Yöntem makalesi

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile In Situ Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

DOI:

10.3791/54899

⸱

10 Aralık 2016

 , 
1Lund University Diabetes Centre, Lund University, 2INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon, Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri ile ilişkili membranlar (MAM) olarak bilinen alanlardaki endoplazmik retiküler (ER) ve mitokondriyal membranlar arasındaki yapısal etkileşimler, hücresel sinyalleşme ve hücre kaderi için çok önemli merkezlerdir. Özellikle, bu organeller arası temas bölgeleri, kalsiyumun voltaja bağlı anyon kanalı (VDAC)/glikoz regüle protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP3R) kalsiyum kanal kompleksi yoluyla ER'den mitokondriye transferine izin verir. Bu hücre altı bölme hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda yoğun bir şekilde araştırılırken, hücrelerdeki endojen ER-mitokondri teması miktarını ölçmek için basit ve hassas bir yöntem yoktur. Benzer şekilde, MAM'lar oldukça dinamik yapılardır ve protein aşırı ekspresyonu olmadan ER-mitokondri etkileşimlerinin modifikasyonlarını takip etmek için uygun bir yaklaşım yoktur. Burada, dış mitokondriyal membranın (VDAC1) ve ER membranının (IP3R1) proteinleri arasındaki yakınlığı kullanarak sabit hücrelerdeki endojen ER-mitokondri etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmek için yerinde yakınlık ligasyon testinin kullanımına dayanan optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Benzer in situ yakınlık ligasyon deneyleri, GRP75 / IP3R1 ve siklofilin D / IP3R1 antikor çiftleri ile de gerçekleştirilebilir. Bu test, son derece spesifik, hassas ve çoklu koşul testlerine uygun olduğu için diğer görüntüleme prosedürlerine göre çeşitli avantajlar sağlar. Bu nedenle, bu in situ yakınlık ligasyon testinin kullanılması, ER-mitokondri etkileşimlerinin fizyolojik düzenlemelerinin yanı sıra patolojik bağlamlardaki rollerini daha iyi anlamak için yardımcı olmalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (ER) hücrede bağımsız organelleri olmayan, ancak mitokondri ilişkili endoplazmik retikulum zarlarının (MAM) olarak tanımlanan temas bölgelerinde yapısal ve fonksiyonel etkileşim. Aslında, MAM her iki taraftan da proteinler arasındaki etkileşimi sağlayan ER membranlar ve mitokondri yakın kapatılan bölgelere karşılık gelir. Bununla birlikte, bu organellerin membranlar bu bölgeler içinde kaynaştırmak yok, bu yüzden onların ayrı varlıklar korumak. MAM Enerji metabolizması ve hücre yaşamını 1-3 etkileyen, mitokondri ER bir kalsiyum açısından önemli bir rol (Ca 2+) ve fosfolipid transferi oynarlar.

ER ve mitokondri arasındaki ilişki ilk elektron mikroskobu ile 1970'lerde görüntülendi. O zamandan beri, transmisyon elektron mikroskobu 4,5, elektron tomografi 6,7 veya ER ve mitokondri özgü fluorofor immün lokalizasyonus / floresan proteinleri 8 klasik ER-mitokondri etkileşimleri çalışmak için kullanılmıştır. MAM analizi için yararlı bir araç içi fraksiyonasyon kullanımına dayanır. Bir Percoll degrade 9 bağlanmış diferansiyel Ultrasantrifügasyon tarafından MAM fraksiyonların izolasyonu sağlar. Bununla birlikte, nihai ürün zenginleştirilmiş MAM fraksiyonlar yerine, saf kesimlerin içerir. Toplamda, bu stratejiler özellikle hassas ve / veya kantitatif değildir ve onlar büyük tarama kolayca uygun değildir. Alternatif olarak ilaç indüklenebilir floresan arası organel bağlayıcılar kullanılarak genetik yaklaşımlar ortaya çıkmıştır, ancak protein 10 'nın endojen ekspresyonunun seviyelerinde organel etkileşimlerin analizine izin vermez.

MAM 11'de IP3R / GRP75 / SSVD kompleksinin Szabadkai keşfinden dayanarak, ER-mitokondri etkileşimleri analiz etmek için kantitatif bir yöntem geliştirdi. In situ yakınlığı ligati kullanılantahlil üzerinde algılamak ve VDAC1 ve IP3R1 arasındaki etkileşimleri ölçmek için, sabit hücrelerde 12 MAM arayüzünde Ca 2 + -channeling kompleksi yer alan iki organel-yüzey proteinleri. Kısaca, bizler, ER membran dış mitokondriyal zarın (fare anti-VDAC1 birincil antikor) ve IP3R1 (tavşan anti-IP3R1 birincil antikor) (Şekil 1, bir panel) de VDAC1 incelenir. Daha sonra, deney göre, anti-fare ve tamamlayıcı oligonükleotid uzantıları konjuge edilmiş anti-tavşan IgG (fare ve tavşan proksimite ligasyonu deney Probes), her iki ilave edildi. İki hedef proteinler 40 nm'nin altında bir mesafede ise, oligonükleotidler dairesel DNA şablonu (Şekil 1 Panel B) oluşmasına izin vermek için daha sonra ilave bağlayıcı oligo ile hibridize olabilir. Bu dairesel bir DNA molekülü kovalent yakınlığı probları birine bağlanmış bir tek-şeritli DNA ürününü oluşturmak, lige edilmiş ve amplifiye edilir (Şekil 1, Panel C) 6, proksimite ligasyonu ve amplifikasyon bağlı Texas kırmızısı etiketli oligonükleotid sondalar (Şekil 1, Panel D hibridizasyonu sonraki tespiti yol yapılabilir 25-10 nm arasında değerler ). Her floresan nokta böylece tek tek hücrelerin in situ ER-mitokondri etkileşimleri sayılmasına olanak tanıyan, VDAC1 / IP3R1 arasındaki etkileşimleri temsil eder.

figure-introduction-1
Şekil 1: Yerinde Proximity ligasyon Tahlili tarafından Endoplazmik Retikulum-mitokondri Etkileşimleri Algılama şematik İllüstrasyon. a) VDAC1 ve MAM arayüzü yakın kendi epitopuna bağlanabilir IP3R1 karşı bir tavşan primer antikora karşı yönlendirilmiş bir fare primer antikor, B) proksimite ligasyonu probları bir çift ilavesifare ve tavşan IgG karşı. Bu sondalar bağlayıcı oligo ligasyonu için şablonlar oluşturabilirler DNA ipliklerini eklenmiş. c) bağlanmasından sonra oluşturulan dairesel DNA zinciri Texas kırmızısı etiketli oligonükleotidler kullanılarak bir flüoresan nokta olarak mikroskopi ile görünür) yükseltilir ve D edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

In situ proksimite ligasyonu deneylerinde benzer antikorların GRP75 / IP3R1 çifti, hem de siklofilin D (CypD) ile yapılabilir / IP3R1 antikorlar CypD MAM arayüzü IP3R / GRP75 / SSVD kompleksi ile etkileştiği gösterilmiştir olduğu dikkate 12-14.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çözümler 1. hazırlanması

  1. PBS 14.5 ml% 37 formaldehit 5.5 mi seyreltilmesiyle PBS (tuz) içinde% 10 formaldehit hazırlayın. PBS, 50 ml glisin 3.8 g çözülmesiyle, 1 M glisin, pH 8.0, hazırlanması; 1x PBS içinde 100 mM glisin elde etmek için bu seyreltilir.
  2. 1x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 hazırlayın. 3.0 M sodyum klorid ve 25 ° C de pH 7.0 ile, iyonu giderilmiş su içinde hazırlanan 0.30 M trisodyum sitrat ile 20x Tuzlu sodyum sitrat (SSC) hazırlayın. 1x bu tampon sulandırmak ve deiyonize su kullanılarak 0.01x.

Hücreler 2. Sabitleme

NOT: Bu çalışmada HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisi kullanılır, ancak bu yöntem diğer yapışık hücre kültürleri için de geçerlidir.

  1. kaplanmamış 35 mm'lik cam alt tabak başına 150.000 hücre (% 10 fetal dana serumu ve% 0.01 penisilin-streptomisin stok ile desteklenmiş DMEM, 1 g / L glikoz kültürlenmiştir) Levha Huh7 hücreleri,. Birincil hücrenin üzerinde çalışırkenKültürler, kolajen kaplı yemekler kullanımı.
  2. Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın. PBS aspire 1 ml hücreleri yıkayın. Formaldehit% 10 1 ml ekleyerek hücreleri saptamak ve ajitasyon altında oda sıcaklığında (RT) 10 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. 1 M glisin, 1 ml reaksiyonu durdurun ve rotasyon karıştırılır. Dur reaksiyon çözüm çıkarın ve 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; rotasyon ve aspirat ile çalkalayın. hücrelere 100 mM glisin 1 ml ilave edilir ve 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire için inkübe.
    NOT: protokol burada durdurulabilir ve aşağıdaki adımlar başka bir güne ertelenebilir. Bu durumda, 100 mM glisin, 1 ml ilave edilir ve gerektiğinde, 4 ° C'de tutun.

3. Hücrelerin Permeabilization

  1. 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire inkübe edin, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 içinde 1 ml ilave edilir. Primer hücre kültür üzerinde çalışırken 20 dakika - Bu inkübasyon süresi 15 kadar arttırılabilires (örneğin, birincil fare hepatositler). 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; aspire.

4. Engelleme

  1. (Kit ile birlikte verilen) her bir örnek için bloke etme çözeltisi 40 ul ekle; Bu hacimli bir numunesi kapsayacak şekilde arttırılabilir. bir nemlilik bölmesi içerisinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca yemekler inkübe edin.
  2. yemekler kapalı engelleme çözümü dokunun. Bu tekrarlanabilirlik etkileyecek gibi, her slayt için eşit kalan miktarlar elde etmek için çalışın. Numuneler kurumasına izin vermeyin!

5. Birincil antikorlar,

  1. 1x PBS birincil antikorlar seyreltin ve yemekler (VDAC1 fare antikoru: 1/100, IP3R1 tavşan antikoru: 1/500) için çözüm ekleyin. Seçenek olarak ise, GRP75 ve CypD antikorlar (1/500 kullanılan her iki fare antikorları) kullanılarak VDAC1 arasında kullanılabilir.
  2. 4 ° C'de bir nem odasında gece boyunca inkübe edin. % 0.01 Tween (TBS-T) ile slaytlar Tris Tamponlu Salin kullanarak iki kez yıkayın.
6. Proximity ligasyon Testi Probları

  1. Yakınlık ligasyon tahlil sondaları kit tarafından sağlanmaktadır. Primer antikor türlere göre problar seçin.
  2. Antikor seyreltici 5: İki yakınlık ligasyon tahlil Sensörler 1 hazırlayın. Karışım, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletin. seyreltilmiş yakınlık ligasyonu tahlil prob çözüm ekleyin. 37 ° C'de 1 saat boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında yemekler inkübe edin. TBS-T ile yemeklere iki kez yıkayın.

7. ligasyonu

  1. In situ saptama reaktif maddesi Texas kırmızısı kiti kullanım.
  2. Yüksek saflıkta su içinde 5 ve iyice karıştırın (kit ile birlikte verilen) 5x bağlama suyu 1 seyreltin. 1:40 ve vorteks (kit tarafından sağlanan) 1x ligasyon çözeltisi içinde ligaz sulandırmak. hemen örneklerin yanı sıra öncesine kadar ligaz eklemek için bekleyin.
  3. önceden ısıtılmış bir nem Cham slaytlar her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) ilave edilir ve kuluçkayaBER, 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı. TBS-T ile slaytlar iki kez yıkayın.

8. Büyütme

NOT: Dikkatli, ışığa duyarlı reaktifler olunuz.

  1. Yüksek saflıkta su içinde 5: (kit ile birlikte verilen) 5x büyütme stok 1 seyreltin. donma blok kullanarak dondurucu polimeraz çıkarın (-20 ° C). (Kit tarafından sağlanan) polimeraz 1x büyütme çözüm ve vorteks içinde 1:80 seyreltilir. karışımı kullanılarak hemen önce polimeraz ekleyin.
  2. Her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) eklenir. 37 ° C'de 100 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında slaytlar inkübe edin. slaytlar kapalı Amplifikasyon-Polimeraz çözümü dokunun.

9. Final Yıkama

  1. 2 dakika için 1 x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. 2 dakika boyunca 0.01x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. Yemekler karanlıkta oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Görüntüleme için 10. Hazırlık

  1. hava kabarcıkları kapak kayma altında yakalanmak sağlanması, (sulu ve katılaşmaya değildir) DAPI içeren montaj orta minimal hacmi kullanılarak slaytlar monte edin. Tırnak cilası kenarları mühür için kullanılabilir. (: 594 nm, emisyon: 624 nm, Büyütme: 63X uyarım) bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak analiz etmeden önce yaklaşık olarak 15 dakika boyunca bekleyin.
  2. görüntüleme sonra karanlıkta -20 ° C'de slaytlar saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü kullanarak bizim deneyime dayalı, biz güvenle sabit hücrelerde ER-mitokondri etkileşimleri görselleştirme ve miktar tayini için bu yöntemi tavsiye ederim. Antikorların çeşitli çiftleri kullanılarak HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisinde in situ proksimite ligasyonu deneyi-görüntülenmiştir ER-mitokondri etkileşimlerine temsili görüntüleri gösterilmektedir. Flüoresans mikroskopisi ile, Şekil 2'de gösterildiği gibi, her bir kırmızı nokta, iki h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toplu olarak, çalışmalarımız, in situ yakınlık ligasyon testinin, organele özgü floroforlar veya floresan proteinler kullanmaya gerek kalmadan, sabit hücrelerde endojen ER-mitokondri etkileşimlerini takip etmek ve ölçmek için gerçekten uygun bir strateji olduğunu göstermektedir. VDAC1/IP3R1 antikorlarının spesifik kullanımı, HuH7 hücrelerinde ER-mitokondri etkileşimlerini incelemek için uyarlanmıştır. Bununla birlikte, hücre tipine bağlı olarak VDAC ve IP3R'nin alternatif izoformları kullanılabilir. Bu durumda, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz optimize etmek ve protokol doğrulamak katkıda laboratuarımızda tüm insanlara teşekkür ederim. Bu çalışma INSERM ve ulusal araştırma kurumu (ANR-09-JCJC-0116 VE ANR-11-BSV1-033-02) tarafından desteklenmiştir. ET yüksek öğrenim ve araştırma Fransız bakanlığından bir araştırma bursu ile onu doktora sırasında desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
FormaldehitSigmaF-8775
GlisinSigmaG-8898
TritonSigmaT8532
35 mm Cam alt kültür kaplarıMatTeK corporationP35G-0-14-C
Engelleme çözümüSigmaDUO-92004 veya DUO-92002, Duolink PLA problarında sağlanır, Sigma
VDAC1 antikoruAbcamab14734
IP3R1-H80 antikoruSanta Cruzsc28614
CypD antikoruAbcamab110324
Grp75 antikoruSanta Cruzsc13967
TBS 10xeuromedexET220elde etmek için seyreltin
0,01
PLA Probları Fare EKSİSigmaDUO-92004Duolink, Sigma
PLA Probları Tavşan ARTISigmaDUO-92002Duolink, Sigma
Duolink algılama reaktifleri kırmızıSigmaDUO-92008Duolink, Sigma
Ligasyon çözümüSigmaDUO-92008Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma
LigaseSigmaDUO-92008Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma
Amplifikasyon çözümüSigmaDUO-92008Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma
PolimerazSigmaDUO-92008Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma
Duolink Montaj OrtamıSigmaDUO80102Duolink, Sigma
Softwares
Blob bulucu yazılımıBlobFinder, floresan mikroskobu görüntülerinden hücreler üzerinde hesaplamalar yapabilen, serbestçe dağıtılan bir yazılımdır. Bu yazılım, yazılımı geliştiren Uppsala Üniversitesi'ndeki Görüntü Analiz Merkezi'nden ücretsiz olarak indirilebilir ve çalışma AB FP6 Projesi ENLIGHT ve Olink Bioscience tarafından desteklenmiştir. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ yazılımıŞuradan ücretsiz olarak indirilebilir: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
1x Tween 100x euromedex 2001-B %elde etmek için TBS'de seyreltin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
  2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
  3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
  4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169(2012).
  5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
  6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
  7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
  8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
  9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
  10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
  12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
  13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
  14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
  15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
  16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
  17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
  19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
  20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endoplazmik Retikulum Mitokondri Etkile imleriMitokondri li kili MembranlarVDAC1 IP3R1 KompleksiSabitlenmi H cre G r nt lemeYak nl k Ligasyonu Analizi ProtokolER Mitokondri Temas KantifikasyonuKalsiyum Kanallama KompleksiGRP75 IP3R1 iftiSiklofilin D IP3R1

İlgili makaleler