X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Özet

Burada, insan lökosit antijenleri tarafından sunulan T hücresi reseptörü ve tümör antijenleri arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz; bu yöntemler arasında protein üretimi, X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel T-hücresi deneyleri yer alır.

Özet

İnsan CD8+ sitotoksik T lenfositlerinin (CTL'ler) tümör kontrolünde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bu işlevi yerine getirmek için, hücre yüzeyinde eksprese edilen T hücresi reseptörü (TCR), insan lökosit antijeni (HLA) ile sınırlı tümör türevli peptitleri (pHLA) işlevsel olarak tanımalıdır. Bununla birlikte, biz ve diğerleri, çoğu TCR'nin tümör antijenlerine optimal olmayan bir şekilde bağlandığını göstermiştir. Bu zayıf tanımayı tanımlayan moleküler mekanizmaların ortaya çıkarılması, bu eksiklikleri gideren yeni hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Gerçekten de, bu moleküler anlayıştan yoksun olan mevcut tedaviler evrensel olarak etkili olmamıştır. Burada, TCR'ler ve pHLA arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz. Bu yöntemler, çözünür TCR'lerin ve pHLA'nın üretilmesini ve bu reaktiflerin X-ışını kristalografisi, biyofiziksel analiz ve pHLA multimerleri ile antijene özgü T hücresi boyaması için kullanılmasını içerir. Bu yaklaşımları kullanarak ve yapısal analizin rehberliğinde, TCR'ler ve pHLA arasındaki etkileşimi değiştirmek ve daha sonra bu modifikasyonların T hücresi antijen tanımayı nasıl etkilediğini test etmek mümkündür. Bu bulgular, bir dizi kanser antijeninin T hücresi tanıma mekanizmasının açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olmuştur ve yeni kanser tedavileri için değiştirilmiş peptitlerin ve modifiye TCR'lerin geliştirilmesini yönlendirebilir.

Giriş

X-ışını kristalografisi olmuştur ve ligand-reseptör etkileşimleri doğasını anlamak için son derece güçlü bir tekniktir olmaya devam edecektir. atomik ayrıntılı olarak bu etkileşimleri görselleştirerek, sadece mümkün birçok biyolojik süreçleri düzenleyen moleküler mekanizmaları açıklamaya, ama doğrudan terapötik fayda irtibat arayüzleri değiştirmek de mümkündür. Bu tür yüzey plazmon rezonansı ve (isim sadece bir çift) izotermal titrasyon kalorimetri gibi teknikler ile birleştiğinde, bu tür değişiklikler daha sonra bağlanma afinitesi, etkileşim kinetik ve termodinamik doğrudan etkisini değerlendirmek için biyofiziksel analiz edilebilir. Son olarak, ilgili hücre tipleri üzerinde fonksiyonel deneyler yaparak, reseptör-ligand etkileşimleri değişiklikler moleküler ve fonksiyonel etkisi ayrıntılı bir resim çok özel mekanik bilgi veren, toplanan olabilir. Genel olarak, yöntemler bu tür caydırmak sağlayan bir atomik çözünürlükte görüntü elde tanı ve tedavi gelişmeler için görevli etkileri olan, nasıl çalıştığını, biyolojik sistemleri ermesi.

Laboratuvarımız rutin otoimmünite, patojenler ve kansere insan T-hücresi bağışıklık aracılık reseptörleri incelemek için bu teknikleri kullanır ve nakli sırasında. Burada, T-hücresi reseptörü (TCR) ve insan lökosit antijeni (HLA) -restricted tümör kaynaklı peptid (pHLA) arasındaki etkileşim aracılık ettiği kanseri insan CD8 ⁺ T-hücresi yanıtı, odak. CD8 ⁺ T hücreleri, kanser hücrelerini hedeflemek için mümkün olsa da, ve diğerleri, daha önce bir anti-kanser TCRler Optimal kendi aynı kökenli pHLA ^{1, 2} bağlanan göstermiştir, çünkü bu önemlidir. Bu nedenle, bir çok laboratuar değiştirme girişiminde ya TCR ^{3, 4, 5} ya da peptid bağ ^6,bağışıklık artırmak amacıyla daha iyi hedef kanserli hücrelerin sınıf = "xref"> ^{7, 8.} Ancak, bu yaklaşımlar her zaman etkili değildir ve hedef dışı toksisite ^{4, 9, 10} de dahil olmak üzere ciddi yan etkileri olabilir. Kanser antijenleri T-hücre tanıma yöneten moleküler mekanizmaları keşfetmek daha fazla araştırma bu eksiklikleri aşmak için önemli olacaktır.

Bu çalışmada, en yaygın * 0201 (HLA-A tarafından sunulan 100 (gp100) glikoprotein farklılaşma melanosit antijenin bir parçası için spesifik CD8 ⁺ T hücreleri ile otolog melanoma hücrelerine karşı tepkiler, gp100 _280-288, odaklanmış eksprese insan pHLA sınıfı I). Bu antijen, melanom immünoterapisi için çok çalışılan hedef olmuştur ve valin, alanin yerine olan bir sözde "heteroklitik" peptit olarak geliştirilmiştirçapa 9 konumundaki pHLA istikrarı ¹¹ artırmak için. Bu yaklaşım, in vitro melanom reaktif CTL 'lerin indüksiyonunu arttırmak için kullanılmış ve başarılı klinik çalışmalarda ¹² kullanılmıştır. Bununla birlikte, peptid kalıntılarına modifikasyonlar klinik ^{6, 13} en heterolitic peptidlerin zayıf etkinlik gösterdiği T-hücresi özgüllüğü, öngörülemeyen etkileri olabilir. Gerçekten de, Glu3 Ala ile ikame edildiği, peptit kısımsını gp100 _280-288 diğer heteroklitik şekilde, gp100 _280-288 özgü T hücreleri ^{14, 15} bir poliklonal nüfus tarafından tanınması iptal etmiştir. Daha önce peptid bağlantı kalıntılarının küçük değişikliklere bile hemen hemen tahmin edilemeyecek bir şekilde ^{6, 16} T-hücresi tanımayı değiştirebileceğini gösterdi. Böylece, çalışma yapı üzerinde durulduCD8 ⁺ T hücreleri TCRler ve pHLA arasındaki etkileşimin gp100 ve nasıl modifikasyonları fark ne ilişkin daha ayrıntılı bir görüntü ing bu işlevi etkileyebilir.

Burada, HLA-A * 0201 (A2-yle) tarafından sunulan gp100 _280-288 özgü iki TCRlerin son derece saf, çözünür formları, yanı sıra pHLA doğal ve değiştirilmiş formları üretilir. Bu reaktifler heteroklitik A2-YLE şeklinde, hem de bağlanmamış formda mutan pHLAs iki ile kompleks olan bir insan TCR üçlü atom yapısını çözmek protein kristallerinin üretilmesi için kullanılmıştır. Daha sonra derinlemesine biyofiziksel deneyler yaparak TCR'lerinin peptit değiştirmelerin etkisini göstermek için bir peptit tarama yaklaşımı kullanılır. Son olarak, genetik olarak modifiye edilmiş CD8 + T hücre soyu elde çeşitli peptid değişiklikler biyolojik etkilerini test etmek fonksiyonel deneyler için, A2-yle özgü TCRlerin bir ifade yeniden programlanabilir. Bu veriler bile Modi ortaya koymaktadırfications öngörülemeyen vuruş on TCR bağlanması ve T-hücre tanıma iptal bitişik peptid artıkları üzerindeki etkileri olabilir TCR bağlanma motifi dışındaki kalıntılarını peptid. Bulgularımız melanom için bu önemli terapötik hedefin T-hücre tanıma altında yatan yapısal mekanizmaların ilk örneğini temsil etmektedir.

Protokol

1. Protein Ekspresyonu

1. Daha önce ^{17, 18} ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, çözünür TCRlerin ve pHLAs üretimi için gen yapılarını yapmak. bir 5 'BamH1 ve bir 3' pGMT7 vektörüne sokulması için EcoR1 kısıtlama sahası ile inşa her tasarım.
2. 4 ° C'de 50-200 ng / 5 dakika boyunca E.coli 5 uL uL plazmid 1 uL inkübe edilerek ilgili proteini kodlayan sekansı ihtiva eden bir pGMT7 türetilmiş plazmit vektörü ile E.coli Rosetta (DE3) pLysS Transform 42 ° C'de 2 dakika ve 4 ° C'de 5 dakika ve 50 mg / L karbenisilin ile desteklenmiş LB agar plakası üzerinde 37 ° C'de gece boyunca plaka.
3. Bireysel koloniler ve süspansiyon kadar 100 uM karbenisilin ile desteklenmiş 37 ° C ve 220 rpm'de 30 ml TYP ortam içinde (16 g / L tripton, 16 g / L maya ekstresi, 5 g / L HK ₂ O ₄₎ büyümesine optik DE ulaşırnsity 0.4 ila 0.6 arasında (OD _600).
4. 3 saat boyunca, 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) verilmesi ile 5 ml kısım protein üretimini uyarmaktadır. ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz için uyandırılmadan süspansiyon 20 uL tutmak ve jel leke.
5. 100 uM karbenisilin ile desteklenmiş TYP 1 L başlatıcı kültürler ekleyin ve süspansiyon 0.4 ila 0.6 arasında bir OD ₆₀₀ ulaşıncaya kadar adım 1.3 tarif edildiği gibi hücreler büyür.
6. 0.5 mM IPTG ile 3 saat boyunca protein ifadesi neden. 3,000 x g'de 20 dakika boyunca hücreleri Santrifüj ve dikkatli süpernatant dökün.
7. Bir 2 s aralığı kullanılarak 30 dakika ila 60% 'si güç için, buz üzerinde sonikasyon liziz tamponu 40 mL pelet çözülür (% 10 gliserol, 10 mM magnezyum klorür, _MgCI2, 150 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8.1) ve 0.1 g / L DNaz ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
8. sus tedaviYıkama tampon maddesi 100 mL inklüzyon cisimcikleri (IB) 'şeklindeki proteinleri içeren emekli (% 0.5 Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8.1; 100 mM NaCI; 10 mM EDTA).
9. 4 ° C'de 20 dakika ve 8000 x g'de santrifüj numunenin ve dikkatli bir şekilde Süpernatantı dökün. yeniden süspansiyon tamponu 100 ml pelet askıya-Re (100 mM NaCI, 50 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA, pH 8.1 ve 10), bir santrifüj daha önce olduğu gibi 8000 xg, ve dikkatli bir şekilde Süpernatantı dökün.
10. Son olarak, guanidin tampon maddesi 10 mL pelet çözülür (6 M guanidin, 50 mM Tris, pH 8.1; 2 mM EDTA, pH 8.1; 100 mM NaCI) ve bir spektrofotometre kullanılarak 280 nm'de protein konsantrasyonu ölçülür.

2. pHLA ve TCR tekrar katlanması

1. pHLA refolds için, bir son hacim içinde, bir su banyosu içinde 37 ° C 'de IBS (bir biyotin etiketi ya da HLA-A2) β2m IB, 30 mg ve 30 dakika süre ile 4 mg peptit, HLA-A2 30 mg karıştırın 10 mM ditiotreitol ile takviye edilmiş guanidin tamponu 6 mL(DTT).
2. önceden soğutulmuş bir HLA yeniden katlama tamponu, 1 L önceki karışımı seyrelterek, protein yeniden katlaması başlatma (50 mM Tris, pH 8.1; 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA, pH 8.1, 6 mM sisteamin ve 4 mM sistamin).
3. HLA 3 saat boyunca 4 ° C de karıştırılarak yeniden katlama ve daha sonra bir 12.4 kDa'lık bir MWCO halinde (molekül ağırlığı kesme) diyaliz tüpü transfer 10 mM Tris, pH 8.1 20 L karşı 24 saat boyunca iki kez diyaliz bırakın.
4. TCR refolds için, 10 mM DTT ile takviye edilmiş guanidin tamponu 6 mL bir su banyosu içinde 37 ° C 'de 30 dakika süre ile TCR α zinciri IB, 30 mg ve TCR β zinciri IB, 30 mg karıştırın.
5. önceden soğutulmuş bir TCR yeniden katlama tamponu 1 L denatüre TCR karışımını, protein yeniden katlaması başlatma (50 mM Tris, pH 8.1; 2.5 M üre, ve 4 mM sistamin, 2 mM EDTA, pH 8.1;, 6 mM sisteamin) 3 h.
6. 12.4-kDa'lık bir MWCO diyaliz tüpü içine katlanan aktarın ve 10 mM Tris, pH 8.1 20 L karşı 24 saat boyunca iki kez diyaliz.
7. pHLA veya TCR ref hem Filtresaflaştırma adımları için 0.45 um'lik bir membran filtre kullanılarak yaş.

Hızlı protein sıvı kromatografi ile 3. saflaştırma (FPLC)

1. 7.9 ml üzerine süzüldü yeniden katlama preparasyonu (pHLA ya da TCR) yüklemek, 50 um anyon değişim reçine kolonu 10 mM Tris, esnek ve sezgisel kromatografi sistemi üzerindeki pH 8.1 20 mL önceden dengelenmiş.
2. (8 sütun hacmi boyunca, 10 mM Tris içinde 0-500 mM NaCl, pH 8.1), bir tuz gradyanı ile 5 ml / dak proteinini ayrıştırmak ve 1 mL'lik kısımlar toplanır.
3. birlikte ilgili proteini ihtiva eden fraksiyonlar havuzda SDS-PAGE ile, ilgilenilen proteine ​​karşılık gelen fraksiyonlar, analiz etmek ve 4.000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüjleme ile 10 kDa ile 500 uL kadar bir MWCO 20 ya da 10 kDa'lık bir MWCO 4 aşağı konsantre , flow-through atarak.
4. 24 ml boyut dışlama kromatografi kolonu üzerine 2 mL enjeksiyon döngüsü içine konsantre edildi proteini preparatları yük uygulama ile önceden dengelenmişropriate elüsyon tamponu: fosfat tamponlu salin (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCI; 3.4 mM EDTA ve% 0.005 yüzeyaktif madde), veya kristal tamponu (10 mM Tris, pH 8.1 ve 10 mM NaCI ).
5. 0.5 mL / dakika hacmi kolonu üzerinde 1 bir akış hızında proteinleri elüte; SDS-PAGE ile doğrulandı ilgili proteini ihtiva eden 1 ml'lik fraksiyonlar toplanır.
   Not: Bu yöntem çözünebilir PMEL17 TCR ve gp100 TCRler, hem de bu çalışmada kullanılan pHLAs her şekilde üretilmesi için kullanılmıştır: HLA-A * 0201 ile birlikte YLEPGPVTA (A2-yle), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1 a), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- Şekil 7A) veya YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) Analizler

1. Bir CM5 sensör çipi ¹⁹ ile donatılmış bir moleküler etkileşim analiz sistemi kullanılarak denge bağlayıcı analizi veya termodinamik analizi yapın.
2. f CM5 çip etkinleştiriniyice silinir 1: 10 uL / ​​dakika akış hızında 25 ° 'de 10 dakika boyunca 100 mM N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 400 mM 1-etil-3- (3-dimetil-propil) -carboiimide (EDC)' nin 1 karışımı C.
3. dört akım-hücrelerinde çip yüzeyine bağlama ve devre dışı bırakmak için, 1 M etanolamin hidroklorid, 100 uL kullanımı kovalent yükü yaklaşık 5000 tepki ünitesinde (10 mM asetat, 200 ug 110 ul / ml, pH 4.5) (RU) streptavidin kalan reaktif gruplar.
4. pHLA Birkaç yaklaşık 500-600 RU, 10 uL / ​​dakika yavaş bir akış hızında CM5 sensör çipine (üretici tarafından sağlanan), ticari tampon maddesi içinde ~ 1 uM, talaş yüzeyinde üniform dağılım sağlamak için.
5. 60 saniye boyunca (üretici tarafından sağlanan) ticari tamponunda 1 mM biotin ile yonga yüzeyi doyurabilecek.
6. 25 ° C'de 30 ul / dakikalık bir yüksek akış hızında ilgili akış hücreleri üzerinde çözünür TCRlerin on seri dilüsyonları enjekte edilir.
7. denge bağlama sabitini hesaplamak_(KD (e)), bir doğrusal olmayan eğri uyum (y = (P1x) / (P2 + x)) ile ²⁰ değerleri kullanarak.
   NOT: y = tepki birimleri x = analist konsantrasyonu, P1 = r _max, P2 = K _D.
8. 1 varsayarak kinetik analiz gerçekleştirin: bağlama 1 Langmuir ve yazılım paketinde ² küresel-fit algoritması kullanarak veri uyar.
9. 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C ve 30 ° C ^19: Aşağıdaki sıcaklıklarda bu yöntemi tekrarlayarak termodinamik deneyleri gerçekleştirmek.
10. Standart termodinamik denklemi (ΔG ° = -RTlnK _D) ¹⁹ kullanılarak ° ΔG hesaplamak için farklı sıcaklıklarda SPR tarafından belirlenen K _D değerleri kullanın.
    NOT: R = gaz sabiti, T K = sıcaklık, ln = doğal günlüğü.
11. ¹⁹ - Gibbs-Helmholtz denklemi (TΔS ° ΔG ° = AH) göre termodinamik parametreleri hesaplayın.
12. (Üç parametreli denklem uygun bir lineer olmayan regresyon kullanılarak sıcaklığa karşı bağlanma serbest enerjileri, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), (k) Konu Y = Sh + ΔCp * (x-298) -X * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) ^19.
    : X = ΔG ° K y = sıcaklığı.

5. İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC)

1. izotermal titrasyon kalorimetre kullanarak ITC deneyleri. şırıngaya Kalorimetre hücre ve yük 210 uM çözünür TCR'yi 30. uM pHLA enjekte edilir. 20 mM Hepes, 150 mM NaCI ihtiva eden (pH 7.4): Aşağıdaki tampon koşulları kullanın.
2. 20 TCR enjeksiyonları, 2 mcL hacmi her gerçekleştirin. Analitik yazılımı kullanarak Sh ve K _D hesaplayın.

6. Kristalleşme, Kırınım Veri Toplama ve Model Arıtma

1. Bir kristalleşme robot kullanılarak kristalleşme denemeleri yapın.
2. vap kristalleri büyürveya kristalleştirme tamponu, 60 ul (ana çözelti) ²¹ içeren bir rezervuar ile 96 oyuklu bir plaka içerisinde, kuluçka süresi, damla tekniği ile 18 ° C 'de difüzyon.
3. 10 kDa molekül ağırlıklı bir kesim santrifüjlü konsantre 3000 xg'de eğirme kristal tamponu içinde yaklaşık olarak 10 mg / ml (0.2 mM) çözünür pHLA konsantre edilir.
4. yaklaşık 10 mg / ml (0.1 mM) bir protein solüsyonu elde etmek için 1 mol oranında: CO-kompleks yapılar için, Bir 1 TCR ve pHLA karıştırın.
5. 24 saat sonra, 48 saat, 72 sonra bir mikroskop altında kristalleri için TCR ve pHLA 1 mol oranı karışımı, bir kristalizasyon robot kullanılarak kristalleştirme ekranından Her rezervuar çözeltisi 200 nL ve skor: Tek başına 200 nL pHLA eklenir, ya da 1 H ve sonra haftada bir kez.
6. El mikroskop altında cryo-döngüler onları monte edilerek hasat tek kristaller batış ve sıvı azot (100 K) saklayarak onları cryo-serin.
   NOT: Yükleme kristaller Uy biraz alırtice ve veri toplama için yeterince iyi olan kristalleri karar tecrübesi ile birlikte geliyor. Genel bir kural, daha büyük ve daha düzenli kristal, daha iyi olarak.
7. 100 K azot gazı akımı verileri toplamak
   Not: Bu veriler Elmas Işık Kaynağı (DLS) İngiltere'de ulusal sinkrotron bilim tesisinde elde edildi.
8. Her iki MOSFLM ²² kullanılarak xia2 ile yansıma yoğunlukları tahmin verileri analiz etmek ve XDS ²³ paketleri ve daha sonra SCALA veya amaçsız ²⁴ ve CCP4 paketinin ²⁵ ile veri ölçeklendirme.
9. Phaser ²⁶ kullanılarak moleküler değiştirme ile yapıları çözün.
10. Coot ²⁷ modelini ayarlayın ve REFMAC5 ²⁸ modeli rafine.
11. Pirol ²⁹ ile grafik temsilleri hazırlayın.
12. "Temas" seçeneğini kullanarak kişileri hesaplayınCCP4 paketinde programı. Van der Waals kişiler için 4 Å kesme ve hidrojen bağları ve tuz köprüleri için 3.4 Å cut-off kullanın.
13. CCP4 paketinde "SC" programını kullanarak yüzey tamamlayıcılık hesaplayın.
14. ³⁰ tarif edildiği gibi, TCR-kompleksinin pHLA kesişme açısı hesaplanır.
    NOT: Bu çalışma için, yansıma verileri ve son modeli koordinatları PDB veritabanı tevdi edilmiştir (PMEL17 TCR-A2-yle-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-yle-3A PDB: 5EU4 ve A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak, CD8 ⁺ T hücreleri tarafından derinlemesine gp100 _280-288 tanıma moleküler analizler yapmak için çözünür TCR'yi (Tablo 1) ve pHLA molekülleri üretilir. Bir tadil edilmiş E. coli sentezleme sistemi TCRler (α ve β zincirleri) ve pHLAs (α zinciri ve β2m) her ikisinin de, her bir ayrı zincir için çözünmeyen IBler üretmek için kullanıldı. Bu yöntem kurmak için nispeten ucuz ve kolay olma avantajına sahiptir ve protein büyük verim (kültürün 100-500 mg / L) üretir. -80 ° C'de saklanır, ayrıca, çözünmeyen proteinler, yüksek derecede kararlıdır. Daha sonra fonksiyonel homojen çözünebilir proteinlerin üretilmesi için iyi bilinen bir katlama ve saflaştırma tekniği kullanılır. Bu yöntem, teşhis ve tedavi için kullanılabilir, biyofiziksel yapısal ve hücresel deneylerde, hem de reaktif proteinlerin üretilmesi için faydalıdır.

(Tablo 2) kullanılarak bağlanma afinitesi TCR değerlendirildi. peptid içinde kalıntıları ortaya Bu deney TCR bağlanması için en önemli idi. Yüksek çözünürlüklü bu tekniği kullanarak bağlanma afiniteleri analizleri çok, protein-protein etkileşimlerini kontrol biyolojik mekanizmaları belirlenmesi için yararlı, hem de terapötik moleküllerin bağlanma afinitesine analiz içindir.

Daha sonra, atomik çözünürlükte (Şekiller 1 ve 2 ve Tablo 3) bağlanma modunu araştırmak için bir tadil edilmiş tümör kaynaklı pHLA (A2-YLE-9V) ile kompleks bir melanoma özgü çözünür TCR'yi (PMEL17 TCR) kristalleştirildi. Bu deneyler, iki moleküller arasındaki bağlanma arayüzü doğrudan görselleştirme sağlamak, providinetkileşimi yöneten temel prensipleri hakkında g anahtarı bilgileri. Biz daha (Şekil 3) bağlayıcı etkin enerjik katkıları açığa SPR ve ITC her ikisini de kullanarak etkileşim termodinamik analizini yaptılar. Bu analizler ayrıca iki protein (Şekil 4 ve Tablo 4) arasındaki temas ayak izi yüksek çözünürlüklü açıklaması ile desteklenmiştir.

Sonra bir moleküler anahtar açıklayabilir ortaya koyan, peptit mutasyona uğramış formları sunulması, bağlanmamış pHLA moleküllerin yapılarını çözüldü neden bağlayıcı TCR iptal bazı mutasyonlar (Şekil 5).

Genel olarak, bu teknikler, T-hücreleri anti-kanser tedavi için önemli bir hedeftir Melanom türevli bir antijeni tanıyan açıklayan bir mekanizmayı ortaya koyan, yeni veriler elde edilmiştir. Daha geniş anlamda, bu teknikleryeni terapötik gelişmeler için hedeflenen olabilir yeni biyolojik mekanizmaları açığa çıkarmak, hemen her reseptör-ligand etkileşimi araştırmak için kullanılabilir.

Şekil 1: Yoğunluk Plot Analizi. Sol sütunda gösterileri modeli peptid yokluğunda rafine edildiği haritalar ihmal. Fark yoğunluğu 3.0 sigma de konturlu olduğu, olumlu kontür yeşil gösterilir ve negatif kontür kırmızı vardır. sağ sütun REFMAC5 tarafından uygulanan otomatik olmayan kristalografik simetri koltuk kullanarak sonraki arıtma sonra (protein zincirlerinin sopa temsilleri etrafında gri bir örgü olarak gösterilen) 1.0 sigma de gözlenen haritasını gösterir. (A) TCR CDR3 ile PMEL17 TCR-A2-yle-9V modeli renkli mavi (α zinciri) ve turuncu (β zinciri) ve yeşil peptid döngüler. (B) A2-YLE modeli ilepeptid koyu yeşil renkli. (C), A2-yle 3A peptid turuncu renkli A2-yle 3A modeli (orada asimetrik birim içinde 2 molekülü, ancak bu omit ve yoğunluk haritaları açısından hemen hemen aynıdır, böylece sadece 1 kopya ) burada gösterilir. (D) peptid renkli pembe A2-yle-5A modeli. Referans ³¹ izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: A2-yle-9V ile Kompleksi'nde PMEL17 TCR bakış. PMEL17 TCR-A2-yle-9V kompleksi (A) Çizgi gösterimi. TCR siyah renkli; koyu yeşil, CDR2α;; TCR CDR döngüler (kırmızı, CDR1α gösterilmiştir mavi, CDR3α, sarı, CDR1β; aqua, CDR2 ^6 ;; turuncu, CDR3β); ve HLA-A * 0201, gri tasvir edilmiştir. YLE-9V peptid yeşil sopalarla tarafından temsil edilmektedir. (; Yle-9V, yeşil sopalarla A2, gri) PMEL17 TCR CDR kalıntılarının (B) Yüzey ve sopa temsilleri (A gibi renk kodlu) A2-YLE yüzeye temas olduğunu döngüler. Siyah çapraz çizgi YLEPGPVTV peptid (46.15 °) uzun eksenine göre TCR'nin kesişme açısını gösterir. (C) A2-yle-9V yüzeyinde PMEL17 TCR (A2, gri) İletişim ayak izi; mor ve yeşil (yüzey ve sopalarla), HLA-A * 0201 gösterir ve yle kalıntıları, sırasıyla gp100 TCR tarafından temasa geçti. Cut-off hidrojen bağları için 3.4 Å ve van der Waals kişiler için 4 Å. Referans 31. izniyle bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: PMEL17 TCR-A2-YLE Etkileşim Termodinamik Analizi. (A) PMEL17 TCR denge bağlayıcı, 18, 12, 5 de 25 A2-YLE yanıtlarını ve on TCR seri seyreltme ile dokuz arasında 37 ° C. Her eğrinin yerleşsin gösterilir ve küresel-fit algoritma (BIAevaluation 3.1) kullanılarak ve K _off değerleri _üzerinde K hesaplamak için kullanılmıştır: SPR ham ve monte veri (Langmuir bağlanma 1 1 varsayarak). Tablo denge bağlayıcı gösterir _(KD (e)) ve kinetik bağlanma sabitleri _(KD (K) = K _kapalı / K), her ilave edildi. Sabit denge bağlanma _(Kd, uM) değerleri lineer olmayan uyum kullanılarak hesaplanmıştır (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) termodinamik parametreler Gibbs Helmholtz denklemine göre hesaplanmıştır (ΔG ° = Sh ° - TΔS °). bağlayıcı serbest enerjileri, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), sıcaklığa karşı grafiğe geçirildi (K) üç parametre denklemi sığdırmak için doğrusal olmayan regresyon (y = Sh ° + ΔCp ° * (x-298) -X * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). 298 K (25 ° C) entalpi (AH °) ve entropi (TΔS °) kilokalori / mol gösterilir ve sıcaklık, (K) içindeki bir lineer olmayan regresyon kullanılarak hesaplandı serbest enerji karşı çizilen (ΔG °). PMEL17 TCR-A2-YLE etkileşim için (C) izotermal Kalorimetre titrasyon (ITC) ölçümleri. 298 K (25 ° C) Entalpi (AH °) ve entropi (TΔS °) kcal / mol gösterilmiştir. Referans ³¹ izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ong> Şekil 4: Peptid Kalıntı Pro4, Val7 ve Thr8 üzerinde PMEL17 CDR Döngüler Odak. (A) yle-9V peptid ve PMEL17 CDR halka artıkları arasındaki temasların şematik gösterimi (Şekil 2A gibi renk kodlu). Panelin alt kısmındaki sayılar TCR ve peptid arasındaki toplam kişileri gösterir. (B) PMEL17 TCR ve van der gösteren yle-9V peptid (yeşil çubukları) arasındaki İletişim Waals kişiler (siyah kesikli çizgiler) ve TCR CDR3α (mavi) tarafından yapılan hidrojen bağları (kırmızı kesik çizgiler), CDR1β (sarı) , CDR2β (aqua) ve CDR3β (turuncu) döngüler. alt panelde YLE Pro4, Val7 ve Thr8 arasındaki temasların yakın bir görünüm sırasıyla, ve TCR CDR halka kalıntıları (renk Şekil 1A olarak kodlanmıştır çubukları). Cut-off hidrojen bağları için 3.4 Å ve van der Waals kişiler için 4 Å. Referans ³¹ izniyle.rge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: HLA-A * 0201 tarafından sunulan YLE, İle-3A konformasyonel karşılaştırması ve A2-yle-5A Peptides. (A) yle (koyu yeşil sopa) ve YLE-3A (turuncu sopa) HLA-A üst üste * 0201 α1 sarmal (gri karikatür) tarafından peptit hizalama. Kutulu tortuları alanin içine Glu3 mutasyon göstermektedir. insets Glu3Ala ikame A2-YLE yapıya göre A2-yle-3A yapısında komşu kalıntı Pro4 konumunda bir kayma (siyah ok) neden nasıl gösterir. (B) yle (koyu yeşil sopa) ve YLE-5A (pembe sopa) HLA-A * 0201 α1 sarmal (gri karikatür) üst üste peptid hizalama. Kutulu tortuları alanin halinde glisin 5 mutasyonu gösterir. referans izniyle ^{Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

Tablo 1: TCR CDR3 PMEL17 Bölgeleri, gp100, MPD ve 296 gp100-özgü TCRlerin hizalanması. Referans ³¹ izniyle.

Peptit sekansı,	peptit	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affidilmekte K D
YLEPGPVTA	YLE	7.6 ± 2 uM	26.5 ± 2.3 uM
YLEPGPVT V	YLE-9V	6.3 ± 1.2 uM	21.9 ± 2.4 uM
bir LEPGPVTA	Yle-1A	15.9 ± 4.1 uM	60.6 ± 5.4 uM
YL A PGPVTA	Yle-3A	hiçbir bağlayıcı	hiçbir bağlayıcı
YLE A GPVTA	Yle-4A	19.7 ± 1.3 uM	144.1 ± 7.8 uM
YLEP bir PVTA	Yle-5A	> 1 mM	> 1mM
YLEPG A VTA	Yle-6A	11.4 ± 2.7 uM	954,9 ± 97,8 uM
YLEPGP A TA	Yle-7A	31.1 ± 4 uM	102.0 ± 9.2 uM
YLEPGPV A	Yle-8A	38.1 ± 7.4 uM	121.0 ± 7.5 uM

Tablo 2: PMEL17 TCR'nin Afinite Analizi _(KD) ve gp100 TCR _280-288 peptit türevlerini gp100 için. Referans ³¹ izniyle.

parametreler	PMEL17 TCR-A2-yle-9V	A2-yle	A2-yle-3A	A2-yle-5A
PDB kodu </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
Veri kümesi istatistikler
Uzay grubu	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
Birim hücre parametreleri (a)	a = 45.52, b = 54.41, c = 112,12, a = 85.0 °, b = 81.6 °, g = 72.6 °	a = 52.81, b = 80,37, c = 56.06, b = 112.8 °	a = 56.08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90.0 °, b = 89.8 °, g = 63.8 °	a = 56.33, b = 79,64, c = 57.74, b = 116,2 °
Radyasyon kaynağı	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
Dalga boyu (A)	0,9763	0,9999	0,9763	0,9763
measuKırmızı çözünürlük aralığı (Å)	51,87-2,02	45,25-1,97	43,39-2,12	43,42-1,54
Dış Çözünürlük Kabuk (Å)	2,07-2,02	2,02-1,97	2,18-2,12	1,58-154
Yansıma gözlenen	128.191 (8.955)	99.442 (7056)	99.386 (7463)	244.577 (17.745)
benzersiz yansımalar	64.983 (4.785)	30.103 (2.249)	49.667 (3.636)	67.308 (4.962)
Bütünlük (%)	97.7 (96.7)	98.5 (99.3)	97.4 (96.7)	99.6 (99.9)
çokluk	2.0 (1.9)	3.3 (3.1)	2,0 (2.1)	3.6 (3.6)
I / (Sigma I) 'in	5.5 (1.9)	7.2 (1.9)	6.7 (20,3)	13 (2.3)
Rpim (%)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4,5 (35.4)
R birleştirme (%)	7.8 (39.6)	9.8 (50.2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
Arıtma istatistikleri
Çözünürlük (Å)	2.02	1.97	2.12	1.54
kullanılmadı yansımalar	61688	28557	47153	63875
Rfree sette hiçbir yansıması	3294	1526	2514	3406
R cryst (hiçbir kesme) (%)	18.1	19.7	17.2	17.0
R ücretsiz	22.2	25.5	210,1	20.1
Kök İdeal geometriden kare sapma
Bağ uzunlukları (Å)	0.018 (0.019) *	0.019 (0.019) *	0.021 (0.019) *	0.018 (0.019) *
Bağ açıları (°)	1,964 (1,939) *	1,961 (1,926) *	2,067 (1,927) *	1,914 (1,936) *
Genel hata (Å) koordinat	0.122	0.153	0.147	0,055
Ramachandran istatistikleri
en Beğenilen	791 (% 96)	371 (% 98)	749 (% 99)	384 (% 98)
İzin	32 (% 4)	6 (% 2)	10 (% 1)	5 (% 1)
Aykırı	2 (% 0)	3 (% 1)	1 (% 0)	2 (% 0)

Tablo 3: Veri Azaltma ve Arıtma İstatistikleri (moleküler değiştirme). Referans ³¹ izniyle. Parantez içindeki değerler en yüksek çözünürlük kabuk içindir.

^OH

HLA / peptit Tortu	TCR kalıntısı	Hayır VDW (≤ 4A)	No. H-bağları (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
αGly97 Ç	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tyr1

Tablo 4: PMEL17 TCR-A2-yle-9V İletişim Tablosu. Referans ³¹ izniyle.

Tartışma

Burada belirtilen protokoller herhangi bir insan hastalığı bağlamında T-hücresi tepkilerinin, moleküler ve hücresel diseksiyon için bir çerçeve sağlar. Kanser Bu çalışmanın ana odak olmasına rağmen, biz virüs ^{32, 33, 34, 35,} T-hücresi tepkilerini araştırmak için çok benzer yaklaşımlar kullanmışlardır ^{36, 37} ve otoimmünite ^{38, 39, 40} döneminde. Ayrıca, T-hücresi antijen tanıma ^{2, 19, 41, 42} yöneten moleküler ilkelerini anlamak için daha geniş bu teknikleri kullandık. Gerçekten de, modifikasyonların öngörülemeyen doğası, hatta kalıntıları peptidTCR temas artıkları dışında, etkileri T-hücre tanıma heteroklitik peptidler tasarımı için önemli etkileri vardır. Bu bulgular doğrudan gelişmiş teşhis ^{45, 46, 47,} yanı sıra peptit aşılarının ^{6, 43} ve yapay yüksek afiniteli TCR'Irin ^{3, 4, 5, 20, 44} de dahil olmak üzere, yeni T-hücre tedavilerinin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur.

protokolü içinde kritik adımlar
yüksek ölçüde saf bir fonksiyonel protein üretimi bu dokümanda belirtilen yöntemlerin tümü için gereklidir.

Değişiklikler ve sorun giderme
yüksek ölçüde saf protein üreten güçlükler çoğu kez yüksek ekspresyonu ile ilgilidir-Saf E. coli sentezleme sistemi için çözünmeyen IBler. Genellikle, ifade protokolü (örneğin, farklı E.coli suşları kullanılarak, farklı optik yoğunluklarda uyarılması veya farklı medya oluşumları kullanarak) modifiye bu sorunları çözer.

tekniğin sınırlamaları
Bu teknikler, normal olarak hücre yüzeyinde ifade edilir çözünür protein molekülleri (TCR ve pHLA) kullanın. Böylece, yapısal / biyofizik bulgular biyolojik önemini teyit etmek için hücresel yaklaşımlar ile tutarlı olmasını sağlamak için önemlidir.

Mevcut / alternatif yöntemlere göre tekniğin önemi
X-ışını kristalografisi ve fonksiyonel analiz ile ispat biyofizik kullanımı sayesinde, biz ve diğerleri, kanser epitoplarına için TCR'ler özgü genellikle düşük bağlanma ilgisi ⁴⁸ ile karakterize olduğunu göstermiştir. Bu düşük TCR afinite T hücreleri ar açıklamaya yardımcı olabilirE kanseri temizlenmesi de doğal olarak etkili değildir. anti-kanser TCR'lerinin ve soydaş tümör antijenleri arasındaki komplekslerin yüksek çözünürlüklü atomik yapıları bu zayıf afinite moleküler temelini ortaya çıkarmak için başlıyor. Ayrıca, bu çalışmalar gelecekteki gelişmeler ¹⁶ ekim, bu sorunu aşmak için tasarlanmış terapötik girişimlerin altında yatan mekanizmaları belirlemek için faydalıdır. Bu çalışmada, bir gp100, HLA-A * 0201 kısıtlı melanom epitopu kompleks bir doğal olarak meydana gelen αβTCR ilk yapısı incelenmiştir. derinlemesine bir biyofiziksel muayene ile kombine yapısı, etkileşim genel bağlayıcı modu saptandı. Ayrıca ve CD8 ⁺ T-hücresi tanımayı (fonksiyonel deneyler) (yüzey plasmon rezonansı kullanılarak değerlendirildi) bağlanma TCR iptal peptidin mutasyona uğramış bir biçimde meydana gelen beklenmedik bir molekül anahtarı, ortaya çıkardı. HLA antijeni presentati bu yeni mekanizma göstermek mümkün olmuşturaçıklanan yüksek çözünürlüklü yöntemleri kullanarak.

Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön
sağlam, fonksiyonel analizler ile kombine edildiğinde Genel olarak, bizim sonuçlar X-ışını kristalografisi ve biyofizik yöntemlerin gücünü göstermek. Bu yaklaşımları kullanarak, T-hücresi antijen tanıma yöneten kesin moleküler mekanizmalar teşrih etmek mümkündür. Gerçekten de, biçim alma değişiklikleri, antijen ayrım ^{49, 50, 51} boyunca bir rol oynasa gösteren bağlanmamış TCRlerin yapısını çözmek için bu yaklaşım kullanmak da mümkündür. TCR-pHLA etkileşimleri destekleyen son derece karmaşık ve dinamik doğasının daha iyi anlaşılması da tedavi tasarımı için bariz etkileri vardır. doğrudan değişiklikler antijen recognitio var terapötik hedef alınmaktadır molekülleri yanı sıra etkisi "görmek" için güçlü olmakn, açıkça ileriye dönük bu ilaçların geliştirilmesini artıracaktır. Bu çalışmada, yoğun bir TCR ile birleşmeyen tek bir peptid artığı da değişiklikler tahmin edilemeyecek da, önemli ölçüde T-hücresi tanımayı değiştirir, HLA bağlı peptid, diğer kalıntısı elde etmek, yapısal değişiklikler iletebilir göstermektedir. insan hastalıklarının geniş bir aralığı için gelecekteki terapiler tasarımı T hücresi antijen tanıma sırasında kullanılan moleküler mekanizmalar daha tam olarak anlaşılması, oldukça faydalı olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
S.O.C. media	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit inkübatörü	Sanyo
karbenisilin	Sigma
IPTG	Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain	Generon
Legend RT santrifüjü	Sorvall
Tris	Fisher
magnezyum klorür	Arcos
NaCl	Fisher
gliserol	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070	Bandelin
DNA'sı	Balıkçı
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA	Fisher
guanidin	Fisher
NanoDrop ND1000	Termo
Peptitler	Peptit Protein Araştırması
ditiotreitol	Sigma-Aldrich
L-arginin	SAFC
sisteamin	Fisher
sistamin	Fisher
diyaliz tüpü	Sigma-Aldrich
üre	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μ m membran filtre	Pall
POROS 10/100 HQ	Uygulamalı Biyosistemler
ve AUML; KTA saf FPLC sistemi	GE Sağlık Yaşam Bilimleri
10 kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Sartorius
Superdex 200 10/300 GL sütunu	GE Sağlık Yaşam Bilimleri
Fosfat Tampon Salin	Oksoit
BIAcore tamponu HBS	GE Healthcare Yaşam Bilimleri
Biyotinilasyon kiti	Avidity
BIAcore T200	GE Healthcare Yaşam Bilimleri
CM5 çip birleştirme kiti	GE Healthcare Yaşam Bilimleri
streptavidin	Sigma-Aldrich
Microcal Başkan Yardımcısı	GE Sağlık Yaşam Bilimleri
Fakülte	Sigma-Aldrich
Gryphon kristalizasyon robotu	Art Robbins Instruments
Intelli-plaka	Art Robbins Instruments
Kristalizasyon ekranları ve reaktifleri	Moleküler Boyutlar
75 cm2 flask	Greiner Bio-Bir
0.22 & mu; m filtreler	Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultrasantrifüj tüpü >	SW28 rotorlu Beckman Coulter
Optima L-100 XP	Beckman Coulter
CD8 mikro boncuklar	Miltenyi Biotec
anti-CD3 / CD28 Dynabeads	İnvitrojen
anti-PE mikro boncuklar	Miltenyi Biotec
CK orta, PHA	Alere Ltd
anti-TCRV ve beta; mAb ve nbsp;
dasatinib	Akson
MIP-1 ve beta; ve TNF ve alfa; ELISA	Ar-Ge D Sistemleri
51Cr	PerkinElmer
1450 Mikrobeta sayacı	PerkinElmer