Yöntem makalesi

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

13.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54972

⸱

16 Aralık 2016

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

Bu makalede

Özet

Bitkilerin modifikasyonu için mevcut yöntemlerin uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada önerilen yeni peptit türevi teknoloji, eksojen protein veya genlerin bozulmamış bitkilerin istenen hücre içi bölmelerine sokulmasında hem basitlik hem de verimlilik vaat ediyor.

Özet

Bitkilerde eksojen proteinleri tanıtma ve spesifik genleri eksprese etme (veya aşağı regüle etme) kapasitesi, bitki biyoteknolojisi alanındaki yeni uygulamaların yanı sıra temel araştırmalar için güçlü bir araç sağlar. Bitki hücrelerine protein veya gen transferi için şu anda mevcut olan uygulanabilir yöntemler, yani Agrobacterium ve mikromermi bombardımanı, düşük dönüşüm frekansı, sınırlı konakçı aralığı veya yüksek ekipman ve mikro taşıyıcı maliyeti gibi dezavantajlara sahiptir. Aşağıdaki protokol, bitkilere çeşitli nükleik asit ve protein bazlı kargolar için dağıtım maddeleri olarak rasyonel olarak tasarlanmış peptitleri kullanan basit ve çok yönlü bir yöntemi özetlemektedir. Peptitler, biyolojik olarak parçalanabilirlikleri, küçültülmüş boyutları, çeşitli ve ayarlanabilir özelliklerinin yanı sıra hücre içi/organel erişim sağlama yetenekleri nedeniyle sistemin geliştirilmesi için araçlar olarak seçilmektedir. Teslim edilen çok çeşitli kargoların (plazmid DNA, çift sarmallı DNA veya RNA ve protein) her biri için optimize edilmiş formülasyonların hazırlanması, karakterizasyonu ve uygulanması açıklanmaktadır. Protokol içindeki kritik adımlar, olası değişiklikler ve yöntemin mevcut sınırlamaları da tartışılmaktadır.

Giriş

Bitki genetik mühendisliği, geleneksel olarak bitkilere faydalı özelliklerin aktarılması için kullanılır. Son yıllarda, bu teknoloji, birçoğu kimyasal olarak sentezlenemeyen ve hayvansal veya mikrobiyal sistemler kullanılarak üretilmesi çok maliyetli olan, farmasötik açıdan önemli ve ticari olarak değerli proteinlerin üretimi için bitkileri biyo-fabrikalara dönüştürmek için uygulanmıştır1. Yeni genlerin eklenmesiyle, bitkinin kendi metabolizması, antikorlar, metabolik enzimler, hormonlar, antijenler veya aşı2 gibi çeşitli biyofarmasötiklerin üretimi için manipüle edilebilir.

Bitkiler için yerleşik gen transfer teknolojileri, Agrobacterium aracılı dağıtım3, DNA kaplı mikromermilerle bombardıman (biyolitik)4 ve protoplastların elektroporasyon5 veya polietilen glikol6 işlemidir. Protoplast gerektiren tekniklerden genellikle kaçınılır çünkü bunlar zaman alıcı, hantal ve tutarsız sonuçlar verir7. Sonuç olarak, şu anda hemen hemen tüm bitki modifikasyon çalışmaları, gen transferi için ya Agrobacterium ya da mikromermiler kullanmaktadır. Agrobacterium yöntemi daha yaygın olarak kullanılmaktadır ancak ekonomik açıdan önemli birçok bitki türü için geçerli değildir. Bu arada, mikromermi bombardımanı, çok çeşitli hassas bitkiler nedeniyle daha çok yönlüdür, ancak özel ekipman gerektirir ve genellikle ciddi doku hasarına neden olur. Ayrıca, bu yöntemler ya rastgele (biyolitik) ya da karmaşık (Agrobacterium) bir dağıtım mekanizması içerir ve değişken dönüşüm oranlarına sahiptir8. Bu nedenle, basit ama etkili ve farklı bitki türlerine uygulanabilen yeni bir bitki dönüşüm teknolojisi gereklidir.

Şu anda, bitkiler, bir hedef proteinin doğrudan verilmesinden ziyade, öncelikle istenen bir özelliği kodlayan eksojen DNA'nın verilmesiyle genetik modifikasyona tabi tutulmaktadır. DNA'nın proteinler üzerindeki daha yüksek stabilitesi en önemli avantajdır; bununla birlikte, DNA iletimi ile ilişkili potansiyel problemler, eksojen DNA'nın bitki genomuna rastgele eklenmesini ve antibiyotik direnç genlerinin yatay gen transferi yoluyla patojenik bakterilere istenmeyen şekilde iletilmesini içerir9. Genom düzenleme amaçları için, hücrelere yabancı DNA sokmadan bitki genomlarını düzenleme yeteneği, genetiği değiştirilmiş bitkilerle ilgili düzenleyici endişeleri ortadan kaldırabilir. Böylece, proteinin doğrudan verilmesi yoluyla bitkilerin modifikasyonu için alternatif bir DNA içermeyen strateji, bu ihtiyaçları karşılayabilecektir.

Burada, bozulmamış bitkilerde eksojen genlerin veya proteinlerin hedefli olarak verilmesi için orijinal olarak insan gen terapisi10-14 için geliştirilmiş peptit bazlı bir sistemi tanıtıyoruz. Peptitler, DNA'yı nükleaz bozulmasından koruyabilir ve hücre ve organel zarları15-17 arasında gen transferine aracılık edebilir. Ayrıca sitotoksik olmamalarının yanı sıra çeşitli ve ayarlanabilir özelliklere sahiptirler18-20. Daha da önemlisi, peptitlerin kullanılmasıyla, genler, ifade için mitokondri21 veya plastidler (kloroplastlar)22 gibi hücre içi organellere tam olarak hedeflenebilir - bu, biyolistik veya Agrobacterium aracılı dönüşüm ile elde edilemeyen bir görevdir. Kargo tipine bağlı olarak, bu yeni bitki modifikasyon teknolojisi, proteinleri23 iletmek ve bitki içinde, sitozolik alanı24-26 boyunca veya belirli bir organel bölmesi21 içinde spesifik genleri eksprese etmek (plazmid21,24 veya çift sarmallı DNA25) veya aşağı regüle etmek (çift sarmallı RNA26) için kullanılabilir. Tasarlanan taşıyıcı peptitler, hücre penetran (BP100 peptit) veya mitokondri geçişi (Cytcox peptid) dizilerine konjuge olan, negatif yüklü kargoların bağlanması ve/veya yoğunlaştırılması için polilisin (K8) veya polilizin-ko-histidin (KH)9 formunda bir katyonik alandan oluşur.

Protokol

Peptit bazlı formülasyonların hazırlanması 1.

  1. Her peptit aşağıdaki gibi bir stok çözelti hazırlayın (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml veya 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) ve (BP100) 2 K 8 (70 uM). 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her peptidin gerekli miktarda tartılır ve peptidi eritmek için otoklavlanmış ultra saf su ilave edilir. berrak bir çözelti elde edilene kadar tekrar tekrar pipetleme ile iyice karıştırın.
  2. Yükseltmek ve plazmid DNA (pDNA), iki-şeritli DNA (dsDNA) ve standart moleküler metodolojilere göre, çift-şeritli RNA (dsRNA) temizler. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, 1 mg / ml (pDNA ve dsDNA) ya da 400 nM (dsRNA) bir konsantrasyonda stok çözeltileri hazırlanır.
  3. Sodyum karbonat çözeltisi (0.1 M, pH 9), 1 ml protein (örn., Alkol dehidrojenaz, ADH) tozu 1 mg çözülmesiyle, 7 uM konsantrasyonda protein stok çözelti hazırlayın. F proteininin etiketleStandart protokollere göre olan rodamin B (RhB) halinde luorescent probları hücrelere verilebilir protein, mikroskopik sağlamaktır.
  4. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, ilgili bileşenlerin bir araya getirin.
    1. Peptid-pDNA formülasyonlar sitoplazma hedefleme için, pDNA (1 mg / ml) 20 ul 6.4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C'de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 773,6 ul ekle. Nükleer anlatım (P35S-RLuc-tNOS'u, Tablo 1) için tasarlanmış pDNA yapısını kullanın.
    2. Peptid-pDNA formülasyonlar mitokondri hedefleme için, pDNA (1 mg / ml) 20 ul Cytcox- 6.6 ul (KH) 9 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C'de 15 dakika boyunca stabilize etmek ve daha sonra BP100 2.4 ul (1 mg / ml) ekleyin izin verin. Karışım, 25 ° C'de 15 dakika dengelenmesine izin verin6; 15 dakika daha ° C. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 771 ul ekle. Mitokondriyal ifade (: rluc, Tablo 1 pDONR-COX 2) için tasarlanmış pDNA yapısını kullanın.
    3. Peptid-dsDNA formülasyonlar için, dsDNA (1 mg / ml) 8 ul 5.1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C'de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 786,9 ul ekle.
    4. Peptid-dsRNA formülasyonlar için, dsRNA (400 nM) 50 ul 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışım 25 ° C'de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu RNaz içermeyen su, 700 ul ekle.
    5. Peptid-protein formülasyonları için, ADH 16 ul (7 uM) (BP100) 2 K 8 (70 mcM) 16 ul ekleyin ve karıştırıniyi pipetleme. Karışım 25 ° C'de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. 800 ul son hacim olması için çözeltinin bulunduğu otoklavlanmış ultra saf su 768 ul ekle.
  5. Formülasyonlar 25 ° C'de 15 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin.

Peptit bazlı formülasyonların 2. Karakterizasyonu

  1. dinamik ışık saçılımı (DLS) analiz için bir küvete her solüsyonu (800 ul) aktarın. 173 ° 'lik bir geri yansıma deteksiyon açısı ile 25 ° C' de, bir 633 nm He-Ne lazer kullanılarak bir zeta nanosizer ile oluşan komplekslerin hidrodinamik çapı ve poli dağılım endeksi belirlemek.
  2. Aşağıdaki boyutu ölçümleri, 25 ° C'de dielektrik sabiti, kırılma indisi ve suyun viskozitesine varsayılan parametreleri zeta potansiyel ölçümleri için katlanmış bir kılcal hücresine her çözeltisi (800 ul) aktarın.
  3. (AFM atomik kuvvet mikroskopi ile DLS analizi için kullanılan kompleks çözeltisinin küçük bir hacmi, dikkat). Bir mika levha taze maruz bölünmüş yüzeye Mevduat karmaşık solüsyonu 10 ul ve kapalı plastik petri kuru gecede havalandırmak için mika bırakın.
  4. Modunda 27,28 dokunarak 1.3 N / m arasında bir yay sabitine sahip bir silikon konsol kullanılarak 25 ° C 'de hava içinde komplekslerinin bir imgesi alınır.

Bitki Yapraklarının 3. Sızma

  1. 3 haftalık toprak yetiştirilen bitkiler (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 veya kavak 26) kullanın. gen ekspresyonu ve protein teslim ölçümü için üç kopya olarak hizmet etmek üzere en az 3 yaprak transfekte.
  2. Bir yaprak transfeksiyonu için karmaşık çözeltisi 100 ul ile 1 ml iğnesiz plastik şırınga yükleyin. yaprağın alt yüzeyi bir şırınganın ucu yerleştirin.
  3. biraz yaprak karşı şırınga ucu bastırın ve i ile bir karşı baskı uygulayarak yavaş yavaş şırınga pistonu bastırınKarşı taraftan bir lateks eldivenli elin nDex parmağı. Başarılı infiltrasyon yaprak suda ıslatılmış alana yayılması olarak görülmektedir. kimlik kolaylığı için sızmış yaprakları etiketleyin.
  4. peptid-pDNA (12 saat), peptid-dsDNA (12 saat), peptid-dsRNA ile infiltrasyon, aşağıdaki optimize sürelerde transfekte yaprak inkübe - aşağıdaki koşullar altında (9 48 sa) ve peptit-protein (6 saat) formülasyon: 16 saat ışık / N. benthamiana için 29 ° C'de A thaliana, kavak, veya 24 saat sabit bir ışık için 22 ° C 'de 8 saat karanlık.

Transfeksiyon etkinliğindeki 4. Değerlendirme

  1. Daha küçük bitkilerin tüm yaprak transfekte (örn., A. thaliana) veya daha büyük tesisler için infiltre bölgenin 1 cm2 bölümü tüketim (örn., N. benthamiana).
  2. Renilla lusiferaz (Rluc) raportör vektörü kullanılarak transfeksiyon deneyleri için, transfectio belirlenmesin, verimi kantitatif bir Rluc Deney Kiti kullanılmıştır.
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her kesilmiş yaprak veya yaprak bölümü yerleştirin. tüp başına 1 x Rluc Deneyi Lizis Tamponu 100 ul ekle. Aynı şekilde, transfekte-olmayan kontrol yaprakları (üçlü) lizatları hazırlar.
    2. Bir homojen hale havaneli kullanılarak yaprak öğütün ve 6, 25 ° C 'de elde edilen lizat inkübe - 10 saat süredir.
    3. 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 12.470 x g'de lizat santrifüjleyin. Aktarım 20, 96 çukurlu bir mikrolevhadaki iyi olarak temizlenir lisat ul ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir BCA Protein Deney kiti kullanılarak toplam protein konsantrasyonu ölçümü için geri kalan hacmi kullanın.
    4. kuyuya 1 x Rluc Deneyi Substrat (Rluc deney tamponu kullanılarak seyreltilmiş) 100 ul ilave edin ve yavaş pipetle karıştırılır. Bir çok modlu mikroplaka okuyucu içinde mikroplağı yerleştirin ve ölçümü başlatmak.
    5. arka plan lüminesans çıkart (NO ortalaman-transfekte her deneysel numunenin luminescence itibaren) üç nüsha. protein (mg) miktarına Fotolüminesans oranı (nispi ışık birimleri, RLU) hesaplayın.
  3. Yeşil floresan proteini (GFP) raportör vektörü ya da floresan etiketli protein kullanılarak transfeksiyon deneyleri için (örn., ADH-RhB) bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak floresan izleyin.
    1. gibi bir kesiti yaprak kullanılabilir iken, bütün yaprak (hava boşluklarının çıkışına yardım etmesi için) kenarlarını kesin. 10 ml şırınga pistonu çıkarın ve şırınga her eksize yaprak veya yaprak bölümüne yerleştirin.
    2. pistonu değiştirin ve yaprak kırma olmadan şırınga altına hafifçe itin. yaklaşık yarısı dolana kadar şırınga içine su çizin.
    3. yukarı şırınga gelin ve ucu ile şırınga havayı çıkarmak için piston itin. lea gelen havayı dışarı atmak için aşağı pistonu yavaşça şırınga ucu Kapak ve çekmef. yaprak saydam görünene kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
    4. Yapışkan bant ile bir mikroskop lamı yüzeyini kaplar. Bir bıçak kullanarak yaprak örneği barındıracak kadar büyük kaset üzerinde bir kare alana kesin ve bir örnek odasını oluşturmak için forseps ile bant kare parça soyulabilir. Bant slayt ve lamel arasındaki ayırıcı olarak görev yapacak.
    5. yukarı bakacak şekilde alt yüzeyi ile odasında yaprağı yerleştirin ve su ile kalan kamara alanı doldurmak. Bir cam lamel ile bölme içinde yaprak Seal ve yapışkan bant ile lamel kenarlarında sabitleyin.
    6. 40X objektif altında odaklı lazer tarama mikroskobu veya 63X suya daldırma objektif kullanarak yaprak örneği inceleyin. GFP ya RhB floresans, sırasıyla 488 nm ve 555 nm uyarılma dalga boyunda görselleştirilebilir.

Sonuçlar

nükleik asit ve protein yüklerin bir dizi başarılı iletim vektörleri olarak dizayn peptidler kullanılarak çeşitli bitkilerin içine katılmıştır. Katyonik peptitler ve negatif yüklü yük arasındaki elektrostatik etkileşimleri doğrudan bir iğnesiz enjektör (Şekil 1) kullanılarak yaprakları bitkiye nüfuz edilebilir transfeksiyon kompleksleri oluşumu ile sonuçlanmıştır. Bitki hücrelerinin transfeksiyonu için (deneysel olarak bu çalışmalarda 21,23-26 belirlenen) optimize edilmiş formülasyonlar teslim yük (pDNA, dsDNA, dsRNA ve protein) geniş her tür temsil Tablo 1 'de listelenmiştir. 300 nm - bütün peptit bazlı formülasyonların ortalama çapı 150 yaklaşık aralığında idi. DLS analizine dayanarak, tüm formülasyonlar oluşan peptit kargo gruplar, tek bir boyut dağılımına sahip olduğunu gösterir, nispeten küçük boyut çoklu-dağılırlıklan gösterilir. morfolojileriPeptit ve pDNA (Şekil 2A) ya da protein (Şekil 2B) arasındaki kompleksler, mika, AFM ile görüntülenmiştir. Homojen küresel kompleksleri DLS ölçümlerinden elde edilen verilerle uyum içinde, hem peptid-pDNA ve peptid-protein kombinasyonları için gözlenmiştir. DsRNA'nın bazlı kompleksler nötre yakın yüzey yüküne vardı kompleksleri (Tablo 1) zeta potansiyeli açısından, pDNA- ve dsDNA türevi kompleksleri, net negatif yüzey yükleri vardı. Peptid-protein kompleksleri, diğer taraftan, pozitif yüklü edildi.

Peptid-PDNA ve model bitki sistemleri A. thaliana ya da N. benthamiana transfeksiyonunu aracılık peptit-dsDNA formülasyonların verimleri niteliksel yanı sıra kantitatif olarak değerlendirildi. RLuc gen deneyi Bu deney, pDNA için, bu nedenle, gen ekspresyon düzeylerinin ölçümü (Tablo 1) kullanılmıştır veRLuc genini kodlayan dsDNA ilgili taşıyıcı peptidler ile kompleks için kullanılmalıdır. Yaklaşık 1 X 10 5 tahmini RLU / Mg değeri, 12 saatlik bir inkübasyon döneminden sonra, (KH) 9 -BP100 / pDNA formülasyonu nükleer hedefli dağıtım ve pDNA ekspresyonu elde edilebilir kullanılması. PDNA, peptidler bir kombinasyonunun mitokondriyal hedefli dağıtım ve ekspresyon için, Cytcox- (KH) 9 ve BP100, kompleks oluşumu için gereklidir. 12 saat aynı inkübasyon süresi ile, ancak, transfeksiyon (yaklaşık olarak 1 x 10 3 RLU / mg), çok daha düşük bir seviyede elde edilmiştir. Bu arada, benzer kuluçka dönemi (12 saat) ve gen ifadesi seviyesi (yaklaşık 1 × 10 3 RLU / mg) da 9 -BP100 peptit (KH) kullanılarak formüle, dsDNA tabanlı kompleksleri için kaydedilen / gerekmiştir. Gen ifadesinin niteliksel değerlendirmeleri kompleksleri HAZIRLIK işlenmiş yaprakları direkt mikroskopik gözlem ile gerçekleştirilmiştired pDNA kullanarak veya dsDNA GFP raportör genini kodlayan. Hedeflenmemiş peptide pDNA kompleksleri ile transfekte edilen hücrelerde, GFP tanımı açıkça görülmektedir ve sitosol (Şekil 3A) lokalize olduğu görülmüş, karşılık gelen yeşil floresan yayılır. GFP floresan lokalizasyonu deseni belirgin farklılıklar mitokondriyal hedefli peptid-pDNA kompleksleri ile infiltre hücrelerde belirgindi. Burada, mitokondriyal leke ile colocalize noktalı yeşil floresan hücrelerin mitokondrial bölmeye (Şekil 3B), münhasıran, gen ekspresyonu özgünlüğünü teyit görülebiliyordu.

peptid-protein formülasyonlan söz konusu olduğunda, bir florofor (RhB) protein yük (ADH) konjugasyonu hücre bölmesine verilen protein görselleştirme sağlayacaktır. 6 saat gibi kısa bir kuluçka dönemi içinde, ADH-RhB proteini (mavi) boyunca dağılmış olduğu bulunmuşturSitosol ve infiltre hücreler, hücre arası boşluk (Şekil 3C). Öte yandan, bir gen ifadesinin hızlı ve etkili bir aşağı-regülasyon peptid-dsRNA formülasyonlar kullanılarak, çeşitli bitkilerde gerçekleştirilebilir. İlk deneyde, A. thaliana yaprağı peptid-dsRNA ile infiltre edildi kuraklık koşullarında antosiyanin (kırmızı pigment) biyosentezi için sorumlu kalkon sentaz geni (CHS) susturmak için kompleksleri. A. thaliana görünümünde fark (b Şekil 3B) optimize edilmiş peptid-dsRNA formülasyonu kullanarak susturmak CHS değerlendirmek için kolay bir yol sağlanan ve kuraklık, normal (a Şekil 3D) (ok 1 sızmış bölgeyi gösterir) altında bırakır. İkinci deneyde, peptit dsRNA kompleksleri sarı floresan protein (YFP) eksprese eden transjenik A. thaliana yapraklarına süzüldü. YFP ekspresyonunda belirgin bir azalma epidermal hücreler 9 saat p görülebilirost transfeksiyon (Şekil 3E, F). Farklı bitki sistemi (kavak, 12 saat post-transfeksiyon) 'de düzenleyici gen ekspresyonu formülasyonun etkinliği de (Şekil 3G, lH) doğrulanmıştır.

figure-results-1
Şekil 1: Yaşam Bitkiler içine nükleik asit ve protein Cargoes teslimi için Peptit tabanlı formülasyonlar.
tasarlanmış taşıyıcı peptidler, hücre penetran veya organel geçiş dizileri konjuge polikatyon oluşmaktadır. Polikatyonlar hücrelerine içselleştirme aşağıdaki endozomal bölmesinden ve / veya negatif yüklü yüklerin yoğunlaşmasını yanı sıra kaçış bağlayıcı etkinleştirin. Belirli organellere hücrelere yük teslim ve daha sonra, sırasıyla, hücre nüfuz dizileri ve organel geçiş dizileri tarafından aracılık eder. successfu olabilir çeşitli yüklerinlly bitkiye verilen sığır serum albümini (BSA), alkol dehidrogenaz (ADH) ve sitrin (sarı floresan proteinin bir varyantı) gibi nükleik gibi pDNA, dsDNA ve dsRNA gibi asitler, örnek olarak alınan proteinler. Biyoaktif moleküllerin şırınga infiltrasyonu ile bitki yapraklarının sokulur elektrostatik etkileşimler yoluyla peptit konjugatları ile transfeksiyon kompleksler oluşturabildiği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: peptit bazlı formülasyonların morfolojileri.
(KH) N / P 0.5 de 9 -BP100 / pDNA formülasyonu (A) AFM genlik görüntü. (B) (BP100) molar Rati 2 K 8 / ADH formülasyonunun AFM yüksekliği görüntüsüo 10. yayınlanmış kaynaklardan 23,24 izni ile çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: Optimize Peptit bazlı formülasyonlar kullanılarak Transfeksiyon Efficiencies Mikroskopik değerlendirilmesi.
A. thaliana süngerimsi mezofil hücrelerinde gözlenmiştir (A) kloroplast otofloresans (kırmızı) açıkça ayırt Sitosolik GFP (yeşil), (KH) 9 -BP100 / pDNA formülasyonu (N sızmış yaprakları / P 0.5; 12 saat ). (B) GFP tanımı (yeşil), her bir peptidi için Cytcox- (KH) ile infiltre A. thaliana yaprağı 9 / BP100 / pDNA formülasyonu (N / P, 0.5 epidermal hücrelerinde mitokondri (kırmızı) saptandıe; 12 saat). GFP ile mitokondri genişlemiş görüntüleri aşırı sağ panelde gösterilir. A. thaliana süngerimsi mezofil hücrelerine ADH-RHB (mavi) (C) Teslim, 10 bir peptit / protein molar oranında (BP100) 2 K 8 aracılık ettiği 6 saat sonrası infiltrasyon görüntülenmiştir bırakır. Önce (D) A. thaliana yaprağı (a) ve (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu (mol oranı 2; 48 saat) ile birlikte, (b) tedavi sonrası, antosiyanin biyosentez yolunun bastırılması ile sonuçlanmıştır. GFP5 dsRNA içeren benzer bir formülasyon negatif kontrol (C) ve kanadı içine infiltre edildi. oklar 2 ve 4 yaprak içinde olmayan sızmış alan işaret ederken oklar 1 ve 3 sızmış alanı belirtir. (E), A. thaliana sarı floresan protein (YFP) ve (F) infiltrasyon, aşağıdaki azalmış YFP floresan ifade bırakır (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu (molar oranı 2; 9 saat). (G) sarı floresan protein (YFP) ve (H) (KH) 9 -BP100 / dsRNA formülasyonu ile azalmış YFP floresan Aşağıdaki infiltrasyon ifade eden transjenik kavak yaprakları (mol oranı 2; 12 saat). Yayınlanmış kaynaklardan 21,23,24,26 izni ile çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4:-DNA Peptide-(N / P) Oran ve Kompleksleri Biyofizik Özellikleri Üzerine Etkisi Varyasyon.
DNA oranı peptidi artan peptit bazlı formülasyonlar da Zeta potansiyeli değerleri geçiş sırasında negatiften pozitife boyutu azalır./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Tablo 1: Karakterizasyonu ve çeşitli peptid bazlı formülasyonlarının değerlendirilmesi. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-6
Tablo 2: Bozulmamış Bitkiler için Peptit tabanlı ve diğer Mevcut DNA Teslim Teknolojileri Karşılaştırılması. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

ampirik tespit edilmiştir protokolü içinde kritik adımlar ele alınmıştır. Şırınga infiltrasyonu ile, peptit bazlı formülasyonlar stoma yoluyla bitki yaprak içinde hava boşluklarına yerleştirilir. Bitkiler yeterli su ve hafif süre boyunca ortam stomatal deliğin yani. Elverişli olan koşullar altında zaman çözeltinin maksimum alımını sağlamak için, süzme işleminin yapılması gerekir. (Mitokondrial hedefli DNA nakli için) iki peptitten oluşan bir kombinasyon içeren formülasyonlar için transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması açısından, ile, her bir bileşenin ilavesi için dizi önemli ve ters olmamalıdır.

prosedüre birçok makul değişiklikler vardır. Bitki hücrelerinin infiltrasyonu için başka bir seçenek de dahil olmak üzere bütün bitkileri ve / veya kısmi dokulara karmaşık solüsyonun verilmesini mümkün vakum infiltrasyonu kullanımı,apikal meristemler. Bu alternatif prosedür için, fidan transfeksiyon çözeltisine batırılmış ve vakum tarafından oluşturulan basınca göre, peptid-kargo kompleksleri stoma yoluyla ve bitki hücrelerinde (Yoshizumi, T., yayınlanmamış veri) içine zorlanır.

Hayvan hücreleri üzerinde yapılan çalışmalara göre geçici gen ekspresyonu, yüksek DNA konsantrasyonları 29-31 arttığı gösterilmiştir. DNA peptid oranı komplekslerinin biyofiziksel özellikleri (boyut, yüzey yükü) etki not transfeksiyon verimini etkilemektedir (Şekil 4), önemlidir; Bu nedenle, en iyi oranı da artan bir DNA konsantrasyonu muhafaza edilmesi gerekmektedir.

Bir gen / protein teslim maddesi olarak peptidler kullanılarak ana avantajlarından biri olan sekansı, istenen işlevi yerine getirmek için ayarlanması için uygun olmasıdır. Örneğin, bir taşıyıcı peptidin mitokondriyal hedefleme alanı Bu damızlık tarifY, bu organellere lokalizasyonu için kloroplast ya peroksisomal-hedefleme sekansları ile ikame edilmiş olabilir. Kloroplast transformasyonu biyolistik 32-34 kullanarak çeşitli bitkilerde mümkün olsa da, Agrobacterium veya biyolistik yöntemi de çekirdeğin (Tablo 2) yanı sıra, mitokondri ya da diğer organellere genleri getirebilir.

Agrobacterium merkezli yöntem (Tablo 2) farklı olarak peptit bazlı transfeksiyon için bir bükülmez konakçı aralığına sınırlamaları vardır. Şu ana kadar, A. thaliana, N. benthamiana, kavak transfeksiyonu için formülasyonlar (Tablo 1) optimize edilmiştir, ancak yöntem, aynı zamanda, Nicotiana tabacum için de uygulanabilir, Domates çeşit mikro-Tom, pirinç (Hazırlık deneylerinde göre), ve diğer mono-ve çift filizli bitkiler.

peptidler kullanıldığında Şimdiye kadar, transgen büyüklüğü bilinen herhangi bir sınırlama yokturS transfeksiyonu vektörler. Bunun aksine, büyük DNA moleküllerinin Agrobakterium aracılı yöntemler 35,36 dönüşüm verimliliği ve 37-39 bildirilmiştir yaklaşık 200 kb'lik transgenler için üst bir sınır azaltmak için tespit edilmiştir. Biyolistik kullanımı ile, diğer taraftan, büyük DNA fragmanları bitki 38 içine hazırlama veya doğum sırasında kesilmiş olabilir. Bir üst sınırı kadar biyolistik transformasyonu için tespit edilmiştir, ancak, vücut kısıtlar daha az 150 kb 40 transfer edilebilir DNA boyutunu sınırlamak için tespit edilmiştir. Yukarıda ele alındığı Agrobacterium ya mikroprojektil bombardımanı, ya kullanılarak mevcut yaklaşımların karşılaştırıldığında gen transferi için peptit bazlı sistem kullanılarak büyük yararları, Tablo 2'de özetlenmiştir.

bu haliyle birkaç sınırlamalar bu yöntem için var. Birincisi, böyle bir mit olarak belirli organellere, için PDNA teslim hedefolmasına rağmen bu ochondria, DNA bağlama, hücreye nüfuz eden ve organel-geçiş dizilerinin basit bir kombinasyonu ile mümkün olduğu kanıtlanmıştır. Transgen ekspresyonu, sadece hücre içinde mitokondri küçük bir popülasyonda, konfokal mikroskobu ile tespit edilebilir. Hücre / organel zar boyunca daha komplekslerin translokasyon arttırmak ve (ii) söz hedef organel ayrışmasını ve taşıyıcı peptidden pDNA transferini geliştirmek: (i) Bu nedenle, başka modifikasyonlar için gereklidir. İkinci olarak, bu DNA verme sistemi ile, ekzojen raportör genlerin geçici ifade başarıyla hücrelerin sitosolik ve mitokondriyal bölmesinde elde edilmiştir. bitki nükleer / organel genomunda katılan genlerin istikrarlı birleşme ve ifade nedeniyle uygun seçim stratejilerinin olmaması, ancak, henüz kurulmuş değil.

kabul etmekle birlikte iyileştirme ya da daha fazla d alanlar olduğunuevelopment, burada açıklanan peptit türevi strateji çeşitli bitki türleri içine çeşitli yüklerin teslimatı için yolunu açmıştır basit ve çok yönlü bir tekniktir kalır.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı Keşif Araştırma İleri Teknoloji (JST-ERATO), Yeni Enerji ve Endüstriyel Teknoloji Geliştirme Örgütü (Nedo) ve Çapraz bakanlık Stratejik İnovasyon Tanıtım Programı (SIP), Japonya'dan fon kabul etmek istiyorum .

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(KH) < alt > 9< / sub>-BP100 peptidiN / Atarafından özel olarak sentezlenmiştir: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100) 2 < / sub>-K < sub>8 < / >sub peptitRIKEN Beyin Bilimleri EnstitüsüN / ADizisi: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
KYLKKKKKKKK
BP100 peptidRIKEN Beyin Bilimi EnstitüsüN/A: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptitN/Atarafından özel olarak sentezlenmiştir: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS ve P35S-RLuc-TNOSN/AN/ACaMV 35S kurucu promotörün kontrolü altında sırasıyla yeşil floresan proteini ve Renilla lusiferaz genlerini kodlar (Ref: Lakshmanan et al. Biyomakromoleküller 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp ve pDONR-cox2:rlucN/AN/ACox2 mitokondriyal spesifik promotörün kontrolü altında sırasıyla yeşil floresan proteini ve Renilla lusiferaz genlerini kodlar (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (pBI221-P35S-Rluc-TNOS'tan PCR ile amplifiye edilmiş)N/AN/A CaMV35S kurucu promotörün kontrolü altında sırasıyla yeşil floresan proteini ve Renilla lusiferaz genlerini kodlar (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/AYeşil floresan proteinin RNA girişim aracılı susturulması için (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/AKalkon sentazın RNA girişim aracılı susturulması için (Ref: Numata et al< / em> Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 ml ve 10 ml Plastik ŞırıngalarTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
1.5 ml Mikrosantrifüj TüpüAS ONE Corporation151212
96 Kuyulu Düz Tabanlı PlakaAsahi Glass Co., Ltd.3860-096
Yapışkan BantSekisui Chemical Co., Ltd.835
Alkol DehidrojenazSigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
Atomik Kuvvet MikroskobuSeiko Instruments Inc.SPI3800, SPA 300HV
Atomik Kuvvet MikroskobuHitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
BCA Protein Test KitiThermo Fisher Scientific Inc.23227
KonsolHitachi High-Tech Science CorporationK-A102001593
Konfokal Lazer Tarama MikroskobuCarl ZeissLSM700
Mantar DeliciSigma-Aldrich Co., LLC.Z165220Yaprakların 1 cm çapındaki disklere eksizyonu için
CoverslipMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
KüvetSarstedt759116
Katlanmış Kılcal HücreMalvern Instruments, Ltd.
ForsepsShimizu Akira Akira A.Ş.Paslanmaz pincet 150
Homojenizasyon HavaneliIeda Trading Corp.9993
MikaNisshin EM Co., Ltd.LC23Z Mikrosantrifüj
Beckman CoulterBKA46472
Mikroplaka OkuyucuMoleküler Cihazlar CorporationSpectra MAX M3
Mikroskop SlaytMatsunami Cam Sanayi Sanayi
PipetEppendorf Research® plus3120000909
Pipet UçlarıAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastik Petri KabıAS ONE Corporation1-7484-01
Renilla Luciferaz Test KitiPromega şirketiE2810
Rhodamine B İzotiyosiyanatSigma-Aldrich Co., LLC.
RNaz İçermeyen SuQiagen129112
Sodyum KarbonatWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.199-01585
Cerrahi Bıçak ve SapFEATHER Güvenlik Tıraş Bıçağı Co., Ltd.Paslanmaz çelik No. 14 (bıçak), No. 3L (sap)
Şırınga Ucu KapağıMusashi Mühendislik A.Ş.NC-3E
Tartı TerazisiSartoriusCPA225D
Zeta PotansiyometresiMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS
RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü Dizisi Dizisi tarafından özel olarak sentezlenmiştir RIKEN Beyin Bilimleri Enstitüsü Dizisi DTS1070S011120283924

Kaynaklar

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751(2015).
  22. Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081(2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379(2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Peptit letimiGen Ta n mProtein Ta n mBitki Transformasyonur nga nfiltrasyonuDinamik I k Sa l mZeta Potansiyeli l mAtomik Kuvvet MikroskobuKonfokal MikroskopiRenilla L siferaz Analizi

İlgili makaleler