Yöntem makalesi

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 Aralık 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Drosophila'yı farklı gelişim aşamalarında hazırlamak ve özel bir optik tutarlılık mikroskobu (OCM) sistemi kullanarak Drosophila kalp atışlarının uzunlamasına optik görüntülemesini gerçekleştirmek için deneysel protokoller açıklanmaktadır. Kardiyak morfolojik ve dinamik değişiklikler, OCM görüntülerinden kalbin yapısal ve fonksiyonel parametrelerinin analiz edilmesiyle kantitatif olarak karakterize edilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hayvanlarda kalp atışının boylamsal çalışması, kalp gelişimi sırasındaki yapısal ve fonksiyonel değişikliklerin anlaşılmasına katkıda bulunur. Optik tutarlılık mikroskobunun (OCM), küçük hayvan kalplerini yüksek uzamsal çözünürlük ve ultra yüksek görüntüleme hızı ile görüntüleyebildiği gösterilmiştir. Yüksek görüntü kontrastı ve noninvaziv özellikler, OCM'yi doku diseksiyonu veya boyama gerektirmeden uzunlamasına çalışmalar yapmak için ideal hale getirir. Drosophila, ortolog insan hastalığı genlerinin yüksek sayıda olması, moleküler mekanizmaların ve genetik yolakların omurgalılarla benzerliği, kısa yaşam döngüsü ve düşük kültür maliyeti nedeniyle kardiyak gelişim çalışmalarında model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, numunenin yaşam döngüsü boyunca Drosophila'nın hazırlanması ve kalp atışının özel bir OCM sistemi ile optik olarak görüntülenmesi için deneysel protokoller açıklanmaktadır. Bu raporda verilen adımları izleyerek, Drosophila kardiyak morfolojisi ve fonksiyonu hakkında uzunlamasına çalışmalar yapmak için enine M-modu ve 3D OCM görüntüleri elde edilebilir. Yüz ve aksiyel kesitsel OCM görüntüleri ile kalp atış hızı (HR) ve kardiyak aktivite periyodu (CAP) histogramlarının, kardiyak aktiviteyi sezgisel olarak izlemek için M-mod görüntülerle oluşturulan videolarla birlikte Drosophila metamorfozu sırasında kalbin yapısal değişikliklerini analiz ettiği ve kalp dinamiklerini ölçtüğü de gösterildi. Drosophila ve omurgalılar arasındaki genetik benzerlik nedeniyle, meyve sineklerinde kalp morfolojisi ve dinamiklerinin uzunlamasına incelenmesi, insan kalp hastalıklarının kökenlerini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Buradaki protokol, insanlarda kalp hastalıklarının mekanizmalarını anlamak için çok çeşitli çalışmalar yapmak için etkili bir yöntem sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hayvanlarda kalp uzunlamasına bir çalışma gibi gen ile ilgili konjenital kalp defektleri 1,2 gibi insan ilgili kardiyovasküler hastalıklar, çeşitli anlamak için katkıda bulunur. Geçmiş yıllarda, fare, 3,4, Xenopus 5,6 zebra balığı 7,8, kuş 9 ve Drosophila 10-16 gibi çeşitli hayvan modellerinde,, araştırma ile ilgili, insan kalp geliştirme çalışmaları için kullanılmıştır. Fare modeli yaygın normal ve anormal kalp gelişimi ve insan kalbi 3,4 ile benzerlikler nedeniyle kalp kusur fenotipleri incelemek için kullanılır olmuştur. Xenopus embriyo nedeniyle kolay kullanım ve kısmi şeffaflık 5,6 kalp gelişimi çalışmada özellikle yararlıdır. Embriyo ve zebra balığı model erken larva şeffaflık kalp gelişimi 7,8 kolay optik gözlem için izin verir. kuş modeli gelişimsel kalp çalışmalarının ortak bir konudur because Kalp kolayca yumurta kabuklarını ve insanlarda 9 kuş kalplerin morfolojik benzerliği çıkardıktan sonra ulaşılabilir. Drosophila modeli kalbin uzunlamasına çalışmalar yapmak için ideal hale bazı benzersiz özelliklere sahiptir. İlk olarak, Drosophila kalp tüpü kalbin optik erişim ve gözlem için kolaylık sağlar dorsal yüzeyinin altında ~ 200 mikron vardır. Ayrıca, birçok moleküler mekanizmaları ve genetik yollar Drosophila ve omurgalılar arasında muhafaza edilir. İnsan hastalık genlerinin 75 üzerinde% ortologlar yaygın transgenik çalışmalarda 11,13 kullanılan yapmış Drosophila, bulundu. Ayrıca, kısa bir ömrü ve düşük bakım maliyetleri vardır ve yaygın gelişimsel biyoloji araştırma 14-16 bir örnek model olarak kullanılmıştır.

Önceki raporlar o gibi Drosophila kalp fonksiyonlarını izlenmesi için protokol tarifArtbeat. Bununla birlikte, diseksiyon işlemleri 17,18 gerekmiştir. Optik görüntü nedeniyle non-invaziv doğası hayvanlarda kalp gelişimini görselleştirmek için etkili bir yol sağlar. Farklı optik görüntüleme yöntemleri gibi iki foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, hafif levha mikroskobu 22, ve optik koherens tomografi (OCT) 16,23-26 olarak, performans hayvan kalp çalışmada uygulanmıştır. Nispeten, Ekim görüntüleme canlı hayvanlar için önemli olan yüksek çözünürlük ve Ultrahigh görüntüleme hızı, tutarken, kontrast maddeleri kullanmadan küçük hayvan kalplerinde büyük bir görüntüleme derinliğini sağlama yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bir Ekim sistemini geliştirme düşük maliyetli örneklerinin optik görüntüleme için bu tekniği yaygınlaştırmıştır. Ekim başarıyla Drosophila boyuna çalışma için kullanılır olmuştur. Ekim, kalp morfolojik ve fonksiyonel görüntüleme kalp yapıları incelemek için yapılmıştır kullanma, işlevtional genlerin rolleri ve kalp gelişimi sırasında mutant modellerde kardiyovasküler kusurların mekanizmaları. Örneğin, yaşa bağlı kardiyak fonksiyon düşüş OCT 27 Drosophila aşağı-regüle anjiotensin dönüştürücü enzim ilgili (ACER) geni ile teyit edilmiştir. Gen ile ilgili kardiyomiyopati fenotiplendirme OCT 28-33 kullanılarak Drosophila gösterilmiştir. Araştırma kullanarak Ekim de Drosophila 34 kalbinde insan SOX5 geninin fonksiyonel rolünü ortaya koymuştur. OCT ile karşılaştırıldığında, OCM daha enine çözünürlük sağlamak için daha yüksek bir sayısal diyafram ile objektif kullanır. Geçmişte, bir ortologu insan sirkadiyen geni dCry / dClock susturma kaynaklanan kalp fonksiyon bozukluğu, obezite kaynaklı insan anlamak için özel bir OCM sistemi 15,16 yanı sıra Drosophila kardiyomiyopatilerde yüksek yağlı-diyetin etkisini kullanarak çalışılmıştır kalp hastalıkları. 15

Burada, inciE deneysel protokol ikinci dönem (L2), üçüncü instar (L3), pupa gün 1 (PD1), pupa günde 2 (PD2), pupa gün 3 de Drosophila kalp morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere boyuna çalışma için (PD3) özetlenmiştir , pupa gün 4 insan kaynaklı doğumsal kalp hastalıklarının çalışma kolaylaştırmak için OCM kullanarak (PD4), pupa gün 5 (PD5) ve yetişkin (Şekil 1). İK ve CAP olarak kardiyak fonksiyonel parametreler, kantitatif kalp gelişim özellikleri ortaya çıkarmak için farklı gelişim aşamalarında analiz edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila 16 optik görüntüleme OCM Sistemi 1. Hazırlık

  1. Bir spektrometre ve OCM sistemi Drosophila kalp atışı çözmek mümkün olacak, böylece en az 80 kare / sn kare hızı sağlayan yüksek hızlı hat tarama kamerayı seçin.
  2. Drosophila kalp yapısını belirlemek için 2 um eksenel çözünürlük sağlamak için geniş bant ışık kaynağı kullanın.
  3. Bir yüksek enine çözünürlük elde etmek için bir 10X objektif kullanarak.
  4. Referans kol ışık ışınını yansıtacak ve örneklerde odak derinliği genişletmek için dairesel bir örnek kol ışık ışınını üretmek için 45 ° çubuk ayna kullanın.
  5. OCM sistemini kontrol ve ölçümleri gerçekleştirmek için özel bir bilgisayar programı geliştirmek.

2. Drosophila Kültür

  1. Standart Fly Gıda Hazırlama
    1. Polistiren şişenin içine ~ 5 ml anlık Drosophila formülü koymakBir kağıt oluk yardımı ile tüp.
    2. düzgün yemek doyurmak için formüle ~ 8 ml su dökün.
    3. Farklı deneyler için standart sinek gıda farklı takviyeleri ekleyin. Deney 35 ilerleme hızı optogenetic için all trans -retinal (ATR) yemek için hazırlanırken, 100 mM ATR ayıklamak ve gıda 1 mM ATR konsantrasyonunu elde etmek için mi 8 ~ içine su eritmek için bir pipet kullanın. homojen çözelti karıştırıldıktan sonra, formül içine dökün ve yeterince karıştırın.
    4. Bir mikrodalga fırında 30 saniye boyunca bir kabı ve ısı 15 mi su ile ~ 10,15 karışımı Drosophila obezite ile ilişkili kalp bozuklukları incelemek için 10 mi formül yüksek yağ diyet hazırlamak. Başka bir fincan bazı organik sızma hindistan cevizi yağı koyun ve mikrodalga fırında 90 saniye boyunca ısıtın.
    5. yeterince gıda ~ 30/100 ve th Hindistan cevizi yağı ağırlık / hacim oranı yapmak için 7.5 ml hindistan cevizi yağı Özü ve hazırlanan formülü ile karıştırınve gıda karışık özü ~ 2 ml tr tüpün dibine koydu.
    6. orta iyice doyana kadar 1 dakika bekleyin. Drosophila yaşam koşullarını optimize etmek için düz bir yüzeye dikkatlice gıda kompakt. Hazırlanan formül maya 8 taneleri ve pamuk küme ile tüp fiş - 6 ekleyin.
  2. Meyve Sineği Haçlar ve Kültür
    1. Hazırlanan standart sinek gıda ile tüp almak ve takılı pamuk çıkarın. Dikkatle tüp (erkek ve dişi) yetişkin uçar aktarmak ve hemen pamuk ile tüp takın. pamuk ve tüpten kaçan sinek önlemek için tüp duvar arasında boşluk olmadığından emin olmak için pamuk kontrol edin.
    2. çapraz üreme için 25 ° C'de inkübatör meyve sinekleri tutun. Genlerin en aktif ve hücresel proteinler 25 ° C 36-39 sentezlenirler.
    3. 8 el transferi bir süre sonra inkübatör tüpü dışarı atınDult deneysel kontrol için benzer yaşta yumurta elde etmek için tüp dışarı uçar.
    4. 8,5 gün 40,41 geliştirme dönemi ile Drosophila gelişimi için standart sıcaklık 25 ° C, kuvöz yumurta kültüre devam edin.
      Not: Sıcaklık gelişim sürecini (yetişkin yumurta) ve çeşitli genlerin ekspresyon seviyesini etkiler.

3. OCM Optik Görüntüleme Sahne

  1. Optik Görüntüleme Mount Fly Larva
    Not: 22, Drosophila kapakları yumurta - birinci instar larvası (L1) için 25 ° C'de 24 saat süredir. İkinci evre larva başka 24 saat sonra ortaya çıkar. en büyük larva formu yaklaşık 24 saat sonra molts Üçüncü dönem larva, olduğunu. larva Yapısal özellikler onların farklı gelişim aşamalarını ayırt etmek için kullanılabilir. İlk instar ve ikinci dönem arasındaki ağızlarının boyutu farklıdır. Ağızİlk evre larva kancalar çok küçük ve ikinci evre larva ağız kanca daha büyüktür ve yapı net iken, küçük siyah noktalar iki çift gibi görünüyorlar. spiracles genellikle ikinci instar ve üçüncü instar tanımlamak için kullanılır. Üçüncü instar için, ön spiracles dallı ederken, ikinci evre larva, ön spiracles clubbed etti. Bir koyu turuncu halka Üçüncü dönem larva posterior spiracles ucunda görünmeye başlayacaktır.
    1. Temiz bir mikroskop cam slayt çift taraflı bant bir parça uygulayın. görüntüleme sırasında hava kabarcıklarının neden yansımaları önlemek için bant altında hava kabarcıkları sınırdışı.
    2. larva aşamasında inkübatör dışarı kültürlü sinekler tüplerin birini almak.
    3. , Medyada larva tespit temiz bir doku üzerine yumuşak bir fırça ve yer ile medya çıkarın. ıslak, yumuşak bir fırça ile larva yapışmış herhangi bir yiyecek çıkarıp doku üzerinde kurutun.
    4. cleane taşıGeniş alan mikroskobu objektif mercek altında bir dokuya sinek d.
    5. sinek net bir görüş bulmak için mikroskop odağı ayarlayın. mikroskopla yapısal özellikleri ile larva sağ gelişim aşamasını belirlemek.
    6. yumuşak bir fırça kullanarak sinek yerleştirin. Vücut düz sırt yan cam slayt monte hazırlanmak için yukarı bakacak şekilde dorsal yüzü olduğundan emin olun. Mikroskop altında bu adımı gerçekleştirin.
    7. Larva bant üzerine monte etmeden önce tamamen kuru olduğundan emin olun. Aksi takdirde, larva banda uygun olmayacaktır.
    8. hafif bir baskıyla cam slayt çift taraflı bant konumlandırılmış sinek dorsal yüzü sopa. görüntüleme sırasında hareket uçmak yol açacaktır sinek ve çok az kuvvet öldürebilir çok fazla basınç unutmayın.
  2. OCM ile Larvaların Aşamaları (L2 ve L3) de Drosophila Optik Görüntüleme
    NOT: kalp tüpü geniş bir lümen fo olabilirund larva aşamasında A8 A5 arasındaki segmentlerinde yer alan (Şekil 1). enine OCM M-mod görüntüleri (2D + zaman) sistolik ve diyastolik analizi kolaylaştırmak için her larva için kalp tüpü A7 segmentinde elde edildi.
    1. objektif lens aşağıdan yukarıya bakacak şekilde sırt tarafında ile y-enine yönde OCM sisteminin ayarlanabilir numune aşamasında monte larva yerleştirin. Numune aşamasında küçük bir delik sahne uçağı ile temasını önlemek için larva yerleştirmek için gereklidir.
    2. meyve kalp tüpü görüntüleme ışının odak düzlemine sinek taşımak için örnek sahne ayarlayın. Kolayca A7 segmenti bulmak için gerçek zamanlı görüntü elde etme yazılımı kesitsel OCM görüntüleri ile kalp tüpü arka bölgesini bulmak. A7 segmenti görünür kadar ileri sahneye taşımak.
    3. Set B-tarama başına 100 A-taramaları (çerçeve), 100 B-taramalar için görüntü elde etme yazılımı parametreleri ve scanneR gerilimi ~ 0.28 X-enine yönde mm, ve y enine yönde 0 V kapsayacak. Karanlık bir bezle örnek ışın yolunu bloke ederek arka çıkartma için arka plan gürültü verilerini elde etmek için yazılımdaki "start" düğmesine tıklayın.
      Not: 100 kare 3 geri çıkarma için de kullanılabilir.
    4. B-tarama başına 128 A-taramaları, 4096 B-taramalar ve tarayıcı gerilimine veri toplama yazılımı Set parametreleri y-enine yönde x-enine yönde ~ 0.28 mm ve 0 V kapsayacak. Yaklaşık 30 saniye boyunca 0.28 x 0.57 mm 2 kapsayan bir bölge üzerinde sinek kalp tüpü A7 segmenti boyunca enine M-mode görüntüleri elde etmek için yazılımdaki "start" düğmesine tıklayın.
    5. görüntüleme ışığa sinek kalbin uzun maruz kalmasını önlemek için veri kaydetme işlemi sırasında karanlık bir bez kullanarak görüntüleme ışını engelleyin.
    6. Kalp eğlenceli güvenilir ölçüm almak için 5 kez tekrarlayın ölçümüction.
    7. B, tarama başına 400 A taramalar, 800 B tarama ve tarayıcı gerilimine görüntü elde etme yazılım parametrelerinin ayarlanması X-enine doğrultuda ~ 1.7 mm kapak, ve y enine yönde yaklaşık 4 mm. tüm meyve sineği görüntülü olabilir sağlamak için her iki yönde de sahne taşıyın. 3 boyutlu meyve sineği görüntüler elde etmek için bir veri kümesi elde etmek için yazılımdaki "start" düğmesine tıklayın. Not: 3D sinek yapısı Amira 3D yazılımı kullanılarak kılınabilir
    8. Ölçülen sinek nemlendirin ve yavaşça cam slayt çıkarmak için ıslak yumuşak bir fırça kullanın. Sürekli gelişim için ayrı bir tüp içine taşıyın. Bir sonraki gelişim aşamalarında uzunlamasına çalışma için tüp etiketleyin.
  3. Pupa Aşamaları Image Drosophila
    NOT: Tüm meyve sinekleri PD1 gelen PD5 için görüntüleme için dışarı alındı. Şekil 1b larva şemada gösterildiği gibi, geniş bir lümen th A8 kesimlerine A5 kalırPD1 kadar e kalp tüpü. PD2 itibaren, bir konik bölme A4 kesimlerine A1 arasında gelişmeye başlar. Tutarlı görüntüler elde ve kalp analizini kolaylaştırmak için, enine M-mod görüntüleri PD1 A7 segmentinden elde edildi ve Şekil 1b işaretli olarak, PD2 sonra A1 segmentten.
    1. PD1 Image Drosophila
      NOT: Drosophila kısa bir süre pencere için bir beyaz puparium olacak - PD1 sırasında (0 1 saat). Bu zaman pencere yüksek şeffaflık OCM görüntüleme için yüksek ışık penetrasyon neden çünkü erken pupa optik görüntüleme gerçekleştirmek için idealdir.
      1. Onlar pupa olunca meyve sinekleri tüp duvarında bulunan gibi, ıslak yumuşak bir fırça ile PD1 de görüntüleme için bireysel tüplerden pupa kaldırmak ve vücuda yapışmış gıda varsa fırça ile pupa temizleyin.
      2. Doğrudan ıslak fırça ile küçük bir cam slayt meyve sineği takın ve yukarı bakacak dorsal yüzü tutmak (Şekil 1a
      3. sinek Vücut yandan aşırı su çıkarmak.
      4. üstünde meyve sineği tutmak, OCM sisteminin örnek sahnede cam slayt koyun. Larva ölçümü açıklanan aynı stratejiyi kullanan sinek kalp A7 segmentinin açık gerçek zamanlı görüntüyü bulun.
      5. bölüm 3.2 gibi veri toplama yazılımı aynı parametreleri ayarlamak ve görüntü A7 segmentinde kalp atışları enine M-mod ve 3 boyutlu görüntüler elde etmek için.
      6. görüntüleme sonra sürekli geri kültür tüpüne pupa cam slayt yerleştirmek için bir cımbız kullanın.
    2. PD5 Aşamaları için PD2 Image Drosophila
      Not: Örnek daha opak pupa aşamalarında olur için, görüntüleme sisteminin nüfuz etme derinliği azalacaktır.
      1. dikkatlice cam s kaldırmak için cımbız kullanınlide görüntüleme için tüpten PD2 de sinek ile monte edilebilir. PD2 anda, numune kabuk sararır ve vücut PD1 (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında daha az şeffaf hale gelir.
      2. OCM sisteminin örnek sahnede slayt yerleştirin.
      3. OCM sisteminin görüntüleme ışınının odak düzlemi sinek taşımak için örnek sahne ayarlayın. Gerçek zamanlı kesit OCM görüntü kalp tüpün anterior ucunu Bul. kalp tüpü A1 segmenti bulmak için geri posterior yönde ~ 50 mikron taşıyın.
        NOT: Kalp geliştirme (PD2) Bu noktada, konik odası çok küçük olacak ve dayak olmayabilir.
      4. önceki gelişim evreleri aynı yöntemi kullanarak enine A1 segmentinden M-mode veri setleri yanı sıra 3D veri toplamak.
      5. Sürekli kültürü için dikkatle tüp geri slayt koydu.
        NOT: PD3 anda, kabuk numunenin rengi PD2 aşamasında daha koyu. PD4 aşamada, siyah şeritler can örneklerin kabuğun içinde görülmektedir. Diğerleri PD5 dönüşecektir Bazı sinekler, ertesi gün bu aşamada yetişkin dönüşecek. PD5 aşamada, siyah şeritler daha açıkçası meyve sinekleri görülür bulunmaktadır. Bu sinekler ertesi gün yetişkin haline gelecektir.
  4. Yetişkin Sahne Image Drosophila
    NOT: yetişkin aşamada, kadın ve erkek sineklerin vücudun büyüklüğü ve alt karın rengine göre ayırt edilebilir. erkekler daha küçük ve koyu renkli alt karında ise kadın yetişkinden daha büyük bir boyutu var.
    1. Meyve sineği bir yetişkin haline geliştiğinde inkübatör tüpü dışarı atın ve yetişkin bir ~ 45 ml boş şişeye sinek aktarın.
    2. Anestezi içine bir değnek emici ucunu (~ 1 cm uzunluğunda, ~ 3 mm çapında) Dip şişenin içine değnek koymak ve sadece takılı pamuk altında ve anestezik ucunu tutmak için bir pamuk küme ile tüp fiş anes3 dakika boyunca sinek thetize. anestezi süresi anında büyüklüğüne bağlıdır ve en az 3,5-2,5 arasında değişebilir (örneğin: min 3 kadın, en az 2.5 erkek veya 3.5).
    3. çift ​​taraflı bant parçası ile bir cam slayt hazırlayın.
    4. sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yumuşak bir fırça kullanarak cam slayt üzerine anestezi sinek taşıyın.
    5. Bir cımbız kullanarak kanatları ayırın ve sinek düzeltmek ve görüntüleme için kalp bölgesini ortaya çıkarmak için bir mikroskop altında kasete kanatları sopa.
    6. Görüntü sinek kalp A1 segmentinden sinek (Şekil 1). Deneyin sonunda, uçucu feda edilebilir.

4. Görüntüleme Analizi 16

  1. görüntü dosyaları görüntü elde etme yazılımı ile toplanan 2D ve 3D ikili dosyaları dönüştürmek için Matlab programlarını geliştirmek.
  2. creat enine M-mode görüntülerde kalp tüpü bölgesini ve bir sihirli değnek algoritması tanımlamak için ImageJ kullanınHer enine M-mod görüntü için kalp bölgenin ea maskesi. Segment maskeli bölge ve sistolik ve diyastolik yerleri belirlemek için bir zirve bulma algoritması kullanır. enine M-mode görüntülerden zamana bağlı kalp çap değişiklikleri hesaplayın.
  3. edinilen zamana bağlı kalp çapları dayanarak, İK, kardiyak faaliyet döneminde (CAP), uç Diastol çapı (EDD), uç sistol çapı (ESD), uç Diastol alanda (EDA) gibi kardiyak parametreleri hesaplamak ve (sistol alan son ESA). fraksiyonel kısalma (FS) ile hesaplayın figure-protocol-1
  4. sinek kalbin yapısal gelişimini görselleştirmek için 3D OCM görüntüleri analiz etmek ImageJ kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

uzunlamasına kardiyak görüntüleme OCM ile oda sıcaklığında 24B-GAL4 / + suşu ile meyve sinekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçümler L2, L3 gerçekleştirilen ve PD4 PD1 8 saat aralıklarla ve yetişkin günlük 1 (AD1) başkalaşım süreci (Tablo 1) izlemek için bulundu. Larva erken Pupa geç pupa ve yetişkin sinek Şekil 1A görüldüğü gibi, cam lam üzerine yerleştirilmiştir. Larva ve ergin sinekler için kalbin segmenti özellikleri Şekil 1B şematik temsiller gösterilmiştir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Larva ve ergin dönemlerinde 400 bpm civarında maksimum HR Drosophila hızlı kalp atışı, kalp diastoles ve systoles (tecrübelerine dayanarak en az 80 kare / sn) gidermek için yüksek görüntüleme hızı gerektirir. Nedeniyle küçük kalp odası büyüklüğü ve mikron ölçekli kalp duvar kalınlığına (5-10 um), yüksek uzamsal çözünürlük (2 um daha iyi) kalp tüpü yapılarının çözülmesi için gereklidir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü ve ultra hızlı OCM sistemi ızgara 600 satır / mm şanzıman ile bir spektrometre ve 2048 piksel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar mevcut çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Lehigh Üniversitesi Başlangıç Fonu, NIH (R00EB010071'den C.Z.'ye, R15EB019704'dan C.Z. ve A.L.'ye, R03AR063271 A.L.'den ve R01AG014713 ve R01MH060009'den R.E.T.'ye), NSF (1455613 C.Z. ve A.L.'ye), Cure Alzheimer's Fund (R.E.T.'ye) ve Massachusetts General Hospital (A.L.'ye Araştırma Ödülü İcra Komitesi) tarafından desteklenmiştir. M.C. ve Y.M., Ulusal Anahtar Temel Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir Çin'in (973 Programı) Hibe No. 2014CB340404 kapsamında.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Özel OCM görüntüleme sistemiLaboratuvarımızda
Temp Mini Dijital İnkübatör BenchmarkH2200-HC
Kapak camıAmScope200PCS
Pamuk TopRITE AID
Anında Drosophila FormülüCAROLINAformülü 4-24
MayaActiveDry
MikroskopSONYWILD M420
FırçaLoew-Cornell245Bnumuneleri taşımak için kullanılıyor
Labview yazılımıUlusal Aletler
ImageJUlusal Sağlık
MatlabMathworks
CımbızWihaAA SAmeyveyi sabitlemek için sinek kanatları
FlyNapCarolina Biyolojik Tedarik Şirketi4,224,898
Scotch Kalıcı Çift Taraflı Bant, 3 MScotch
PipetFisherbrandMU18837
Organik Ekstra Hindistan Cevizi YağıSpring Valley13183
Mikroskop SlaytCapitolBrandM3504-E
Drosophila ŞişelerSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.R2500
geliştirilenEnstitüleri Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila KalbiKalp Fonksiyonu G r nt lemeTransvers M mod3D OCM G r nt lemeKalp At m H z Nicelle tirmesiKardiyak Aktivite PeriyoduDrosophila MetamorfozuNoninvaziv G r nt lemeBoylamsal al ma

İlgili makaleler