Yöntem makalesi

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA'nın izolasyonu için etkili bir yöntem

DOI:

10.3791/55008

⸱

11 Ocak 2017

 ,  , 
1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek saflıkta RNA izolasyonu üzerinde inhibitör etkileri olan büyük miktarlarda yağ, protein ve polifenol içeren bitki tohumlarından RNA izolasyonu için bir yöntem oluşturmayı başardık. Yöntemimiz, tohumlarda düşük seviyeli transkriptlere sahip genlerin ekspresyonunu izlemek için uygundur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki tohumları, biyolojik olarak parçalanabilen organik madde içeren büyük miktarda depolama rezervi biriktirir. İnsanlar, gıda ve endüstriyel malzemeler için tohum depolama rezervlerine güvenirler. Gen ekspresyon profilleri, bitki hücrelerinde metabolik düzenlemeyi araştırmak için güçlü araçlardır. Bu nedenle, mahsul ıslahı için tohum gelişimi sırasında ayrıntılı, doğru gen ekspresyon profilleri gereklidir. Bu profillerin üretilmesi için yüksek oranda saflaştırılmış RNA elde etmek çok önemlidir. Tohumlardan yüksek oranda saflaştırılmış RNA'yı izole etmek için verimli yöntemlere ihtiyaç vardır. Burada, yüksek saflıkta RNA izolasyonu üzerinde inhibitör etkileri olan büyük miktarlarda yağ, protein ve polifenol içeren tohumlardan RNA'yı izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntemimiz, fenol, kloroform veya RNA saflaştırması için ek işlemler kullanılmadan tohumlardan yüksek oranda saflaştırılmış RNA elde edilmesini sağlar. Bu yöntem Arabidopsis, kolza tohumu ve soya fasulyesi tohumları için geçerlidir. Yöntemimiz, gelişmekte olan ve olgunlaşmış tohumlarda düşük seviyeli transkriptlerin ifade kalıplarını izlemek için faydalı olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler nesil doğuran tohum üretmek. Tohumlar, post-germinatif büyüme yağlar, karbohidratlar ve proteinler gibi depolama rezervlerinin büyük miktarda birikir. İnsanlar gıda ve hayvan yemi kaynağı olarak tohum depolama rezervleri kullanmak ve böylece bitki tohumları dünya çapında yenilebilir organik maddenin önemli tedarikçilerinden biri vardır. tohum verimi artan bitki biliminde önemli bir sorundur.

Tohum depolama rezervleri gıda ve endüstriyel malzemelerin ticari olarak değerli kaynaklar olduğundan, bu rezervlerin metabolizmasının düzenlenmesine altında yatan moleküler mekanizmalar yaygın 1-6 incelenmiştir. Bundan başka, bu mekanizmaların tanıtılması bitkileri tohum verimini artırmak için yararlı olacaktır. Tohumlar Döllenmeden sonra bitki yumurtalıklarda gelişir ve bunlar gelişim aşamaları 1,6,7 bir dizi olgun. Dahası, moleküler mekanizma yatan tohum gelişimini anlamak detaylı gerektirirTohum geliştirme bir dizi hassas gen ekspresyon profillerini üretilecek. Ancak, bitki tohumlarında yağlar, proteinler, karbohidratlar, ve polifenoller yüksek miktarlarda zor sentezlenmesinin hassas profil önleyen yüksek ölçüde saflaştırılmış RNA izole etmek istiyorum.

Burada, sıvı yağlar, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda ihtiva eden yağlı tohumlardan RNA izolasyonu için etkili bir yöntem getirmektedir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar yüksek derecede arıtılmış RNA'nın hazırlanması mümkün olacaktır. RNA geliştirilmesi ve olgun yağlı tohumlar tohum depo edilen metabolik kontrol düzenlenmesi önemli genlerin transkripsiyonel değişikliklerin izlenmesi için yararlı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki tohumları toplam RNA'nın 1. Ekstraksiyon

  1. tampon setleri, spin sütunları, 1.5 ve 2.0 ml polipropilen tüpler ve nükleaz içermeyen 1.5 mL polipropilen tüpleri hazırlayın.
  2. (Ağırlık / hacim) (bundan sonra PVP olarak anılacaktır) moleküler biyoloji sınıf polivinilpirolidon kuvvetli RNA ekstraksiyonu ve vorteks için lizis tamponu hücre% 1 ekleyin. tamamen çözülmesi, 25 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin. 20 dakika inkübasyondan sonra, kabarcıkların oluşumunu önlemek için ters tüp çevirerek hafifçe tampon karıştırın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında (15-25 ° C) muhafaza ediniz.
  3. Buz üzerinde 1.5 ml polipropilen tüpleri içinde Arabidopsis thaliana bitkileri ve yerden hasat meyveleri. alüminyum plakalar üzerine yerleştirin meyve 4 ° C'de muhafaza ve stereo mikroskop altında meyve tohumlarını izole.
    1. Sıvı n tüpleri hemen buz üzerine bir alüminyum rafın saklanan 1.5 ml polipropilen tüplere izole tohumları (yaklaşık olarak 200 tohum) yerleştirin veitrogen.
  4. sıvı azot tüpleri çıkarın ve buz üzerinde alüminyum raf onları geri. 4 ° C'de 1000 x g'de 1% 1 dakika için PVP ve santrifüj ihtiva eden tampon 100 ul ekle.
  5. Buz üzerinde, alüminyum rafın tüp tutulurken 60 saniye için bir motor-öğütücü kullanılarak paslanmaz çelik bir havan tokmağı ile homojenize örnek.
  6. % 1 PVP içeren tampon 550 mcL ters tüp çevirerek tampon hafifçe karıştırın ve 25 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
  7. 5 25 ° C'de 8000 x g'de dakika ve yeni bir 1.5 ml polipropilen tüpe Süpernatant 550 uL santrifüjleyin.
  8. 5 25 ° C'de 10,000 x g'de dakika ve yeni bir 1.5 ml polipropilen tüpe Süpernatant 450 uL santrifüjleyin.
  9. RNA ekstraksiyonu için hücre lizatı gibi süpernatant kullanın. Bundan sonra, piyasada mevcut olan kit üreticinin talimatlarında açıklanan prosedürü uygulayın.
  10. ZehirRNA, düşük seviyede transkriptlerinin ekspresyonu kontrolü için RNA yeterince yüksek bir konsantrasyonunu sağlamak için elüsyon tamponunun minimum hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir. kullanılıncaya kadar derin dondurucuda RNA saklayın.

RNA Kalite 2. Doğrulama

  1. Toplam RNA çözülme nazik dokunarak karıştırın ve buz üzerinde bir alüminyum rafa tüp yerleştirin.
  2. Bir microvolume spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu, A260 / A280 oranı ve A260 / A230 oranı ölçün.
  3. 70 ng / ml bir son konsantrasyona kadar, RNaz içermeyen su içinde toplam RNA seyreltilir.

Tohumlar toplam RNA'nın 3. Ters Transkripsiyon

  1. ticari kit toplam RNA ve tampon setleri çözülme. nazik dokunarak sonra buz üzerinde kiti enzimleri tutun. nükleaz içermeyen 0.2 ml polipropilen tüpleri hazırlayın.
  2. 0.2 mL Polipropilen 5 toplam RNA uL, 1 uL Oligo dT primeri (50 uM) ve 1 Random uM 6-mer (50 uM) ilavebuz üzerinde lene tüp.
  3. 37 ° C 'de 15 dakika boyunca inkübe ve buz üzerine yerleştirin.
  4. Bundan sonra, ters transkripsiyon-PCR kiti üreticinin talimatlarında açıklanan prosedürü uygulayın.
  5. Kullanmadan önce buz üzerinde ters transkripsiyon ürünlerini yerleştirin.

4. Kantitatif Real-time PCR Analizi

  1. üreticinin protokolünü kullanarak, hedef gen dizilerini barındıran plasmidleri oluşturun.
  2. standart eğrileri için DNA şablonları 100-500,000 kopya / uJ'ye konsantrasyonları ayarlayın.
  3. damıtılmış suyla: cDNA çözümleri (100 1) seyreltin.
  4. 2 seyreltilmiş cDNA çözümleri uL ve kantitatif real-time PCR kiti master karışımı standart eğriler için plazmidler ekleyin.
  5. 30 sn için 95 ° C ve daha sonra 5 saniye boyunca 95 ° C 'de 40 döngü 35 sn için 60 ° C: Aşağıdaki bisiklet koşulları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ayarlayın.
  6. adama göre kopya sayısını analizGerçek zamanlı PCR sistemi olarak üreticinin talimatları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ilk Arabidopsis olgun tohum kullanılarak PVP optimal konsantrasyonunu araştırdık. Toplam RNA,% 0,% 0.25,% 0.5,% 1.0 veya% 2.0 PVP içeren hücre parçalama tamponu kullanılarak, yukarıda tarif edilen protokole göre yaklaşık 1.000 tohumlardan izole edildi. Yağ tabakası ve tohum artıkları (Şekil 1A) kaçınarak homojenizasyon ve santrifüj sonrasında üst faz toplanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen ekspresyon profilleri bitki fizyolojisinin anlayışımıza katkıda; Bu nedenle, belirli bir RNA izolasyon yöntemleri her bir örnek durum 9-12 geliştirilmiştir. Tohumları RNA izolasyonu sırasında inhibe ve RNA silika membranlanna bağlanan ölçüde inhibe olduğu bulundu işlemleri incelenmiştir. Yağ, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda RNA izolasyonu inhibe eder. Biz RNA silika membranların bağlanma işleminden önce bir parçalama solüsyonu ile bu bileşikleri kaldırmak için RNA ekstraksiyon işlemi güncelle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz İşlevsel Genomik Tesisi ve spektrografisi ve Biyogörüntüleme Tesisi, NIBB Çekirdek Araştırma Hizmetleri ve Model Bitki Araştırma Tesisi, NIBB Bıoresource Merkezi'nin çalışanlarına teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
polivinilpirolidonSigma-AldrichP5288-100G
HOMOJENIZATÖR S-303TEK OLARAK1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reaktif Kiti (Mükemmel Gerçek Zamanlı)TAKARARR037A
KAPA SYBR Hızlı qPCR kitiKapa biosystemsKK4601

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA zolasyonuTohum RNA EkstraksiyonuPVP Tampon Y ntemiY ksek Safl kta RNASpin Kolon Y ntemiReal Time PCRSpektrofotometre AnaliziYa l Tohum TohumlarArabidopsis Tohumlar

İlgili makaleler