Kemirgenlerde miyokard enfarktüsünün (MI) ölüm sonrası değerlendirmesi, lekeli kalp bölümlerindeki enfarktüsün ölçülmesine dayanır. Hasat edilen sıçan kalplerinin tabandan apekse sistematik örneklemesini ve trikrom lekeli histolojik kesitlerin görüntü analizlerini kullanarak enfarktüs boyutunu ölçmek için doğru bir yöntem tarif ediyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçanlar Kronik Kalp Enfarktüsü histolojik Niceleme
Bu makalede
Özet
Özet
Miyokard enfarktüsü, uzamış iskemiye bağlı kardiyomiyosit ölümü olarak tanımlanır; iskemik hasarı inflamatuar yanıt ve skar oluşumu (fibrozis) takip eder. İlk akut fazı takiben, sol ventrikülün (LV) kronik yeniden şekillenmesi kalbin yapısını ve işlevini değiştirir. Küçük hayvanlarda kalıcı koroner ligasyon, kronik bir MI modeli için bir referans model olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Enfarktüslü duvarın incelmesi giderek transmural fibrozise dönüşür. Enfarktüs boyutunun histolojik değerlendirmesi yaygın olarak yapılır; Bununla birlikte, niceleme yöntemlerinin bir standardizasyonu eksiktir. Gerçekten de, analiz edilen bölümlerin sayısı ve örnekleme ve niceleme yöntemleri gibi önemli metodolojik yönler genellikle açıklanmaz ve bu nedenle araştırmalar arasında karşılaştırmayı engeller. Çok sık olarak, papiller kaslar seviyesinde elde edilen tek bir bölüm üzerinde nicelik ölçümü yapılır. Enfarktüs genişlemesini ve yeniden şekillenmesini azaltmayı amaçlayan yeni stratejiler araştırılmakta olduğundan, doğru kalp örnekleme protokollerinin standardizasyonuna önemli bir ihtiyaç vardır. Hasat edilen sıçan kalbinin sistematik bir örneklemesini ve tabandan tepeye kadar elde edilen trikromatik lekeli histolojik kesitlerin görüntü analizlerini kullanarak enfarktüs boyutunu ölçmek için doğru bir yöntem tarif ediyoruz. Ayrıca, genişleme indeksinin (EI) hesaplanmasının, yeniden şekillenme boyunca sol ventriküldeki değişiklikleri hesaba katarak enfarktüs boyutu değerlendirmesine izin verdiğine dair kanıtlar sunuyoruz.
Giriş
Miyokard infarktüsü (Mİ) dünya çapında ölüm ve sakatlık önde gelen nedenidir. Koroner kalp hastalığı ana nedenidir; MI böyle tıkanıklığı koroner olaylara ardışık iskemi kaynaklanır. reperfüzyon ilk 6 saat içinde gerçekleştirilen olmadığında, iskemi geri dönüşü olmayan miyokard nekrozu neden olur. Hastalarda, MI karakterizasyonu klinik bulgular, elektrokardiyografi, biyomarkerlerin, ekokardiyografi, MR görüntüleme plazma seviyelerinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere farklı tanı araçları, dayanır ve histolojik 1 analizleri. Akut ve kronik MI koroner oklüzyon zaman miyokard nekrozu göreli zamanlamasına göre yaralanma iki farklı aşamalarında olarak sınıflandırılır. ilk 7 günü içinde ortaya çıkan akut faz, kardiyomiyositlerin kaybı, detaylı enflamasyon ve fibroblastların alımı ile ilişkilidir. kardiyak doku ve bir yara oluşması iyileşmesi ile karakterize edilen bir alt-akut faz, meydana1 ila 4-6 haftadır. enfarktüs, ventrikül duvar incelmesi ve ventrikül dilatasyon Genişleme kronik faz karakterize eder. Sol ventrikül geniş biçimlenme giderek şiddetli kalp yetmezliği 2 sonuçlanır.
Kalıcı sol ön inen arter (LAD) ligasyonu ile uyarılan MI kronik miyokard infarktüsü standart kemirgen modeli temsil eder. Koroner bağ taklit koroner oklüzyon. infarkt büyüklüğü ligasyonu sitede bağlıdır. Bir kemirgen modelinde miyokard iskemik hasar Karakterizasyonu klasik gibi troponin olarak biyobelirteç plazma seviyelerini, kullanılarak yapılır I ve T 3, ekokardiyografi, MR ve histoloji 4,5. Biyomarker seviyeleri Kardiyomiyosit ölüm yaygınlığı ile ilişkilidir. Ekokardiyografi, bölgesel duvar hareket bozukluğu kaynaklanan sol ventrikül fonksiyon bozukluğu değerlendirir. MRI veya yüksek çözünürlüklü olarak eklenmesi, non-invaziv görüntüleme teknikleri, içindeekokardiyografi, duvar hareketi azalma değerlendirilmesine olanak azaltılmış perfüzyon ve canlı miyokard ve duvar incelme ile yara alanının hacmi. LV boyutları infarkt doğru değerlendirilmesine izin verir. Son olarak, canlı ve ölü miyokardın miktar hasat kalplerin histolojik bölümlerde özel boyalar kullanılarak otopsi yapılmış ve enfarktüs boyutunu (IS) doğrulanmasını sağlar edilebilir. Bir diğer önemli özelliği enfarktüs genişleme indeksi (EI) 6 değerlendirilmesidir. EI ilk 3 gün içinde transmural enfarktüs ve başlar ilişkilidir. EI duvar kalınlığı artan bir şekildeki azalma, sol ventrikül boşluğu boyutunda bir artış ve AG şeklinde buna bağlı olarak değişiklikler ile karakterizedir.
yeni tedavilerin terapötik etkinliğini değerlendirmek için - özellikle rejeneratif stratejiler hücreler, matrisler dayalı ve kemirgenlerde MI gen teslimi-doğru bir değerlendirme büyük önem taşımaktadır.papiller kas düzeyinde elde edilen tek bir kesitte ölçülen zaman, IS boyutu LAD ligasyon aşağıdaki enfarktüs gelişme var büyük değişkenlik nedeniyle önyargılı olabilir; tepe infarkt sonra occulted olabilir. Önemli olarak, tespit MI boyutuna daha doğru metodolojiler fareler 7-9 ya da sıçanlar 10 için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, IS doğru LV biçimlenme ya da yeniden terapötik uyarılan azalmalar (veya önleme yollarını) ölçmek için yeterli değildir. Gerçekten de, genel olarak kalbin kesitleri üzerinde belirlenen toplam LV hacminin bir yüzdesi olarak ifade edilir. Bu yöntem, akut MI için geçerli olmasına karşın, yeniden sırasında meydana gelen AG duvarının incelmesi 11,12 değerlendirdi altında kalır. infarkt ve yapısal değişikliklerin tam bir morfometrik ölçümü gibi endokardiyal ve epikardiyal uzunluk ve çaplarda yanı sıra enfarktüs ve sağlıklı alanlar gibi çeşitli parametreler, ölçmek gerekir. Biz bir metodolojik yakl tarifoach doğru kronik sıçan modelinde MI ve yenileme değerlendirmek.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvanlar Hayvan Bakım Dair Avrupa Sözleşmesi uyarınca insancıl bakıma aldı. Cerrahi işlemler İsviçre Federal Veterinerlik Dairesi, İsviçre tarafından onaylanan Devlet Veterinerlik Ofisi, Fribourg, izin aldıktan sonra İsviçre Hayvanları Koruma Kanunu uyarınca yapıldı.
1. Kalp Hasat
NOT: Tüm cerrahi girişimler izofluran anestezi altında yapıldı. Çabaları hayvan acı azaltmak için yapılmıştır. Özel olarak, bütün hayvanlar 0.1 mg / kg buprenorfin ön anestezi deri altı enjeksiyonu yapıldı. Miyokard enfarktüsü inducting için cerrahi protokol daha önce başka bir yerde 13 tarif edilmiştir.
- Anestezi (entübe hayvan,% 2,5 izofluran, pençe tutam refleks ile teyit uygun anestezi) altında myocardially enfarkte hayvan üzerinde bir sternotomi gerçekleştirin.
- Daha sonra kasları cilt kesme ve hayvansal açıncerrahi makas ile. sol ve sağ kaburga kesin ve ardından göğüs çıkarın.
- Bir önceki ameliyatı (LAD ligasyonu) sonra kalan yapışıklıklar çıkarın. aort kesin ve kalp kaldırmak. (PBS içinde) 1 M KCl doku yerleştirin ve daha sonra PBS ile yıkayın.
2. Doku Hazırlanması
- akrilik sıçan kalp matris içinde uzunlamasına infarkt kalbi koyun. 1 saat boyunca -20 ° C'de saklayın.
- Bir çapraz olan bir traş makinesi bıçak kullanılarak matris içinde doğrudan kalp kesin. Her dilim sağlamak 2 mm kalınlığında. (Remodeling seviyesine göre) her kalp için 7 slaytlar - yaklaşık 5 Cut Bu sistematik örnekleme denir.
- Bu aşamada, 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama performans (kalp dilimleri tabanına-to-apeks yönünü tutmak) isteğe bağlıdır.
- 37 ° C'de 50 dakika boyunca PBS içinde% 1 TTC inkübe edin. 1 saat 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) içinde inkübe edin. betwee bölümleri koymakn 2 mm pullarla iki cam plakalar ve 15X büyütmede bir kamera ile birleştiğinde stereolojik mikroskobu ile fotoğraf çekmek.
DİKKAT! Paraformaldehit toksiktir.
- 37 ° C'de 50 dakika boyunca PBS içinde% 1 TTC inkübe edin. 1 saat 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) içinde inkübe edin. betwee bölümleri koymakn 2 mm pullarla iki cam plakalar ve 15X büyütmede bir kamera ile birleştiğinde stereolojik mikroskobu ile fotoğraf çekmek.
- Slayt dondurma (1. seçenek)
- (Kalıbın alt aşağı bölümün apeks odaklı tarafını yerleştirin) yönünü korumak cryotomy için orta (optimum kesme sıcaklığı, OKT) montaj bir plastik kalıp (10 x 10 x 5 mm) her slayt koyun. 15 dakika - 10 soğutma sıvı azot altında 2-metilbütan buharları ile blokları dondurun. Son olarak, -80 ° C de doku saklayın.
- Paraffinization (2. isteğe bağlı)
- 24 saat süreyle% 4 PFA sonra her kasetleri gömme slayt (aşağı kasetin altındaki bölümünün apeks odaklı yan koyarak yönünü korumak) ve yerleştirin. Bir doku işlemci makine gecede koy.
- 2 saat boyunca, etanol% 70 içinde inkübe edin. Ethan içinde inkübe2 saat boyunca 95% ol. 3 saat% 100 etanol içinde inkübe edin. 4 saat ksilol içinde inkübe edin. 5 saat (bir fırın içinde 60 ° C 'de erimiş) parafin içinde inkübe edin. Son olarak, parafin her kalp slayt gömerek blok yapmak.
- 24 saat süreyle% 4 PFA sonra her kasetleri gömme slayt (aşağı kasetin altındaki bölümünün apeks odaklı yan koyarak yönünü korumak) ve yerleştirin. Bir doku işlemci makine gecede koy.
3. Masson-Goldner Trikrom Boyası
- (: 5 mikron kalınlığında) ya da -18 ° C'ye ayarlanmış bir kriyostat ile Ekim bloklardan (kalınlığı: 7 mikron) manuel mikrotom ile parafin bloklardan doku bölümleri yapın.
- Masson-Goldner ile - (slayt başına 4 enine kesitleri 3) trikrom boyama (bkz) her sıçan için her kalp kısmından bir slayt Leke.
NOT: parafin kesitler için bu adımdan başlayın.- bir fırın içinde 60 ° C 'de slaytlar eritin. davlumbaz altında, 10 dakika her biri için iki kez ksilol onları deparaffinize. 3 dakika her biri için% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve distile suda rehidrate.
Not: cryosection bu aşama Başlangıçs. - Bouin çözümü gecede bunları düzeltmek. 15 dakika - Sonra, 10 musluk suyu ile durulayın. damıtılmış su içinde çalkalanır. 3 dakika boyunca Mayer hematoksilin bunları inkübe edin.
- slaytları çıkarın ve 5 dakika için damıtılmış su içinde bırakın. Daha sonra, 5 dakika boyunca asit Fuchsin-Ponceau bunları inkübe edin. 1 dakika için% 1 asetik asit ile durulayın.
- Daha sonra, 1 dakika için fosfomolibdik asit Orange G inkübe. 1 dakika süre ile% 1 asetik asit ile durulayın, 10 dakika boyunca hafif bir yeşil boya bunları tasarlamak ve 1 dakika süre ile% 1 asetik asit içinde çalkalanır.
- % 70 etanol (30 sn),% 95 etanol (30 sn), ve% 100 etanol (5 dakika) bunları kurutmak. , Doku kesitlerinde bir reçineli montaj orta bir damla koymak lamelleri ile onları karşılamak ve kurumaya bırakın.
- bir fırın içinde 60 ° C 'de slaytlar eritin. davlumbaz altında, 10 dakika her biri için iki kez ksilol onları deparaffinize. 3 dakika her biri için% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve distile suda rehidrate.
4. Enfarktüs Boyut Analizi
- Bir kamera ile birleştiğinde bir stereomikroskopta (15X büyütme) her slayttan bir görüntü kazanır. Aynı ayarıyla bir cetvel fotoğrafs.
- enfarktüs, septum kalınlığı, sol ventrikül (LV) oyuğu alanı, infarkt alanı ve kullanma LV doku alanının ortasında skar kalınlığını ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanın.
- Cetvel resmi (Şekil 1A) ile ölçeği ayarlayın.
- Daha sonra Set Dönüşüm Faktörü seçin Ölçümleri tıklayın. Kalibrasyon çubuğunda bir çizgi çizin. Sağ resmin üzerine tıklayın ve Bitiş kalibrasyon tıklayın. Bar değerini not alın ve sonra Tamam 'ı tıklatın.
- Lekeli kalp resmi (Şekil 1B) den LV seçin. Birden bölüm aracını kullanın. LV noktası-by-point seçin ve ardından sağ tıklayın Kopyala / Yapıştır her yerde.
- Tek parça ölçüm aracını kullanarak skar ve septum kalınlığı ölçmek (Şekil 1C ).
- Otomatik LV boşluğu, infarkt tespit ve LV alanları RGB modunda (Şekil 1D) otomatik alan ölçümü aracını kullanarak.
- aracını tıklayın. Etkinleştirin Sadece Sınırlar ve RGB modunda bitişik. Son olarak, bunu tespit etmek ilgi alanı içinde tıklatın. Gerekirse, hassas aletler kullanın.
- Cetvel resmi (Şekil 1A) ile ölçeği ayarlayın.
- AG alanına infarkt alanı oranı olarak enfarktüs boyutunu hesaplayın.
- aşağıdaki gibi genişleme endeksi hesaplayın: [LV boşluğu alanı / bütün LV alanı] / [enfarktüs kalınlığı / septum kalınlığı], LV boşluğu ve LV doku alanlarında hem dahil bütün LV alanı ile.
- Sonunda şöyle, her kalp için bir "ortalama" hesaplamak: [infarkt slaytlar genişleme endeksinin ortalama] * [infarkt slaytlar sayısı slaytlar / toplam sayısı].
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Altı hafta sonra, LAD ligasyonu, kalpler Lewis sıçanlarında hasat edildi. 2 mm doku kesitleri tepesinden tabanına elde edilmiştir. Bir TTC boyama işlemi beyaz görünen infarkt alanı, ve kırmızı görünen sağlıklı miyokard, (Şekil 2) görselleştirmek için yapıldı. LAD ligasyonu sitede bağlı olarak, enfarktüs boyutu değişir. Büyük MI için transmural infarktlar taban (Şekil 2A) için tepesinden gözlendi. Daha küçük infarktlar kalp (Şekil 2B) ort...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Fibrotik doku doğru hasat kalp ve görüntünün sistematik örnekleme yöntemiyle kronik MI sıçan modelinde değerlendirilebilir tabandan tepeye doğru edilen trichromatic lekeli histolojik kesitlerin analiz eder. Iki adım başarılı protokol uygulanması için özellikle önemlidir. İlk olarak, kalp hasat için KCI kullanımı kalp kası rahat bir halde muhafaza edilmesini sağlar. Bu aşama, farklı kalplerinden infarkt boyutlarının karşılaştırılması için ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Çalışma İsviçre Ulusal Vakfı [SNF 310030-149986 to MNG], Fribourg Üniversitesi ve Fribourg Hastanesi tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Akrilik sıçan kalp matrisi 2 mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| Inspira gelişmiş hacim kontrollü ventilatör | Harvard Aparatı | 557058 | |
| Kateter Kurulumu 14 G | BD | 381267 | |
| OCT | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer hematoksilen | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Asit Fuchsin CI 42685 | F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin < br / > CI 16150 | P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Turuncu G CI 16230 | O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Açık yeşil CI 42095 | L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Etanol mutlak | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-metilbütan | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Stereojik mikroskop | SM2800 | Nikon | |
| Formaldehit | 99340 | Reactolab | |
| Gömme kaseti | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Görüntü ölçüm Yazılımı | Bersoft.com | Lisanslı yazılım |
Kaynaklar
- Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
- Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
- Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353(2015).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
- Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
- Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
- Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
- Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
- Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
- Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
- Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390(2014).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
- Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
- Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
