmamış, 37 ° C'de gece boyunca inkübe. Fix ve virüs titrasyon (1.11-1.22 adımlar) gibi plakaları leke.

4. Nötralizasyon Niceleme

  1. Figu gösterildiği gibi, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanında iyi olarak plakasını2a yeniden. optimum ve tekrarlanabilir görüntüleme konumunu sağlamak için L-şekil pozisyon limiti kullanın.
    Not: Bu, bir tarama görüntü iki gözlü plakalara mümkündür.
  2. aşama 2.2 'de tarif edildiği gibi, levha tarama.
  3. Gerekli viral titreleri (Şekil 3, adım 2.3) hesaplamak için "well plate Reader" yazılımını çalıştırın.
    1. Bir resim yüklemek için "Load görüntü" butonuna tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için "Küresel Eşik" kırmızı çubuğu kaydırın. etkisini incelemek için "Güncelle" düğmesine tıklayın.
    2. "Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon" kutusunu işaretleyin. ICP ölçmek için "Örnekleme" düğmesine tıklayın. istendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
      NOT: "Hesapla Nötralizasyon / Titrasyon" kutusu işaretli ise örnekleme sürecinin ardından, "Nötralizasyon & Titrasyon Hesaplama" olarak adlandırılan yeni bir pencere otomatik olarak belirir.
    3. İyi p yükü veya girişGeç haritası. Barajı (örneğin,% 50) işaret eder "Nötralizasyon. Enfeksiyon azaltılmıştır (%)"
    4. titreleri hesaplamak için "Nötralizasyon Süreci" seçeneğini seçin. titreleri kontrol edin ve nötralizasyon sonuçlarını kaydetmek için "Kaydet & Kapat" düğmesine tıklayın.
      Not: Nötralizasyon VC karşı önceden belirlenmiş bir ICP azalma (örneğin,% 50 ya da% 80 gibi) (Şekil 4'te Sütun 11 ortalaması) ile en yüksek serum seyreltisi karşılığı olarak rapor edilir. % 50 ICP azalma Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki prosedürlerin ardından, son antijenik karakterizasyon deneyleri bazı sonuçlarını sunmak. titrasyon kurulumu her seyreltme için çift çiftleri ile, sekiz giriş virüsleri incelemek için tasarlanmıştır. Viral seyreltileri virüsler arasında varyasyonlar kapsayacak -6 1.0 x -1 10 x 1.0 ila 1.0 test edilmiştir. Test virüsleri A / Kamerun / 15V-3538/2015 dahil olmak üzere H3N2 alt tipi, olduğumuzu A / Vladivostok / / 2015 36 A / Moskova / A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskova / 101/2015 103 / 2015, A / Moskova / / 2015 100 A / Moskova / / 2015 133 ve A / Bratislava / 437/2015. Titrasyon sonuçları Şekil 5'te gösterilmiştir. Şekil 5d, virüs seyreltme artarak KİPler azalmasını göstermektedir. Eğrileri bir kuyunun 12 dahilindeki tüm hücrelerde enfeksiyonları vermiştir aynı virüslerin KİPler karşı normalize edildi (ICP doygunluk olarak tanımlanır). ICP hi ile doygunluk ulaşmak olmadıysale en yüksek virüs yoğunluğu, ilgili kopyalardan ICP ortalama yerine kullanılmıştır (A / Moskova / / 2015 103 Şekil 5d). ICP doygunluk% 30 üretilen virüs seyreltmeleri nötralizasyon (Tablo 3), giriş virüsünün seyreltme seçilmiştir.

Nötralizasyon her tabakta çift çiftleri ile beş antiserumlar karşı bir giriş virüs amaçlanmıştır. gösterilen referans virüsü H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Beş antiserumlar olan A / HK 4801/14 Yumurta F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Güney Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / İsviçre 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, ve A / Hollandalı 525/14 SIAT F23 / 15. Nötralizasyon sonuçları Şekil 6'da gösterilmiştir. Şekil 6d serum seyreltme artması ile enfeksiyon ilerlemesini gösterir. Dikey eksende normalize pozitif nüfus ortalama ICP karşı gelen antiserumlar yanıtı KİPler oranını temsilReferans virüsünün 12. enfekte olmamış hücre kontrolleri arka plan ICP normalleşme sırasında çıkarıldı. Nötralizasyon titreleri% 50 ICP azalma (Tablo 4) karşılık gelen antiserumu seyreltileri reciprocals olarak belirlenmiştir. Doğrusal interpolasyon iki komşu serum dilüsyon arasında düşen titreleri tahmin etmek için kullanılmıştır.

figure-results-1
Şekil 1: Bir virüs titrasyonu deneyde iyi bir plaka ortamında örneği. Test virüsleri ayrı satır (H A) atanır. Kolonlar, farklı viral seyreltilerde (12 1) için tasarlanmıştır. Iki sütun, her viral seyreltme için kopya olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 2: Örnek tarama sisteminin Şemalar. (A) düz yataklı tarayıcı görüntüleme konumunda bir 96 oyuklu plaka (arasında basılmıştır Elsevier BV kuruluşunun izni) ile 11 referans, ve (b) 'de gösterilen L-şekil pozisyon limiti boyutları (a). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3: "well plate Reader" kantitatif yazılımı Masaüstü diyagramı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4: bir nötrleştirme deneyde iyi bir plaka ortamında örneği. Her bir serumdan çiftleri (10 1) ile iki sütun atanır. Sıralar farklı serum seyreltmeleri (H'ye kadar) için tasarlanmıştır. virüs kontrolü sekiz çiftleri (H11 için A11) ile, Sütun 11 alır. hücre kontrolü sekiz çiftleri (H12 A12) ile, Sütun 12 olduğunu. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 5: bir titrasyon deneyinin sonuçları. (A) iyi plaka kurulum, (b) iyi plaka Taranan görüntüyü, (c) çizimRenk kodlu, niceliksel, virüs ile enfekte olmuş hücre popülasyonu ve virüs seyreltmeleri karşı (d) normalize virüs ile enfekte olmuş hücre popülasyonlarının. % 30 ICP eşik değeri olarak kullanılmıştır. (D) hata çubukları örnek duplications (± 1 SD) standart sapmalar (SD) vardır. (B) ve (c) 'de Ölçek çubukları 10 mm =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 6: Bir nötralizasyon deneyi sonuçları. (A) Her bir plaka ortamında, (b) de plaka görüntü hesaplanır, virüs ile enfekte olmuş bir hücre popülasyonu (C) Çizim ve serum seyreltme karşı (d) normalize virüsü ile enfekte olmuş hücre popülasyonu taranır. giriş virus (VC) A / Stockholm / 63/2015. % 50 ICP titrelerini hesaplamak için kullanıldı. (D) hata çubukları örnek duplications (± 1 SD) standart sapmalar (SD) vardır. (B) ve (c) 'de Ölçek çubukları 10 mm =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek S1: Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Tipik seyreltme
MDCK hücreleri MDCK hücreleri, SIAT1
2 gün 1: 5 (1 + 4) 1:10 oranında (1 + 9)
3 gün 1:20 (1 + 19)
Ml başına hücre sayısı tipik
MDCK hücreleri MDCK hücreleri, SIAT1
2 gün 2 x 10 5 1 x 10 5
3 gün 1 x 10 5 5 x 10 4
1:10 oranında (1 + 9)

Tablo 1: MDCK veya MDCK-SIAT1 hücrelerinin Birleşik kaplardan bir altkültür üzerinde tipik dilüsyonları.

kip profesyonel Mod
Belge Türü Film (Film Alan Rehberi)
Otomatik Poz Türü Fotoğraf
Benyaş Tipi 24-bit Renkli
çözüm 1200 dpi
Kaydedilen görüntü Biçimi TIFF

Tablo 2: bir masaüstü tarayıcı Tipik kurulum.

sıra Virüs Tavsiye edilen seyreltme
bir A / Cameron / 15V-3538/2016 1.0 x 10 -2
B A / Vladivostok / 36/2015 1.0 x 10 -3
C A / Moskova / 103/2015 1.1 x 10 -1
D A / Tomsk / 5/2015 5.9 x 10 -1
E A / Moskova / 101/2015 8.3 x 10 -1
F A / Moskova / 100/2015 1.4 x 10 -2
G A / Moskova / 133/2015 1.3 x 10 -2
H A / Bratislava / 437/2015 1.3 x 10 -4

Tablo 3:% 30 ICP nüfusu hesaplanan Viral dilüsyonlar.

sütun antiserumlar Önerilen titre
1-2 A / HK4801 / 2014 110
3-4 A / HK7295 / 2014 213,3
A / Güney Afrika / R2665 / 2015 2155,8
7 - 8 A / İsviçre / 9715293/2013 89.4
9 - 10 A / Hollanda / 525/2014 78.6

Tablo 4: A / Stockholm% 50 ICP / antiserumlar karşı 63/2015 titreleri.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, biz virüsler arasındaki gerçek antijenik ilişkileri ölçmek için bir görüntüleme bazlı MN deneyi nitelendirdi. diğer plak azaltma deneyleri ile karşılaştırıldığında, yöntem enfektif nüfusun tam kapsama sağlanması tüm kuyunun ICP ölçüm vurgulayan. plak oluşumunun bağımsızlığı da çoğunlukla görünmez küçük plaklar oluşturabilir ya da sadece tek hücreli enfeksiyonu yönetebilir virüslere karşı testinin uygulanmasını genişletmektedir. Bu nedenle, tahlil daha fazla virüs ve HI daha antikorların daha geniş etkilerini inceleyen yeteneğine sahiptir ve daha kapsamlı antijenik benzerlik ya da virüsler 12 arasındaki farklılıkları yansıtmak için yardımcı olur. Örneğin, oseltamivir karboksilat dahil edildiğinde, MN tahlil az daha doğru antijenik farklılıkları yansıtan, bağlayıcı NA-bağımlı etkilenir. Testin geliştirilmesi sırasında, büyük çabalar deney tutarlılık, hız ve algılama geliştirmek için yapılmıştırduyarlılık, bir masaüstü tarayıcı ile yüksek verimlilik olarak quantitated titrasyon, görüntüleme yoluyla giriş virüsleri kontrol ederek de dahil olmak üzere, ve kullanıcı dostu bir veri işleme platformu uygulanması. Sonuçlar genellikle ile tutarlı ve HI olanlar doğruladı. Özellikle, sonuçlar aynı zamanda belirli A (H1N1) pdm09 virüslerin HA1 içinde G155E ikamesi olarak kültür-seçilmiş veya sporadik değişikliklerin neden olduğu son tip A ve B aşı virüslerinin antijenik sürüklenme varyantları arasında antijenik farklılıklar yanı sıra antijenik değişiklikler, ortaya 12.

protokol büyük ölçüde görüntüleme sinyali gelişmiş güçlü enfeksiyon verdi hücre hatları seçimi ile virüs türü veya alt türü eşleşti. Deneysel varyasyon test antiserumlar sayısı ile dengeli çiftleri tasarımı ile düzeltti. Belirsizlikler de ağırlıklı görüntüleme cihazı etkilenir görüntü kalitesi, gelebilir. İyi bir renk flatbed tarayıcı signi olabilirficantly görüntü kontrastı artırmak ve gürültüyü azaltmak. virüsler hala benzer bir durumunu korumak ise nötralizasyon giriş virüs miktarı kantitatif ilgili titrasyon peşin tespit edilmelidir. Nötralizasyon sırasında bir enfeksiyona antiserum yanıt referans virüsü (VC) ve arka plan seviyesinin (CC) arasındaki farkın karşı normalize. VC ve CC hassas ölçümler bir nötralizasyon deneyinde için gereklidir. Daha çiftleri (sekiz çiftleri Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır) tavsiye edilir. Son olarak, yazılım anlamak bir denemenin başarısı için hayati önem taşımaktadır. Yazılım iki yıldan fazla DSÖ İnfluenza Merkezi, İngiltere'de rutin virüs karakterizasyonu için test edilmiştir. Çeşitli durumlarla başa çıkmak için ayrıntılı talimatlar Ek S1 sağlanır.

Bu MN deney örnekleri bir dahili kapak uygulamalar için uygundurremely büyük görüş alanı ama sadece orta görüntüleme çözünürlüğü gerektirir. düşük maliyetli ve basit kurulum en viroloji laboratuvarlarında sistem hazır olun. Aynı numunenin ölçümleri varyasyon yaklaşık tarama sırasında 11 kişiye belirsizliği tanımlayan en az% 3 olmuştur. Bu tekrarlanabilirlik birçok viral çalışmalarında yeterli olduğu ve daha çok taramaları görüntü ortalama azaltılabilir.

Sonuç olarak, bu çalışma rutin antijenik çalışmada kullanılabilir ve özellikle, insan influenza aşıları dahil virüslerin iki yılda bir seçimi için, influenza virüs şu anda dolaşan detaylı analizler HI verileri desteklemek için sağlam bir MN deneyi gösterir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, ana MDCK ve MDCK-SIAT1 hücre hatlarını sağladığı için Dr. M. Matrosovich'e ve oseltamivir karboksilatı sağladığı için Roche Pharmaceuticals'a teşekkür eder. Ayrıca Dr. Anne Weston'a el yazması hakkındaki değerli önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, DSÖ Ulusal Grip Merkezleri ve kullanılan influenza virüslerini sağlayan DSÖ GISRS içindeki DSÖ CC'lerinin değerli işbirliğine dayanıyordu. Bu çalışma, Program U117512723 aracılığıyla Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VGMSigmaD6429, P0781500 ml DMEM+5 ml Kalem/Strepb
PBS ADoğa pH Fosfat tamponlu salin: NaCl 10  g, KCl 0.25  g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g ve Dist. Su 1 L.
AvicellFMCRC-581F100 ml damıtılmış su içinde 2,4 g, manyetik bir karıştırıcı üzerinde 1 saat boyunca çalkalanarak çözülür. Otoklavlama ile sterilize edin.
2x DMEMGibco 21935-028
TripsinSigmaT1426
Kaplama (10 ml / plaka):5 ml 2x DMEM, Tripsin 2  μ g/ml nihai konsantrasyon, Avicell 5  ml
Triton X- 100eSigma T8787Geçirgenlik tamponu: PBS A'da %0,2 (v/v)
Tween 80SigmaP5188Yıkama Tamponu:% 0,05 PBS A'da Tween 80 (h/h)
At serumuPAA Labs LtdB15-021ELISA Tamponu: PBS A'da %10 (h/v) + influenza tip A'ya karşı %0,1 Tween 80
Fare MAb'siBioradMCA 4001st Antikor: 1: 1.000 ELISA Tampon Keçi
anti-fare IgG (H + L) HRP konjugeBiorad172-10112 < > nd< / sup> Antikor: 1: 1.000 ELISA Tampon
True Blu peroksidaz substratıKPL ve nbsp;50-78-02Yüzey: Gerçek mavi +% 0.03 H2< / sub>O2< / sub>g< / sup> (1: 1,000% 30 çözelti)
96 kuyulu düz tabanlı mikrotitre plakalarıCostar 3596
8 kanallı çok duvarlı plaka yıkayıcı ve manifoldSigmaM2656
Perfection Plaka TarayıcıEpsonV750 ProGörüntüleme yazılımı http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=İndirmeler.
Yazılım çalışma ortamı: LabVIEWNational Instruments CorporationNI Vision oluşturucu tabanlı pencereSürüm: LabVIEW2012 veya üzeri

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
  2. Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
  3. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  4. Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
  5. Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
  6. Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
  7. Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
  8. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
  9. Comley, J. High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
  12. Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro neutralization AssayInfluenza VirusVirus TitrationAntibody NeutralizationAntiviral ActivityFlatbed Scanner ImagingHigh throughput ImagingViral Antigenic StudiesVirus DilutionInfected Cell Population

Related Articles