Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Deneysel ve Sonlu Eleman Protokolü Eklem Kıkırdak genelinde Nötr ve Yüklü Çözünenlerin Ulaştırma Araştırma

5.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54984

⸱

23 Nisan 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biomechanical Engineering, Faculty of Mechanical, Maritime, and Materials Engineering, Delft University of Technology (TU Delft), 2Department of Orthopedics, UMC Utrecht, 3Department of Rheumatology, UMC Utrecht

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Geçenlerde geliştirilen deneysel ve sayısal yöntemlerin yardımıyla eklem kıkırdağının genelinde Yüklü ve yüksüz moleküllerin taşınmasını araştırmak için bir protokol öneriyoruz.

Özet

Osteoartrit (OA) kıkırdak ve kondral kemik dejenerasyonu ile ilgili olan bir zayıflatıcı bir hastalıktır. Bu büyük bir kimyasal bozunma örneğin, proteoglikan kaybı ve kolajen fibril bozulmasını karşılaşır olarak eklem kıkırdağı dejenerasyonu ölçüde yük taşıma işlevini bozar. OA sırasında kimyasal zarar mekanizmalarını incelemek için ümit verici bir yol, bir dış çözünen kıkırdak örnekleri ortaya çıkarmak ve moleküllerin difüzyon izlemektir. Sağlıklı kıkırdağa kıyasla farklı difüzyon özelliklerine oluşturur eklem kıkırdağı üzerinde hareket ederken, kıkırdak hasarı (örneğin, konsantrasyon ve temel makromoleküllerin konfigürasyonunda) derecesi dış solutların çarpışma enerji kaybı ile ilişkilidir. Bu çalışmada, çeşitli adımlardan oluşur ve daha önce geliştirilen deneysel mikro C dayanan bir protokol, tanıtmak14px; "> omputed T omography (mikro-CT) ve sonlu eleman modeli ilk olarak iki fazlı-çözünen ve difüzyon katsayılarını elde etmek için çok fazlı sonlu eleman modelleri üzerine tatbik edilmesi izler mikro-CT, kullanılarak kaydedilir yüklenmiş ve yüklenmemiş iyotlu moleküllerin taşınması. ve kıkırdak dilimleri arasında yük yoğunlukları sabit.

Giriş

Moleküler taşıma dile eklemlerin homeostazı hayati bir rol oynar, artiküler tedavilerin teslim kıkırdak ve kontrastlı kıkırdak görüntüleme 1, 2, 3. Bu tür kıkırdak entegrasyonu ve eksiklik, çözünen yük ve boyut olarak osmolalitesi ve nakil oranı 4, 5, 6 etkileyebilir kıkırdak ile temas içinde banyo konsantrasyonu gibi faktörler. Her bölge farklı konsantrasyonlarda ve büyük ekstrasellüler matris moleküllerin yönelimlerinin oluşur, çünkü nötr ya da yüklü, ya çözünen, nakliyesi, eklem kıkırdağı bölgeleri arasında farklı olabilir, yani proteoglikanlar (PG) ve kollajen tip II, 1, 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, 11. Daha da önemlisi, yüklü çözünen taşıma eklem kıkırdağının 8, 9 boyunca artar hücre dışı matris içinde negatif sabit yük ihtiva proteoglikanlar konsantrasyonuna büyük ölçüde bağlı olabilir. Osteoartrit (OA), böylece kıkırdak boyunca difüzyonu çalışmanın önemini gösteren, ilerledikçe Bu parametreler özellikle de sabit yük yoğunluğu (FKH), kolajen fibrilleri ve kıkırdak arasında su içeriği varyasyon yönünü değişiklik olabilir.

Bu çalışmada, bir protokol 6, 8, 9 doğru difüzyon sonlu banyosu modelinde nötr ve yüklü çözünen maddeleri kullanılarak çeşitli sınır şartları altında difüzyon araştırmak için önerilmektedir daha önce kurulmuş deney ve bilgisayar çalışmalara dayanmaktadır. To yöntemler kıkırdak ve gelişmiş iki fazlı-çözünen ve çok fazlı sonlu eleman modelleri ile desteklenen bir sonlu banyosunda içeren bir sistemin, mikro-bilgisayarlı tomografi görüntüleme (mikro-CT) oluşmaktadır önerilmiştir. Bu modeller, eklem kıkırdağının çeşitli dilimleri arasında nötr ve yüklü moleküllerin yanı sıra FCDs difüzyon katsayılarını elde etmek sağlar. bu modelleri kullanarak, bir kıkırdak ve bindirilirken sonlu banyosu arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir difüzyon nötr ve yüklü moleküllerin davranışlarının daha iyi anlayabilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Burada sunulan protokol son araştırma makaleleri 6, 8, 9, deneysel ve hesaplamalı prosedürlerden benimsenmiştir. Protokol, Şekil 1 'de gösterilmektedir.

kadavra malzemeler Utrecht Üniversitesi Veteriner fakültesi izniyle toplanmıştır.

1. Numune ve Banyo Hazırlama

  1. Serin fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) püskürtme sırasında aşırı ısınma ve daha sonra kıkırdak hasarı önlemek için ölçüye göre matkap ucu (Şekil 1) kullanılarak kadavra at femoral kondil silindirik osteokondral tapaları (8.5 mm çap) delin.
  2. üst üste bindirilmiş banyosunun yanal yayılmanın en aza indirmek için kılıfı küçülen bir plastik ile osteokondral fişleri Termo büzülme.
    1. th kıkırdak ile osteokondral fiş monteE plastik küçülen yen içinde başlangıçta üst ve ona sıcak hava üfleyerek uygulayın. ısıyla ilgili zarar görmesini önlemek için kıkırdağın yüzeyinde ıslak pamuk parçaları ekleyin.
  3. Ayrıca yüklü (örneğin, 650 uL, 420 mM, iyoksaglat, Molekül Ağırlığı (MA) = 1.269 Da, şarj = 1) ve nötr (650 uL, 420 mM, iyodiksanol, MW = 1,550 Da), çözünen sonlu banyoları hazırlayın.
  4. Bir şırınga kullanılarak kıkırdak yüzeyinde hazırlanmış sonlu banyoları yük ve oda sıcaklığında (Şekil 2A) ile deneyler sırasında buharlaşmasını önlemek için sarılmış örnek üzerinde mantar fiş yerleştirin. nötr solüt taşınmasını araştırmak üzere iodixanol banyosu yerleştirin ve kıkırdak yüzeyine negatif yüklü çözünmüş madde taşıma yeri iyoksaglat banyosu incelemek için.

2. Görüntüleme ve Görüntü İşleme

  1. bir mikro-CT motorlu aşamasına bağlı bir ölçüye tutucu üzerinde mantar tapa ile izole sarılmış numuneler. Yeri to kadar kontrast maddesi çözeltisi yukarı bakacak şekilde kaplı olduğu bir kıkırdak yüzey örnek.
  2. Mikro-BT (40 x 40 x 40 um 3 voksel, 2 dakika tarama süresini, 90 kV tüp voltajı ve 180 uA tüp akımı) kıkırdak, subkondral plakadan oluşan bir görüş alanını kullanarak tarama ve sonlu denge durumuna (48 saat kadar) bir kaç zaman noktasında banyo (Şekil 2A) ulaşılır. konsantrasyon değerleri zamanla değişmez zaman denge durumuna ulaşılır.
  3. Üreticinin yazılımını kullanarak İlgi (ROI) Bölge konumlandırılmasını kolaylaştırmak için ilk resme göre farklı zaman noktalarında 3D görüntüler Kayıt (örneğin Analiz).
  4. Dönüştürme 3D üreticinin yazılımını kullanarak bunları işleme önce 2B Tagged Image File Format (TIFF) yığını haline mikro-BT görüntüleri yeniden.
  5. Küresel segmentin (ImageJ> ayarlama> Eşiği) subkondral kemik ve kıkırdak yerindenyazılımda banyosu yalan.
  6. Farklı zaman noktalarında kıkırdak ortalama gri değeri elde edilir önceki adımda oluşturulan kıkırdak maskesi kullanarak (ImageJ>> ölçün analiz).
  7. kıkırdak ilk banyo konsantrasyonu ve ilk kontrast maddesi konsantrasyonu dikkate alındığında, çözünen maddelerin gerçek konsantrasyonu ortalama gri değerleri dönüştürmek için lineer kalibrasyon eğrisi kullanır. Önceki veriler, gri değerler kontrast ajanlarının konsantrasyonu ile doğrusal bir ilişki muhafaza gerçeğini destekler.
  8. Deneysel zaman noktalarında karşı çözünen madde konsantrasyonunu çizilir.

3. Sayısal Modelleme

NOT: Bu problemde difüzyon deneysel sınır koşulu ile uyumludur (z ekseni boyunca) 1D gerçekleşecek varsayılır. Bu nedenle, geometri keyfi oluşturulabilir.

  1. Sonlu banyosu göre kıkırdak çoklu bölge modelini oluşturmak: 1) Kıkırdak yüzeysel bölgesi oluşan (Toplam kıkırdak kalınlığının% 20), orta bölge (toplam kıkırdak kalınlığının% 50) ve derin bölge (toplam kıkırdak kalınlığının% 30) 12 ve FEBio 13, 14 (Şekil 2B 2) sonlu banyosu).
  2. FEBio kıkırdak ve banyo farklı bölgeleri, mekanik ve fiziksel özellikleri atamak. Young modülü (10 MPa) üstte banyosu ile uygulanan ozmotik basınca dayanıklı ve bu nedenle aşırı deformasyonlar kıkırdak korumak için yeterince yüksek olduğu varsayılmıştır.
    1. 10 -3 mm bir hidrolik geçirgenliği kullanım 4 / Ns ve simülasyonlar 8 banyo 0 kullanımı gerçek çözünen yayılma katsayısının Poisson oranı, 9.
  3. Örgü (8-düğüm trilinear altı yüzlü elemanları) oluşturmak ve sınırların yakın hassaslaştırmada (Şekil 2B)class = "xref"> 8, 9.
  4. Bifazik-çözünen modeli
    1. buna tekabül eden banyo ve etkili bir basınç ilk bir eriyen madde konsantrasyonuna uygulanır. 15 9'da etkili basıncın açıklamaya bakın.
    2. Farklı kıkırdak bölgelerinde öngörülen difüzyon katsayılarına göre zaman eğrileri çözünen konsantrasyonunu elde etmek için geçici bir modda modeli çalıştırın.
  5. multifazik modeli
    Not: banyo ve doku arasındaki elektrik dalgalanma banyo ve doku hem de iki tek değerli karşıt-iyonlar eklenerek atlatılabilir.
    1. kararlı durum modeller için: istenen değere FCD artırırken kıkırdak ve üstte uzanan banyosu içinde aynı etkili sıvı basınçları ve konsantrasyonları kullanır.
    2. Geçici modeller için: yeterince yüksek banyosunda çözünmüë difüzyon katsayısını tutarak iyice karıştırılmış sonlu banyosu oluşturun. enjekte etmekbanyosuna banyo hava arayüzünden çözünen istenen konsantrasyon değerine ulaşmak için.
    3. Geçici: Önceki adımda reçete solüt konsantrasyonu sınır koşulu kaldırıp gerçek difüzyon katsayısına sonlu banyosu difüzyon katsayısını dönmek.
    4. Farklı kıkırdak bölgelerde uygulanan FCDs ve difüzyon katsayılarına göre çözünen konsantrasyonu-zaman eğrilerinin elde edilmesi için bir model çalıştırın.
  6. FEBio-MATLAB arayüzü
    1. Otomatik FEBio ve arsa konsantrasyonu-zaman eğrilerinin (FEBio-MATLAB arayüzü) 8, 9, simülasyon gerçekleştirmek için bir MATLAB geliştirir.
    2. FEBio-MATLAB arayüzünü kullanarak kıkırdak bölgelerinde difüzyon katsayıları ve FCDs değiştirin. FEBio modelleri çalıştırın ve çözünen konsantrasyonu-zaman eğrilerinin 9 8 ekstrakte edin.
    3. Deneysel elde çözünen konsantrasyonu-zaman eğrileri karşılaştırMinimum kök göre farklı kıkırdak bölgelerinde veriler ve elde difüzyon katsayılarının setleri ve FCDs kare hata (RMSE) 8, 9 anlamına gelir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Deney Düzeneği. A), ısmarlama bir matkap ucu yardımıyla örnek ekstraksiyon prosedürü. B) Mikro-BT görüntüleme prosedürü difüzyon sürecini izlemek üzere. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Şematik.A) Deney tasarımı. Sonlu banyo, kıkırdak ve bunlarla ilgili örgü yüzeysel, orta ve derin bölgelerde oluşan B) Çok bölgeli hesaplama modeli. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sağlanan temsili sonuçları önceki araştırma makaleleri 6, 8, 9, 16 ile kabul edilmiştir.

OA olarak, eklem kıkırdağı önemli değişiklikler en önemlisi GAG kaybı ve kolajen fibril hasar 17, 18, 19 girer....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz eklem kıkırdağı boyunca nötr ve yüklü çözünenlerin difüzyon çalışması için bir sonlu elemanlar modelleme prosedürü ile kombine deneysel protokol sundu. Son çalışmalara göre, önerilen modeller doğru eklem kıkırdağında 8, 9 farklı bölgeleri arasında nötr (bifazik-çözünen) her ikisinin de taşıma ve negatif yüklü (çok fazlı) çözünmüş tarif olabilir. Yaygın eklem kıkırdağı işlevsel böyle OA ilerlemesi 21, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar osteokondral fişler sürecini sarma katkılarından dolayı UMC Utrecht de gelişme mekaniği grubundan Sn Jeroen van den Berg ve Bay Matthijs Wassink minnettarlıklarını ifade etmek istiyorum. Bu çalışma Hollandalı Artrit Vakfı tarafından Grant tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HexabrixGuerbet15HX005DNegatif yüklü kontrast madde
VisipaqueGE healthcare12570511Nuetral kontrast madde
PBS (Fosfat tamponlu Salin)Yaşam teknolojileri10010023Orta
mikro-CTPerkin ElmerDifüzyonun izlenmesi
Donma noktası ozmometresiGelişmiş AletlerÖlçüm çözeltisi ozmolalitesi

Kaynaklar

  1. Arkill, K. P., Winlove, C. P. Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).
  2. Chin, H. C., Moeini, M., Quinn, T. M. Solute transport across the articular surface of injured cartilage. Arch Biochem Biophys. 535 (2), 241-247 (2013).
  3. Leddy, H. A., Guilak, F. Site-specific effects of compression on macromolecular diffusion in articular cartilage. Biophys J. 95 (10), 4890-4895 (2008).
  4. Leddy, H. A., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Annals of Biomedical Engineering. 31 (7), 753-760 (2003).
  5. Gu, W. Y., Yao, H. Effects of hydration and fixed charge density on fluid transport in charged hydrated soft tissues. Ann Biomed Eng. 31 (10), 1162-1170 (2003).
  6. Pouran, B., Arbabi, V., Zadpoor, A. A., Weinans, H. Isolated effects of external bath osmolality, solute concentration, and electrical charge on solute transport across articular cartilage. Medical Engineering and Physics. 38 (12), 1399-1407 (2016).
  7. Kulmala, K. A. M., et al. Diffusion coefficients of articular cartilage for different CT and MRI contrast agents. Medical Engineering & Physics. 32 (8), 878-882 (2010).
  8. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of Neutral Solute Across Articular Cartilage: The Role of Zonal Diffusivities. Journal of Biomechanical Engineering. 137 (7), 071001-071001 (2015).
  9. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. J Biomech. 49 (9), 1510-1517 (2016).
  10. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined artificial neural networks for robust estimation of the diffusion coefficients across cartilage. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
  11. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined inverse-forward artificial neural networks for fast and accurate estimation of the diffusion coefficients of cartilage based on multi-physics models. Journal of Biomechanics. , (2016).
  12. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  13. Holzapfel, G. A., Kuhl, E. Ch. 17. Computer Models in Biomechanics. , Springer. Netherlands. 231-249 (2013).
  14. Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Multiphasic Finite Element Framework for Modeling Hydrated Mixtures With Multiple Neutral and Charged Solutes. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (11), 111001-111001 (2013).
  15. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of neutral solute across articular cartilage and subchondral plate. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
  16. Pouran, B., Arbabi, V., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of multiphysics models to efficient design of experiments of solute transport across articular cartilage. Comput Biol Med. 78, 91-96 (2016).
  17. Hosseini, S. M., Wu, Y., Ito, K., Donkelaar, C. C. The importance of superficial collagen fibrils for the function of articular cartilage. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 41-51 (2013).
  18. Alexopoulos, L. G., Williams, G. M., Upton, M. L., Setton, L. A., Guilak, F. Osteoarthritic changes in the biphasic mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix in articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (3), 509-517 (2005).
  19. Felson, D. T., et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: the disease and its risk factors. Ann Intern Med. 133 (8), 635-646 (2000).
  20. Kokkonen, H. T., Jurvelin, J. S., Tiitu, V., Toyras, J. Detection of mechanical injury of articular cartilage using contrast enhanced computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 19 (3), 295-301 (2011).
  21. Raya, J. G., et al. Diffusion-tensor imaging of human articular cartilage specimens with early signs of cartilage damage. Radiology. 266 (3), 831-841 (2013).
  22. Tavakoli Nia, H., et al. Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties. ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).
  23. Arbabi, V., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Estimation of cartilage properties using indentation tests, finite element models, and artificial neural networks. 11th World Congress on Computational Mechanics & 5th European Conference on Computational Mechanics, Barcelona, Spain, , (2014).
  24. Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks. Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).
  25. Kokkonen, H. T., et al. Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).
  26. Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage. Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).
  27. Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro. Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).
  28. Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).
  29. Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).
  30. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

z nen Ta n mMikro BT G r nt lemeSonlu Elemanlar ModellemesiDif zyon Katsay sSabit Y k Yo unlu uBifazik z nen Modeliok Fazl ModelN tr z nenler
Deneysel ve Sonlu Eleman Protokolü Eklem Kıkırdak genelinde Nötr ve Yüklü Çözünenlerin Ulaştırma Araştırma
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.