Method Article

Pulpa Değerlendirilmesi için Doğrudan Selüloz-kapatma Modelinin Geliştirilmesi Yara İyileşmesi ve Farelerde Onarım dentin oluşumu

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu pulpa yara iyileşmesi ve in vivo onarım dentin oluşumunun değerlendirilmesi için farenin dişler üzerinde kapatma doğrudan kağıt hamuru yapmayı bir adım adım bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş pulpası, mine ve dentin tarafından tamamen korunan bir dişin hayati bir organıdır. Pulpa, karyojenik veya iyatrojenik yaralanmalar nedeniyle maruz kaldığında, pulpa yara iyileşmesini hızlandırmak için genellikle biyouyumlu materyallerle kapatılır. Nihai hedef, "biyolojik mühür" işlevi gören ve alttaki pulpa dokusunu koruyan fiziksel bir bariyer olan onarıcı dentini yeniden oluşturmaktır. Bu doğrudan pulpa kapatma prosedürü diş hekimliğinde uzun süredir kullanılmasına rağmen, pulpa yara iyileşmesi ve onarıcı dentin oluşumunun altında yatan moleküler mekanizma hala tam olarak anlaşılamamıştır. Onarıcı dentini indüklemek için, pulpa kapatma işlemi büyük hayvanlarda deneysel olarak gerçekleştirilmiştir, ancak muhtemelen küçük boyutları ve ardından gelen teknik zorluklar nedeniyle farelerde daha az gerçekleştirilmiştir. Burada, Sınıf-I benzeri bir boşluğun hazırlanması, hamur kaplama malzemelerinin yerleştirilmesi ve dental kompozit kullanılarak restorasyon prosedürü dahil olmak üzere, farelerde bir pulpa kapatma prosedürünün gerçekleştirilmesi için ayrıntılı, adım adım bir yöntem sunuyoruz. Pulpa kapaklı fare modelimiz, araştırma topluluğunda yaygın olarak bulunan transgenik veya nakavt farelerin kullanımını mümkün kılarak in vivo onarıcı dentin bağlamında pulpal yara iyileşmesinin temel moleküler mekanizmalarının araştırılmasında etkili olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş çürükleri hemen hemen tüm bireylerde en sık görülen ağız hastalıklarından biridir ve dişlere yönelik cerrahi girişimlerin önde gelen nedenidir1,2. Bir dişin cerrahi girişimlerinin ve restorasyonlarının prognozu büyük ölçüde uygun pulpa yanıtına ve başarılı yara iyileşmesine bağlıdır. Gerçekten de, mine ve dentinden derinlemesine nüfuz eden diş çürükleri sıklıkla, mineral trioksit agregatları (MTA) dahil olmak üzere kalsiyum hidroksit (Ca(OH)2) veya hidrolik kalsiyum-silikat çimentoları (HCSC'ler) gibi diş materyalleriyle "kapatılan" alttaki pulpa dokusunun açığa çıkmasına neden olur. Bu tür bir pulpa kapatma prosedürünün nihai amacı, alttaki pulpa dokusunu korumak ve dişin yaşam beklentisini ve genel ağız sağlığını artırmak için "biyolojik mühür" işlevi gören fiziksel bir bariyer olan onarıcı dentini yeniden oluşturarak pulpa yara iyileşmesini hızlandırmaktır. Bununla birlikte, pulpal yara iyileşmesi ve onarıcı dentin oluşumunun altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır.

Pulpal yara iyileşmesi ve onarıcı dentin oluşumunun in vivo mekanizmalarını daha iyi anlamak için daha önce maymunlar, köpekler ve domuzlar3-5 dahil olmak üzere birkaç hayvan kullanıldı. Bunlar arasında sıçanlar, diğer hayvanlara göre nispeten daha küçük boyutlarda olmaları, ancak dişlerinin herhangi bir teknik zorluk yaşamadan doğrudan pulpa kapatma işlemini yapabilecek kadar büyük olması nedeniyle sıklıkla kullanılmaktadır6-10. Bu hayvan modelleri, pulpa tepkilerini ve onarıcı dentin oluşumunu incelemek için insan çalışmalarına ideal alternatiflerdir. Bununla birlikte, kullanımları hücresel düzeyde gözlemsel çalışmalarla sınırlıdır ve moleküler düzeyde onarıcı dentin oluşumu sırasında nadiren mekanik içgörüler sağlarlar.

Genetik mühendisliğindeki son teknik gelişmeler, insan hastalıklarının moleküler mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için etkili olan, aşırı eksprese edilmiş veya silinmiş bir geni barındıran paha biçilmez ve vazgeçilmez araştırma araçları sağladı. Hücreye özgü bir şekilde stratejik olarak indüklenebilen farklı transgenik veya nakavt fare suşlarının sayısı, bilim camiasında sürekli olarak artmaktadır. Bu nedenle, bu farelerde pulpal yara iyileşmesi ve onarıcı dentin rejenerasyonunu incelemek, bu süreçleri moleküler düzeyde anlamamızı hızlandırmaya büyük ölçüde yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, minyatür boyutu nedeniyle bir fare dişi üzerinde pulpa kapatma prosedürü uygulamak teknik olarak zor olduğundan, farelerin kullanımı önemli ölçüde azaltılır. Burada, pulpa yara iyileşmesinin ve onarıcı dentin oluşumunun in vivo olarak değerlendirilmesi için farelerde doğrudan pulpa kapatma işleminin tekrarlanabilir yöntemini sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareleri Jackson Laboratory'den satın alındı ​​ve Deney Hayvanları UCLA Tıp Bölümü (DLAM) bir patojen içermeyen vivaryum tutuldu. Deneyler Başbakan'ın Hayvancılık Araştırma Komitesi (ARC # 2016-037) onaylanmış kurumsal kurallarına göre yapılmıştır.

1. Fare Anesthetization

  1. Sekiz haftalık dişi C57 / BL6 fareler kullanın (n = 3).
  2. ketamin (fare ağırlığı 80-120 mg / kg) / ksilazin (5 mg / fare ağırlığındaki her bir kg) çözeltileri kullanılarak fareler anestezi ve 10 ml / kg'lık bir dozda intraperitonal (ip) verilmesi.
  3. ketamin hazırlanması (80-120 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) çözeltiler ve 10 mL / kg bir dozda intraperitonal (ip) olarak onları yönetmek.
  4. fareler tamamen ayak tutam yaparak anestezi onaylayın.

2. Selüloz-kapatma İşlemi

  1. Farenin ağzına ağız tutucu yerleştirin.
  2. O böyle masada ağız yuvasını Güvenlireklam yukarı bakacak.
  3. İlk maksiller molar tamamen görünür böylece ağız üstüne mikroskobu (10X) yerleştirin.
  4. hamuru şeffaf dentin aracılığıyla görünür oluncaya kadar 200.000 rpm'de yüksek hızda piyasemene ¼ yuvarlak bur kullanarak, ortada diş minesi parçası kaldırın. bur hamuru maruz bırakmayın.
  5. Bir 15. endodontik K-dosya (150 mikron çapında) kullanılarak, dentin ile delmek ve hamuru maruz kalmaktadır.
    NOT: dentin enkaz hamuru içine itilmiş almaz böylece Özel bakım alınmalıdır. Bu üç aylık K-dosyayı dönen ve sonra dışarı K-dosya çekerek önlenebilir.
  6. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, steril H2O ile MTA karıştırın. Sunun ve kaşif ucuyla maruz hamuru üzerine MTA yerleştirin. nazik dokunarak maruz hamuru içine MTA paketi kağıt noktasının (ince) arka tarafını kullanın. Kağıt noktasının kalın tarafı düz ve bu nedenle izin verirmaruz hamuru içine MTA düzgün yoğunlaşması için.
  7. Sadece diş kapsayan% 35'lik fosforik asit pürüzlendirici koyarak 15 saniye boyunca diş etch. o dişeti dokuları tahriş edebilir gibi etchant yerleştirme sınırlamak için özel özen gösterin.
    NOT: dağlayıcı bir şırınga gelir ve diş yapıştırıcılar diş üzerine Mikromekanik bağ aracılık etmek akabilmesi için diş yüzeylerinin pürüzlendirin için kullanılır. viskoz olduğundan, kendi kendine yeten bir diş üzerine doğrudan küçük miktarlarda uygulanması ile yapılabilir.
  8. pürüzlendirici kaldırmak için negatif basınçlı emiş kullanın. Hafifçe etchant ve artıklar kaldırmak için H 2 O ile ıslatılır pamuk bir pelet kullanın. dağlayıcı tamamen diş kaldırılana kadar bu adımı tekrarlayın.
  9. bir sıkıştırılmış hava silgi kullanarak, yavaşça diş kurutun.
  10. Kağıt noktasının ters kullanarak diş yapıştırıcıları uygulayın.
  11. 3 saniye basınçlı hava kullanılarak yapışkan tabaka ince olun.
  12. Cure kür ışık birimini kullanarak 20 saniye boyunca diş yapıştırıcılar.
  13. MTA ile kapaklandı diş üzerine küçük miktarlarda akışkan kompozit yerleştirin. diş oluklarına içine kompozit akmaya explorer ucu kullanın.
  14. Bunu polimerize bir ışıkla sertleşen birimini kullanarak 30 saniye boyunca kompozit Cure. Kompozit tam kürünü ve sert explorer kullanarak doğrulayın.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Hemen kağıt hamuru kapatma işleminden sonra karprofen (5 mg / kg) deri altından (sc) uygulayınız.
  2. Onlar uyanmadan sıcak hayvanları tutmak için düşük güçte bir ısıtma pedi üzerinde fareler yerleştirin.
  3. konut vivari fareler dönün.

4. Doku Alımı

  1. 5 sonra - 6 hafta, izofluran ile tam bir anestezi koşulları altında servikal dislokasyon ile farelerin euthanize.
  2. Dikkatle kafatasının tabanından maksilla çıkarın ve 50 ml tüp içine koydu. entir Fixgece boyunca 4 ° C 'de, kağıt hamuru başlıklı diş ve PBS içinde% 4 paraformaldehid, pH 7.4 içinde karşı sınırlanmamış diş hem de içerir, ve daha sonra% 70'lik bir etanol çözeltisi içinde saklayın e maksilla.
    NOT: Paraformaldehyde toksik ve kanserojen olduğunu. standart operasyon prosedürleri (SOP) 'de belirtildiği gibi doğru kullanımı paraformaldehit izlenmelidir.
  3. uCT tarama kullanarak fare maxillae tarayın. % 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile örnekleri sarın ve 15 ml hücre kültürü tüp koyun, tarama sırasında maxillae güvenceye almak için.

5. uCT Tarama

  1. uCT tarama için numune hazırlayın. Kısaca,% 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile örnekleri sarın ve bir jenerik 15 ml hücre kültürü konik tüp sabitleyin. üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi, uCT tarama sahneye tüp monte edin.
  2. 145 uA bir akıma, 55 kVp bir gerilim ve 2 bir pozlama süresi X-ışını kaynağı Set00 ms.
  3. 20 mikron çözünürlükte ve 0.5 mm Al filtre ile uCT tarayıcı ile görüntü elde etme gerçekleştirin.
  4. Görüntüyü yeniden ve 11 görselleştirmek.
  5. uCT Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, 2 hafta içinde% 5 EDTA ve PBS içinde% 4 sakroz (pH 7.4) dekalsifikasyon başlar.

6. Doku İşleme ve Boyama

  1. parafin dekalsifiye dokuları gömün. gömmeden önce, hemen birinci molar için ön bir sagital kesim yaparak maksilla kırpın. gömme birlikte, birinci molar uzunlamasına kesit kesme yüzeyi olacak şekilde, aşağı doğru, bu yüzey yerleştirin.
  2. mikrotom kullanılarak, 5 mikron kalınlığında slaytlar hazırlamak. kağıt hamuru sınırı alanlar genellikle bir dönüm noktası olarak kullanılabilir distopalatal (DP) kök ile örtüşmektedir. Işık mikroskobu altında histoloji incelenmesi ve uCT görüntüleri karşılaştırarak ilgi belirli bir bölgede tespit.
  3. H & E boyama, depara içinffinize ve ksilen (2x) ve seri olarak seyreltilmiş, etanol (% 100 EtOH 2x,% 95 EtOH 2x,% 70 EtOH 1x) ile slaytlar rehidrate.
  4. akan musluk suyu ile slaytlar durulayın.
  5. 2.5 dakika boyunca Hematoksilen çözümü ile Leke ve musluk suyu ile durulayın.
  6. 1 dakika boyunca% 95 etanol içinde slaytlar batırın.
  7. 1 dakika süreyle Eosin çözeltisi ile Leke musluk suyu ile yıkayın.
  8. seri olarak seyreltilmiş, etanol (% 70 EtOH 1x,% 95 EtOH 2x,% 100 EtOH 3x) ve ksilen (3x) ile kurutmak.
  9. montaj çözümü ile slaytlar monte edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fareler dişlerde pulpa kaplama gerçekleştirmek için adım adım uygulandığını göstermiştir. Farelerde kapatma hamuru önemli yönlerinden biri uygun cihazı sahip olmaktır. Bu bağlamda, 10X güç büyütme ile mikroskop olan esas (Şekil 1A) 'dir. Diş Sınıf-I-benzeri hazırlık oluşturmak için, biz 200.000 rpm (Şekil 1B) bir elektrik yüksek hızda piyasemene bir ¼ tur çapak kullanılır. Seçenek olarak ise, basınçlı hava kullanımı da dahil olmak üzere başka her...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şu anda, dental pulpa kök hücrelerin (DPSCs) 13 odontojenik farklılaşma dental materyaller, iskeleler, ya da büyüme faktörlerinin in vivo etkilerini doğrulamak için birkaç farklı deneysel model vardır. Bu modeller gibi böbrek kapsül gibi bir organ DPSCs ektopik otolog transplantasyon, ya da iskeleler 14,15 ile immün sistemi baskılanmış farelere DPSCs deri altına nakli sayılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler DPSCs üzerindeki odontojenik etkisi ortotopik hamur ortamında gerçekleştirilmez...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIDCR / NIH R01DE023348 (RHK) ve University of California, Los Angeles Bölümü Akademik Senatosu Araştırma Konseyi Fakültesi Araştırma Bursu (RHK) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED stereo mikroskopMEIJI TeknoMikroskop 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Elektrikli motor motoru
izofluranHenry schein hayvan sağlığıNDC 11695-0500-2
1/4 yuvarlak frezBrasseler001092T0
Endodontik K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Kağıt noktasıHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent ürün A.Ş.Fosforik asit aşındırıcı
OptiBond SoloPlusKerr29669Yapıştırıcılar
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Kürleme ışık ünitesi
Karakterizasyon renk tonuBiscoT-14012Akışkan kompozit
SkyscanBreuker1275uCT tarayıcı
MicromThermoHM355SMikrotom
Hematoksilin-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Montaj çözümü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles