Yöntem makalesi

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

DOI:

10.3791/54902

⸱

11 Nisan 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LINC kompleksinin, mekanik kuvvetlerin hücre iskeletinden çekirdeğe transferine aracılık eden kritik yapı olduğu varsayılmıştır. Nesprin-2G, aktin hücre iskeletini perinükleer boşluktaki zar proteinlerine (SUN alanı proteinleri) bağlayan LINC kompleksinin önemli bir bileşenidir. Bu zar proteinleri, çekirdeğin içindeki laminlere bağlanır. Son zamanlarda, bir Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kuvvet probu mini-Nesprin-2G'ye (Nesprin-TS (gerilim sensörü)) klonlandı ve canlı NIH3T3 fibroblastlarında Nesprin-2G boyunca gerilimi ölçmek için kullanıldı. Bu makale, NIH3T3 fibroblastlarındaki LINC kompleks kuvvetlerini ölçmek için Nesprin-TS'yi kullanma sürecini açıklamaktadır. Nesprin-TS'den FRET bilgilerini çıkarmak için, ham spektral görüntülerin alıcı ve verici floresan kanallarına spektral olarak nasıl karıştırılacağına dair bir taslak da sunulmaktadır. Açık kaynaklı yazılım (ImageJ) kullanılarak, görüntüler önceden işlenir ve oransal görüntülere dönüştürülür. Son olarak, Nesprin-TS'nin FRET verileri, farklı deney grupları arasında verilerin nasıl karşılaştırılacağına ilişkin stratejilerle birlikte sunulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuvvet-duyarlı, genetik olarak kodlanmış FRET sensörler, yakın, canlı hücrelerde çekme bazlı kuvvetleri olarak proteinler, 1, 2, 3, 4 arasında nasıl uygulandığı mekanik kuvvetlerin fikir sağlamak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu araçları ile, araştırmacılar geleneksel floresan mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde, non-invaziv görüntü hücre içi kuvvetler can. Bu sensörler bir elastik peptid 3 ile ayrılmış bir FRET çiftinin (donör ve akseptör floresan proteinleri, en çok mavi bir verici ve sarı akseptör) oluşur. C- veya N-terminal etiketleme aksine, bu sensor, bir molekül gerilme göstergesi gibi davranmak, protein üzerinden iletilen mekanik kuvvetini ölçmek için bir proteinin bir iç alanı içine eklenir. FRET p arasında artan bir mesafe sensörü sonuçları arasında mekanik gerilim artışıhava, azalmış FRET 3 elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, FRET ters gerilme kuvveti ile ilgilidir.

Bu flüoresan bazlı sensörler fokal yapışma proteinleri (vinkülin 3 ve talin 4), sitoskeletal proteinler (α-aktinin 5), ve hücre-hücre birleşme proteinleri için geliştirilmiştir (E-kadherin 6, 7, VE-cadherin 8 ve PECAM 8). Bu biyoalgılayıcılarda da en sık kullanılan ve iyi karakterize edilmiş esnek bağlayıcı TSmod olarak bilinir ve örümcek ipeği proteini flagelliform türetilmiş 40 amino asitlik (GPGGA) 8, bir tekrarlanan dizinin oluşur. TSmod çekme kuvveti 3 5 pN için 1 FRET yanıtı, bir doğrusal elastik nano yay olarak hareket ettiği gösterilmiştir. flagelliform farklı uzunlukları dinamik r değiştirmek için kullanılabilirTSmod FRET kuvvet duyarlılık 9 ange. Flagelliform ek olarak, spektrin (HP-35 olarak da bilinir) 5 ve villin başlık peptid 4 içindeki kuvvet biyosensörler 4 FRET çifti arasındaki elastik peptidler olarak kullanılmıştır tekrarlar. Son olarak, son bir yay TSmod da sıkıştırma kuvvetlerini 10 algılamak için kullanılabileceğini gösterdi.

Son zamanlarda TSmod endojen benzer şekilde davranır mini Nesprin2G (Şekil 2C), olarak bilinen, daha önce geliştirilmiş kesik Nesprin2G protein içine sokulur kullanılarak Nucleo-hücre iskeletinin (LINC) kompleks protein Nesprin2G bağlayıcısına için bir güç sensörü gelişmiş Nesprin-2G 11. LINC kompleksi, nükleer lamina sitoplazmik hücre iskeleti bağlama, çekirdeğin içine dışarıdan yol açan birçok proteinler içerir. Nesprin-2G yapısal bir protein bağlanma her ikisitoplazmada ve çekirdek çevresi alanı GÜNEŞ proteinlerine aktin hücre iskeletinin. Bizim biyosensör kullanarak, Nesprin-2G NIH3T3 fibroblastların 2'de actomyosin bağımlı gerilim tabi olduğunu göstermek başardık. Bu, o kuvvet direkt olarak nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında ölçüldü ilk kez oldu ve mechanobiology içinde çekirdeği üzerinde gücünün rolünü anlamak için önemli bir araç haline muhtemeldir.

Aşağıdaki protokol, Nesprin- ifade eden hücrelerin FRET görüntülerin memeli hücrelerinde Nesprin gerilim sensörü (Nesprin-TS) ifadesi, hem de toplama ve analizi de dahil olmak, Nesprin-2G güç sensörü nasıl kullanılacağını detaylı bir yöntem sağlar TS. bir spektral detektörü ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak, duyarlı emisyon ölçmek için nasıl bir açıklama spektral Karışmama kullanılarak FRET ve rasyometrik FRET görüntüleme sağlanır. çıkış oran ölçer görüntüleri göreceli nereye yapmak için kullanılabilirntitative kuvvet karşılaştırmaları. Bu protokol, fibroblastlarda Nesprin-TS ekspresyonu odaklanmış olsa da, bu hücre hatları ve primer hücreler de dahil olmak diğer memeli hücreleri, kolayca adapte edilebilir. Bundan başka, bu görüntü elde etme ve FRET analizi ile ilgili olarak, bu protokol, hali hazırda diğer proteinler için geliştirilmiştir, diğer FRET'e dayalı bir kuvvet biyosensör için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nesprin-2G Sensör DNA ve diğer plazmid DNA elde edilir

  1. ticari bir kaynaktan Nesprin-2G TS (gerilim sensörü), Nesprin-2G HL (başsız) kontrol, mTFP1, venus, ve TSmod elde edilir. Bütün DNA plazmidleri yaymak ve daha önce 12, 13 tarif edildiği gibi, örneğin DH5a-a gibi Standart E. coli suşları, kullanarak saflaştırılması.

Nesprin-2G ve diğer Plazmid DNA ile 2. transfekte hücreler

  1. Sıcaklık (37 ° C) ve CO2 (% 5) düzenlenmesi ile standart bir hücre kültürü inkübatöründe bir 6-yuvalı hücre kültürü çanağı içinde% 70-90 konflüansa NIH 3T3 fibroblast hücrelerinin büyütün. hücre büyüme ortamı için,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanın.
  2. bir hücre kültür kaput, orta kaldırmak ve bir indirgenmiş serum hücre ortamında yaklaşık olarak 1 mL'si ile de her yıkayın. Her bir oyuğa indirgenmiş serum hücre ortamında 800 mcLve kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin.
  3. Lipid taşıyıcı çözeltisi 35 uL 1.5 ml tüp içine indirgenmiş serum hücre ortamında Pipet 700 uL "lipomix" oluşturulur. Pipetleme ile karıştırın. bir "L" ile tüp etiketleyin
  4. Altı 1.5 ml tüpler toplayın ve her bir tüpe indirgenmiş serum hücre ortamında 6. pipetle 100 uL aracılığıyla onları 1 etiketleyin.
    1. mVenus 5. pipetle 1 ug tüp içine borular 3 ve 4 pipetle 1 OVMP ug içine tüpler 1 ve 2 Pipet 2 Nesprin-HL ug içine aşama 1, pipet 2 Nesprin 2G-TS ug plazmid DNA konsantrasyonu kullanılarak tüp 6. içine yeniden kullanım etmeyin pipet uçları DNA'nın farklı türde pipetlerken zaman.
  5. Her bir işaretlenmiş borusu (1-6), "L" tüp lipomix Pipet 100 uL ve tekrar pipetleme karıştırın. Her tüp için temiz pipet kullanın. 10-20 dakika süreyle inkübe edin.
  6. % 70-90 konfluent 6 oyuklu odası içinde bir kuyuya her etiketli tüp 200 mcLHücreler. karşılık gelen DNA ile her bir üst Etiket ilave edildi. 46 saat için bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin.
  7. orta aspire ve durulama için indirgenmiş serum hücre ortamında 1-2 ml. , Indirgenmiş serum hücre ortamı aspire her bir göze tripsin 2 mL ekleyin ve inkübatör (5-15 dakika), 6-çukurlu bir tabak yerleştirin.
  8. Hücreler inkübatör içinde ayırmak birlikte, kat 6 cam alt fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda fibronektinle bir tabaka ile bulaşıkları görüntüleme. kaplamak için yemeklere hücre kültürü kaputu (yaklaşık 20 dakika) yüzey izin verin.
  9. Hücreler müstakil bir kez DMEM 2 mL eklenerek tripsin nötralize.
  10. iyi bir etiketli 15-ml santrifüj tüpüne her içeriğini aktarın ve sallanan bir rotor santrifüj içinde 5 dakika için 90 x g'da aşağı doğru döndürün. Süpernatant aspire ve pipet karıştırma ile DMEM 1.000 uL, her hücre topağı yeniden askıya.
  11. fibronektin karışımı aspireCam kaplar ve pipet cam tabaklar üzerine her bir hücre süspansiyonu 1.000 uL.
  12. Hücreler cam kasesi taban (~ 15 dakika) yerleşmek sonra hücre kuluçka makinesi içinde de yer ve her DMEM başka bir 1 ml +% 10 FBS +% 1 Pen-Strep ekleyin. Hücreler en az 18-24 saat sensör takmak ve ekspres izin verin.
    Not: Hücreler, ticari katyonik lipid transfeksiyon reaktifleri (Malzemelerin Tablo) kullanılarak transfekte edilir. Seçenek olarak ise, stabil hücre hatları, bir toksine karşı direnç kazandıran bir gen ile bir plasmid kullanılarak seçilebilir (Nesprin-TS ve -HL için pcDNA plazmidler genetisin direnci ifade eden hücreler (Malzemelerin Tablo) temin eden bir DNA depo web sitesinde bulunabilir ). Ek olarak, viral enfeksiyon yöntemleri (lentivirüs, retrovirüs, veya adenovirüs) transfekte etmek zor olan hücrelerde sensörü ifade etmek için kullanılabilir.
  13. Nesprin-TS ek olarak, Nesprin HL sıfır için ek hücreleri transfektece kontrol adımlar 2.1-2.12 tarif edildiği gibi; TSmod aynı zamanda sıfır güç kontrol olarak kullanılabilir ve Nesprin-HL benzer FRET sergilemelidir.
  14. mTFP1 ve venus ile transfekte hücreler spektral parmak izi (Adım 4) üretmek için.
    Not: mTFP1 ve venus, tipik olarak Nesprin-TS daha yüksek seviyelerde eksprese eder ve bu şekilde DNA alt miktarların benzer ekspresyon seviyelerini elde etmek için transfekte edilmesi gerekebilir.

3. Transfeksiyon Verimi doğrulama

  1. Yaklaşık 18-24 saat transfeksiyon tamamlandıktan sonra, görünümünde hücreler (genellikle% 5-30) toplam sayısı flüoresan hücrelerin sayısını karşılaştırarak transfeksiyon etkinliğini incelemek için bir ters flüoresan mikroskop kullanılır.
    1. 462 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venus) ve 492 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venüs) yakınında bulunan bir emisyon filtresi yakın bir uyarım frekansı ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak.
      NOT: Alternatif olarak, GFP filtre setleri mTFP1 bir arada yakalamak ve ettik edeceknus emisyon transfeksiyon verimliliği teyidini sağlayacak ve.
  2. Transfeksiyon sonrası 48 saat içinde resmi canlı hücreleri.
    1. Seçenek olarak ise, 48 saat 8 sonra, PBS içinde 5 dakika, deposu için, ve görünümü (kalsiyum ve magnezyumlu PBS içinde)% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit.
      NOT: 48 saat ötesinde, sinyal kalitesi ve gücü azalır. Hücrelerin Tespit 8 ifade edilen FRET dahil olmak üzere durumunu korur; orta montaj FRET 14 etkileyebilir olarak, ancak, hücrelerin sadece PBS içinde görüntülü olmalıdır. ekspresyonunda bir değişiklik olabilir gibi sabit hücreleri yalnızca, diğer sabit hücrelere kıyasla olabilir.
      Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin.

Spektral unmixing için mTFP1 ve Venüs floroforların 4. Yakalama Spektral parmak izleri

  1. Bir hücre kültürü kaputu, görüntüleme Mediu ile hücre orta yerine% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş m (HEPES-tamponlu).
  2. sıcaklık-kontrollü bir (37 ° C), konfokal mikroskop aşamasında görüntüleme yemekler yerleştirin.
  3. 1.4 olan bir sayısal açıklık ile 60X büyütmede yağ objektiv mTFP1-transfekte edilmiş hücreler ile cam görüntüleme tabağına yerleştirin.
    NOT: Yağ yakından cam zeminin kırılma indeksi benzemeye 60X objektif bir lazer tarama mikroskobu kullanılmaktadır. Yağ objektif lens üstüne yerleştirilir ve cam kapak ile doğrudan temas edilir.
  4. mTFP1 bir 458 mm uyarım kaynağı ve 500 nm de bir emisyon bant-geçiş filtresi ile eksprese eden hücrelerin bulun.
  5. Görüş alanında bir flüoresan hücre ile, (burada kullanılan yazılım "Lambda modu") spektral algılama modu seçmek ve spektral görüntü (Şekil 3-1) yakalamak; 10 mil artışlarım (Şekil 3-3) kullanılarak 458 nm ötesinde tüm frekansları içerir. Parlak fluoresc seçinHücre (20 piksel uzaklık) üzerinde ent bölgesi (ROI).
    Not: mTFP1 eksprese ROI spektral şekil hücresi boyunca nispeten sabit kalmalıdır. şekil büyük ölçüde farklı ise, lazer yeniden ayarlayın ve sinyal-gürültü oranını geliştirmek için ayarları kazanır.
  6. tıklayarak spektral veritabanına, floresan ROI ortalama normalize yoğunluğunu Ekle "veritabanına spektrum kaydedin."
  7. lazer gücü optimize edin ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilecek şekilde kazanırlar. Ayarlar farklı ekipman için değişecektir. Arka plan referans olarak floresan olmayan, transfekte edilmemiş hücreler kullanılarak, fakat detektörü (doyma noktasına) dinamik aralığının dışında, hücrelerin parlak olana kadar kazanç ve gücünü artırmak. Arka plan hücre ortalaması sonra saptanabilir flüoresans olmamalıdır.
  8. aşağıdaki istisnalarla Venus-transfekte hücreler için tekrarlayın:
    1. uyarı frekansı 515 nm'de olduğundan emin olun ve bant geçiş filtresi ce olduğuvenus-ifade eden hücreleri tespit ederken 530 nm'ye yakın ntered.
    2. Olarak "Spektral Mod" 515 nm yerine 458 nm'lik bir eksitasyon frekans kullanımı.

5. Yakalama Karışmamış Görüntüler

  1. için yakalama modunu değiştirin "Spektral unmixing."
  2. Karışmama kanallarına (Şekil 3, Ok-2) venus ve mTFP1 spektral parmak izi ekle.
  3. geri 458 nm argon kaynağına uyarım lazer ayarlayın.
  4. 60X petrol amacı yukarıda Nesprin-TS inceleyen tabağına yerleştirin.
  5. yeteri kadar parlak ifadesi ile bir floresan hücre odaklanan sonra, sinyal-gürültü oranını optimize etmekte kazanç ve lazer gücü ayarlar.
    NOT: Nesprin-TS FRET verimliliği% 20 yakın olduğu için, karışmamış Venus görüntü karıştırılmamış mTFP1 resimden daha büyük ölçüde sönük olmalıdır. Kabul edilebilir bir güç ve kazanç ayarı iteratif belirlendikten sonra, bu parametreler tüm resimler capt için sabit kalmalıdıredilsin.
  6. (Tüm doymuş piksel görüntü işleme sırasında çıkartılmıştır) nispeten benzer parlaklık Nesprin-TH hücrelerinin 15-20 görüntülerin en az çekme ve aşırı piksel doygunluk kaçının.
  7. özdeş görüntüleme parametreleri kullanılarak Nesprin-HL hücreleri ile görüntü yakalama işlemi tekrarlayın.

6. Görüntü İşleme ve Oran Görüntü Analizi

  1. Kullanılması açık kaynak ImageJ (FİJİ) yazılımı (http://fiji.sc/), BioFormats Reader kullanılarak açık yerel biçim görüntüler.
  2. Ön-işlem ve görüntüler ve daha önce tespit edilmiş protokollerin 15 kullanılarak oranı görüntü hesaplamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokole ardından DNA plazmidi DNA deposundan alınan edildi ve E. coli hücrelerine transforme edildi. Sensör DNA ifade eden E. coli LB / Amfisilin plakaları seçilir ve bir sıvı LB suyu içinde amplifiye edildi. Vektörlerin amplifikasyonu takiben, DNA plazmidleri standart, ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak Tris-EDTA tampon maddesi içinde saflaştırılmıştır. Bir spektrofotometre kullanılarak, saflaştırılmış DNA ug / mL (Şekil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem ve Nesprin-2G, nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında mekanik gerilimin canlı hücre görüntüleme gösteri, yukarıda özetlenen edildi. Bundan önce işe, örneğin mikropipet aspirasyon sitometrisi manyetik boncuk ve mikroskopik lazer ablasyon gibi çeşitli teknikler, hücre çekirdeği üzerindeki yükü uygulamak ve dökme malzeme özellikleri 16, 17, 18 ölçmek için kullanılmıştır. Ancak, bizim son çalış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, (DEC) R35GM119617 vermek Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memoria (DEC) güven ve NIH tarafından desteklenmiştir. konfokal mikroskop görüntüleme VCU Nanomaterials Karakterizasyonu Çekirdek (KKK) Tesisinde gerçekleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nesprin-TS DNAAddgene68127https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNAAddgene68128'denAl https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA'danAddgene54613
mVenüs DNA'sındanAddgene27793https://www.addgene.org/27793/'den Al
TSmod DNAAddgene26021https://www.addgene.org/26021/
Yetkili Hücrelerden AlınBiolineBIO-85026
Sıvı LB OrtamıThermoFisher10855001https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Katı LB Bakteri Kültürü PlakalarıSigma-AldrichL5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
AmpisilinSigmaA9518
SpektrofotometreBiorad273 BR 07335SmartSpec Plus
kuvars küvetBiorad1702504SmartSpec Plus
için küvet DNA izolasyon kitiMacherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
6 oyuklu hücre kültürü kabıFalcon-Corning 353046Multiwell 6 kuyulu polistren kültür kabı
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, (DMEM) hücre ortamıGibco11995-065DMEM(1x)
Sığır SerumuYaşam Teknolojileri16170-078
azaltılmış serum hücre ortamıGibco31985-070İndirgenmiş Serum Ortamı, "optimem"
Lipid Taşıyıcı Çözeltiinvitrogen11668-019Lipid Reaktifi, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL steril plastik tüpDenvillec2170
TripsinGibco25200-056%0.25 Tripsin-EDTA (1x)
cam tabanlı mikroskop görüntüleme kabıIn Vitro ScientificD35-20-1.5-N35 mm 20 mm Alt Kuyulu Tabak #1.5 cam
FibronektinThermoFisher33016015fibronektin insan proteini, plazma
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco14190-144Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin
15 mL steril santrifüj tüpüGreiner bio-one188261
sallanan rotor santrifüjü Termo elektronCentra CL2Sallanan rotor termo elektron 236
hücre kültürü biyogüvenlik başlığıForma Scientific1284
iklim kontrollü hücre kültürü inkübatörüThermoFisher3596
ters LED geniş alan floresan mikroskobuYaşam teknolojileriEVOS FL
Clear HEPES tamponlu görüntüleme ortamıMoleküler Problar
Fetal Sığır Serumu Yaşamteknolojileri10437-028
Sıcaklık Kontrollü-Ters konfokal w/458 ve 515 nm lazer kaynakları Zeiss  LSM 710-w / spektral META dedektörü
Büyüme OrtamıNewengland BiolabsB9020s
NIH 3T3 FibroblastlarATCCCRL-1658
Al https://www.addgene.org/54613/ Al A14291DJ

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
  2. Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
  3. Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  4. Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  5. Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
  6. Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  7. Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
  8. Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
  9. Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  10. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
  11. Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
  12. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  13. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247(2007).
  14. Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
  15. Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
  16. Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
  17. Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
  18. Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
  19. Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
  20. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
  21. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  22. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FRET Biyosens rleriNesprin 2GSpektral Ayr t rmaImageJ lemeNIH 3T3 H creleriKonfokal MikroskopiTransfeksiyon ProtokolRasyometrik G r nt leme

İlgili makaleler