Yöntem makalesi

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

DOI:

10.3791/55016

⸱

23 Aralık 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, protein-DNA etkileşimlerinin baz çiftine yakın çözünürlüğünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu, kromatin immünopresipitasyonu (ChIP-exo) ile seçici olarak zenginleştirilmiş DNA fragmanlarının eksonükleaz muamelesi ve ardından yüksek verimli dizileme ile elde edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) epigenetik ve spesifik protein-DNA etkileşimlerini izolatlarının gen regülasyonu alanlarında vazgeçilmez bir araçtır. Yüksek verimli sekanslama (Chip seq) bağlı ChIP yaygın kromatin etkileşim proteinlerin genomik konumunu belirlemek için kullanılır. Ancak, ChIP-seq birkaç yüz baz çifti nispeten düşük haritalama çözünürlük ve yüksek arka plan sinyali tarafından engellenmektedir. ChIP-ekzo yöntemi esas çözünürlük ve gürültü hem geliştirir ChIP-seq bir rafine versiyonu. ChIP-ekzo metodolojisinin kilit ayrım etkili bir sol ayak izini kütüphane hazırlık iş akışında lambda eksonükleaz sindirim birleşme ve protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 'DNA sınırları olduğunu. ChIP-ekso diziler daha sonra, yüksek sekanslama tabi tutulur. Elde edilen veriler fonksiyonel organizasyon o içine eşsiz ve ultra-yüksek çözünürlüklü bir anlayış sağlamak için kaldıraçlı olabilirgenom f. Burada, biz optimize edilmiş ve memeli sistemlerinde ve yeni nesil dizileme-by-sentez platformu için aerodinamik olan ChIP-exo yöntem açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) seçici canlı hücreler belirli bir protein ile etkileşime DNA fragmanlarının için zenginleştirerek gen regülasyonu mekanizmaları incelemek için güçlü bir yöntemdir. Teknolojisi, yüksek verimlilik sıralaması (ChIP-seq) 1 ila oligonükleotid array (ChIP-chip) üzerine melezleşme tek bir lokus (standart ChIP-qPCR) tespiti itibaren, iyileştikçe ChIP zenginleştirilmiş DNA parçalarının tespit yöntemleri geliştirmişlerdir. ChIP-seq yaygın bir uygulama, kromatin heterojeniteyi ve nonspesifik DNA etkileşimleri gördü rağmen yanlış pozitif ve kesin olmayan eşleme önde gelen veri kalitesi engel olmuştur. Bu sınırlamaları aşmak için, Dr. Frank Pugh ChIP-ekzo yöntemi 2 geliştirdi. ChIP-ekso belirgin özelliği etkin yerleri bağlayıcı transkripsiyon faktörü ayak izi, ekzonükleaz 'ila 3' 5 sahip olmasıdır. Sonuç olarak, ChIP-exo metodolojisi daha yüksek çözünürlük, gözetleme daha dinamik aralık elden ve alt arka plan gürültü.

ChIP-exo daha teknik açıdan zor ChIP-seq daha usta olmasına rağmen çalışmalar çeşitli biyolojik sistemler 3-8 kullanarak benzersiz ultra yüksek çözünürlüklü anlayışlar kazanmak amacı olarak, yaygın olarak kabul ediliyor. Gerçekten de, yonga-ekso başarılı bakteri, maya, fare, sıçan ve insan hücre sistemlerine uygulanmıştır. Prensip kanıtı olarak, ChIP-exo başlangıçta maya transkripsiyon bir avuç 2 faktörleri için kesin bağlayıcı motifi tanımlamak için kullanıldı. Bu teknik aynı zamanda, transkripsiyon, ön başlatma kompleksinin organizasyonunu çalışma ve çeşitli histon 9,10 subnucleosomal yapısını çözmek için maya kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, insan rehberleri etkinliklerde bağlama bitişik TFIIB ve Pol II gidermek için ChIP-exo kaldıraçlı ve farklı başlangıç 11 kompleksleri gelen yaygın farklı transkripsiyon ortaya gösterdi.

Burada sunulan iş akışı optimize ve sMemeli ChIP-ekso (Şekil 1) için treamlined. İlk olarak, canlı birincil ya da doku kültürü hücreleri, bir kovalent çapraz bağlanırlar in vivo protein-DNA etkileşim bölgesindeki korumak için formaldehit ile muamele edilir. Hücreler parçalanır ve kromatin ~ 100 makaslanmış - 500 baz çifti boyutu fragmanları. ChIP sonra seçici ilgili protein çapraz bağlanmış DNA parçaları için zenginleştirir. Bu noktada, yonga-DİZİ kütüphaneler doğal birkaç yüz baz çifti ortalama fragman büyüklüğü algılama çözünürlüğünü sınırlar hazırlanır. Ancak, ChIP-exo sol ve lambda eksonükleaz ile protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 'DNA sınırları kırparak bu sınırlama üstesinden gelir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Ardışık kütüphaneleri eksonükleaz ile sindirilmiş DNA inşa edilir. Elde edilen iç içe geçmiş 5 'sınırları protein-DNA etkileşim (Şekil 1, aşama 14), bir in vivo ayak izi temsil eder ve yüksek sekanslama ile tespit edilir. Although ChIP-ekzo metodolojisi ChIP-seq daha katılır, çoğu adımlar arasındaki geçişler örnek kaybı ve deneysel değişkenliği en aza indirir basit boncuk yıkama gerektirir. Önemlisi, ChIP-ekzo ChIP-seq, aynı zamanda ChIP-exo başarılı olmalıdır ChIP-seq ile başarılı herhangi bir örnek bir rafine versiyonu beri.

ChIP-seq bir temelde farklı bir veri yapısında ChIP-ekzo sonuçları ile protein-DNA etkileşimleri in vivo ayak izi. Ortak ChIP-seq arayanlar en hassas zirve aramaları elde etmek için, ChIP-ekzo verilerine tatbik edilebilir ancak biz özellikle akılda ChIP-ekzo verilerin benzersiz yapısı ile tasarlanmış biyoinformatik araçlar öneriyoruz. Bunlar Genetrack, GEM, OKVO, Peakzilla ve ExoProfiler 12-15 arasındadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Çift distile H 2 O veya moleküler sınıf eşdeğer tüm tamponlar ve reaksiyonlar karışımları için tavsiye edilir.

Gün 0: Malzeme Hazırlama ve Hücre Hasat

1. Tampon Hazırlama

  1. 3 (Tablo 1 - 3 -) Lizis Tampon 1 hazırlanması ve kullanımdan hemen önce, her tampon, 50 ml 100 ul tam proteaz inhibitör stokları (CPI) ekleyin. Bir tablet 1 mL moleküler sınıf H 2 O eriterek TÜFE stok hazırlayın
  2. ChIP Tamponlar (- 7 Tablo 4) hazırlayın. Engelleme ve RIPA tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin. Tris ve ChIP Elüsyon tamponlar TÜFE katmayın.

Adaptör oligonükleotid 2. Tavlama

Not: Belirli oligonükleotid dizileri Ek Bilgiler Bölümünde bulunabilir.

  1. Adaptör Tavlama karışımları (- 9 Tablo 8) hazırlayın. karıştırmak için girdap ve kısacaiçeriğini toplamak için tüpler dönerler. Kısım 0.5 ml tüpler her bir karışımı, 100 ul.
  2. Termosikler programı (Tablo 10) çalıştırarak oligonükleotitleri melezleşme.
    Mağaza -80 ° C oligonükleotidler tavlanmış.

Formaldehit ile Vivo Kromatin çapraz bağlama 3.

Not: Tipik ChIP deneme için, başlangıç ​​malzemesi, yaklaşık 50.000.000 hücre içermelidir.

  1. tamponlu salin fosfat taze% 37 metanol-serbest formaldehid hazır solüsyonu (PBS),% 1 (h / h), iyice karıştırın ve 10 dakika için oda sıcaklığında bekletin bir son konsantrasyona kadar hücre kültürü yıkanmıştır.
    Not: Örneğin, tipik olarak oda sıcaklığında 50 ml PBS hücrelere 1.4 mi,% 37 metanol-serbest formaldehit ekleyin. medyada proteinler formaldehit bazı gidermek beri Ayrıca, medyada çapraz bağlama formaldehit kaçının.
  2. 2.5 M glisinin eklenmesi ile bağlanma reaksiyonunu söndürün125 mM'lik bir son konsantrasyon elde e. İyice karıştırın.
  3. Buz üzerinde 50 ml tüp hücreleri aktarın. 4 ° C'de 1000 x g'de 5 dakika boyunca hücreler dönerler. Decant süpernatant.
  4. pipetleme hücre peleti tekrar süspansiyon 1 mi buz gibi soğuk 1 x PBS ekleyin. 1.5 ml tüp aktarın.
  5. 4 ° C'de 2,000 x g'de 3 dakika boyunca hücreler dönerler. Süpernatant aspire.
  6. Hemen sıvı nitrojen ile 1.5 ml tüpler içinde hücre pelletleri dondurmak yanıp söner. -80 ° C'de saklayın. Çapraz bağlı hücreler, -80 ° C'de süresiz stabildir.

1. Gün: Hücre Lizis, Sonication ve ChIP

4. Hücre Liziz

NOT: Tüm hücre parçalama bölümleri sırasında numuneler çapraz ters en aza indirmek için buz üzerinde veya 4 ° C'de muhafaza GEREKIR.

  1. Kısaca çapraz hücre pelet Çözülme. İyice 0.5 ml lisiz tamponu 1 her pelet tekrar süspansiyon ve 15 ml polistiren bir tüp içinde 4.5 ml lisiz tamponu 1 ile birleştirir.
  2. 4 ° C'de 10 dakika süre ile kaya borularsallanan bir platform üzerinde için. 4 ° C'de 2,000 x g'de, 4 dakika boyunca spin. Decant süpernatant.
  3. İyice 0.5 ml lisiz tamponu 2 her pelet tekrar süspansiyon ve 4.5 ml lisiz tamponu 2 kez yeniden süspansiyon haline ekleyin.
  4. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de 5 dakika boyunca sallayın. 4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca spin. kağıt havlu üzerine aşırı dokunun yavaşça süpernatant süzün ve.
  5. İyice 0.5 ml Lizis Tampon 3 her pelletini ve 1 ml Lizis Tampon 3 kez yeniden süspanse ekleyin. buz üzerinde nükleer lizatları tutmak ve hemen sonikasyon geçin.

Nükleer Lisatlar 5. Sonikasyon

NOT: Tüm sonikasyon bölümleri sırasında numuneler çapraz ters en aza indirmek için buz üzerinde tutulmalıdır. Aşağıdaki protokol ile birlikte kullanılan sonikatör belirli bir modeli Malzeme Tablo bulunabilir. Belirli sonikatör kullanımı ve diğer enstrümanlar için kılavuzlar ilgili ayrıntılar Ek Bilgiler Bölümünde bulunabilir.

  1. plNükleer özleri içeren 15 ml polistiren tüplerde ace rezonans adaptörleri (metalik çubuk tüp duvar temas etmemelidir).
  2. orta güçte / 30 sn KAPALI AÇIK 30 saniye ile 2 x 15 dakika oturumları için bir buz soğuk su banyosunda sonikasyon nükleer lizatları. Sadece bir seferde iki 15 ml tüpler ses dalgalarına maruz. Bu ayarlar, hücre hatları ve primer hücre tiplerinin geniş bir aralığı üzerinde çalışır, ancak kromatin kesme eksik olduğu takdirde daha fazla optimizasyon ihtiyacı olabilir.
  3. 1.5 ml tüpler içine lizat sonikasyon sonuçlarını transfer 2 x 10 ul örnekleri kontrol etmek için.
    1. çapraz bağlantılar tersine çevirmek için, 10 ul TE-RNaz A ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe Proteinaz K 0.2 ul ilk 10 ul tablet birleştirir. 4 ul 6x iksilen DNA boyası ekleyin.
    2. çapraz bağlantılar korumak için, 2 ul 6x ksilen DNA boyası ile ikinci 10 ul tablet birleştirir.
    3. Yaklaşık 30 140 V% 1.5 agaroz jel üzerinde hem örnekleri çalıştırmak - merdiveni Bromophenol boya kadar 45 dakika ijel yol aşağı s ¾.
  4. sonikasyon Başarılı (100 kesilmiş çok DNA fragmanları - 500 bp) ise, aktarımı% 10 Triton X-100 150 ul ihtiva eden 2 ml tüplere lizatları sonike edilmiştir. Vortex karıştırın.
  5. çözünmeyen kromatin ve yıkıntıları pelet haline getirildi sıkma 4 ° C'de 20,000 x g'de 10 dakika süre ile, nükleer lizat sonike.
  6. Yeni 2 ml tüp süpernatant aktarın. süresiz -80 ° C'de ChIP veya mağaza örneklerinin hemen geçin. Sonikasyon ekstreleri dondurulmuş ve bir kereden fazla çözülmüş olmamalıdır.

Boncuk 6. Kavrama Antikor

NOT: paramparça ve arka plan sinyali artacaktır çünkü asla girdap ya da donma / manyetik boncuklar Çözülme.

  1. iyice 1.5 ml tüp içine boncuk bulamaç ul stok, kısım Y karıştırdıktan sonra burada Y = 1.1 x 2.5 ul x (ChIP örnek sayısı). 2.5 ul boncuk bulamaç için bağlama kapasitesi 13 ug IgG kadardır. toplanmış boncuklar 1 mi engelleme ile 3 kez yıkayınTampon.
  2. yıkamadan sonra boncuklar daha tutarlı aliquotting için Tamponu Engelleme 10x orijinal bulamaç hacminin (25 ul / ChIP) içinde tekrar süspansiyon boncuk. Kısım 1.5 ml tüpler içine ChIP numune başına 25 ul.
  3. tekrar süspansiyon boncuk kısım tekabül eden antikor 10 ug - 5 ekleyin. Bloklama Tamponu ile 250 ul son hacim getirin. 4 ° C'de (gece boyunca 16 saat, alternatif olarak) dönüşlü bir platform üstünde 4 saat inkübe edin.
  4. Süpernatant aspire. Bağlanmamış veya fazla antikorları ayıklamak için Bloklama Tamponu bir kez 1 mL boncuk yıkayın.
  5. Boncuk konjugatların: Son yıkama aspire hemen sonra, antikoru Sonikasyon ekstreleri (~ 1.6 mi) 50.000.000 hücre eşdeğerinin eklenmesi. sonike özler hazır değilseniz, Bloklama Tamponu 100 ul tekrar süspansiyon boncuk onlar hazır olana kadar. Boncuk, kuru asla izin için kritik öneme sahiptir.

7. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP)

  1. Her çips numunesi için, sonikasyon 1.5 mL kombined antikorla özler: boncuk konjugatları 1.5 ml veya 2 ml tüpler.
  2. 4 ° C'de 9 hız ayarında bir gecede (yaklaşık 16 saat) bir mini tüp rotator üzerinde inkübe edin. Numuneler sızıntı değildir ve düzgün karıştırma emin olmak için bir kaç dakika sonra kontrol edin.

2. Gün: ChIP yıkar ve enzimatik reaksiyonların On-reçine

8. ChIP yıkar

NOT: kısaca, çapraz kontaminasyonu minimize her yıkama arasında tüpleri döndürün. birinci aspirasyon için, her numune arasında ipuçları değişir. sonraki yıkama sırasında, aynı ucu o boncuk dokunmadı sürece kullanılabilir. Doğru ChIP yıkama ile ilgili talimatlar için Ek Bilgiler bölümüne bakınız.

  1. Çok kısa bir süre mıkro kullanarak tüpleri dönmeye (~ 500 xg'de 3 sn) kapaklar sıvıyı toplamak ve 1 dakika boyunca manyetik rafa koyun. Hala manyetik raf, aspirat özü üzerinde iken.
  2. Her tüpe 0.75 mL RIPA tamponu ekleyin. manyetik rafa tüpleri çıkarınve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Manyetik raf ve aspirat süpernatant tüpler değiştirin. 7x tekrarlayın.
  3. Her tüpe 0.75 mi, 10 mM Tris HCl (pH 7.5) eklenir. manyetik rafa tüpleri çıkarın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Manyetik raf ve aspirat süpernatant tüpler değiştirin. 2x tekrarlayın.
  4. Son yıkama aspire sonra, Parlatma geçin.
    Not: 1 dakika ve aspirat süpernatant için manyetik raf karşı her inkübasyon bölümleri 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 reaksiyon ve 15,3, spin tüpler kısaca yer ve sonra. 0.75 ml Tris HCI (pH 7.5) ile 0.75 mL RIPA tamponu ve 2x yıkayın 2x.

9. Cila Tepki

  1. Master miks hesaplamaları (Tablo 11) Parlatma doldurun. Buz üzerinde 1.5 ml tüp karışımı parlatma olun. Pipet karıştırın.
  2. Geçen ChIP yıkama aspire hemen sonra, hala manyetik rafa iken her bir örnek reçine karışımı Parlatma 50 ul ekleyin. 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edinBir Thermomixer 30 ° C'de.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, A-atık geçin.

10. Reaksiyon A-atık

  1. A-atık master miks hesaplamaları (Tablo 12) doldurun. buz üzerinde 1.5 ml tüp A-atık karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen bölümü Polisaj sonra, manyetik rafa iken hala her numune reçine A-atık karışımı 50 ul ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, P7 Adaptör Ligasyonu geçin.

11. P7 Adaptör ligasyon reaksiyonu

  1. Ligasyon master miks hesaplamaları (Tablo 13) doldurun. Ligasyonu buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırmak için.
  2. Hemen bölümü A-atık sonra, 48 ul P7 bağlama ustası karışımı ve farklı Adaptör Endeksi t 2 ulo Her numune reçine manyetik rafa hala iken. Bir Thermomixer 25 ° C'de 3 x g'de 2 saat inkübe edin.
    Not: her bir örnek için, farklı indeksleri daha fazla numune tek akış hücresi sekanslanacak sağlayacaktır.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, Φ-29 Nick Repair geçin.

12. Phi-29 Nick Onarım Tepki

  1. Φ-29 master miks hesaplamaları (Tablo 14) doldurun. Buz üzerinde 1.5 ml tüp Φ-29 karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen P7 ligasyonu bölümünden sonra manyetik rafa hala yaparken, her bir örnek reçine Φ-29 karışımı 50 ul ekleyin. Bir Thermomixer 30 ° C'de 3 x g'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, Kinaz reaksiyonu geçin.

13. Kinaz Reaksiyonu

  1. (Kinaz master miks hesaplamaları doldurun Tablo 15). Kinaz buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen Φ-29 bölümünden sonra, manyetik rafa hala yaparken Kinaz 50 ul her örnek reçine karıştırın ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, Lambda Ekzonükleaz reaksiyonu geçin.

14. Lambda Ekzonükleaz Reaksiyonu

  1. Doldurun Lambda Ekzonükleaz master karışım hesaplamaları (Tablo 16). Lambda Ekzonükleaz buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen Kinaz bölümünden sonra, manyetik rafa hala yaparken Lambda ekzonükleazının 50 ul her örnek reçine karıştırın ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, RecJ f reaksiyonuna geçin.

15. RecJ fNükleazlar Reaksiyon

  1. RecJ f master miks hesaplamaları (Tablo 17) doldurun. Buz üzerinde 1.5 ml tüp RecJ f karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Manyetik rafa hala yaparken hemen Lambda Ekzonükleaz bölümünden sonra, her numune reçine RecJ f karışımı 50 ul ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, ChIP Tasfiye geçin.

16. Elüsyon ve Crosslink Ters

  1. ana karışımı hazırlayın: numune sayısı 1.5 ml tüp içinde x 1,1 x (200 ul ChIP Elüsyon Tamponu + 1 ul 20 mg / ml proteinaz K). Her numune reçine 200 ul ChIP Elüsyon Tampon + Proteinaz K ana karışımı ekleyin.
  2. yoğuşmayı önlemek için ısıtılmış kapak ile, bir Thermomixer 65 ° C'de 3 x g'de gece boyunca (yaklaşık 16 saat) inkübe edin.

3. Gün: DNA Özüiyon ve Adaptör ligasyonu

17. Elüsyon ve Crosslink Ters (devamı)

  1. 65 ° C'de gece boyunca inkübe edildikten sonra, kısa bir süre için kondensatı toplanması için numune dönerler. 1 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin örnekleri.
  2. 200 ul TE tampon maddesi (pH 7.5) ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik tübe yüzer ul transfer 200.

18. Fenol Kloroform izoamil Alkol (PCIAA) Ekstraksiyon

  1. Her bir örnek için izoamil alkol 400 ul fenol kloroform ekleyin. Vortex 20 saniye karıştırın.
  2. Oda sıcaklığında 20.000 xg (RT) 10 dakika süre ile santrifüjlenir. Dikkatli bir şekilde yeni bir tüp, üst sulu tabaka 325 ul transfer.
    Not: yeni bir tüp içine organik (alt katmanın) herhangi aktarmak özen gösterin.
  3. Her bir örnek için 3 M NaOAc (pH 5.5) ve 1 ul 20 mg / ml glikojen 1/10 hacim. Birden fazla numuneler için, bir ana karışımı hazırlayın.
  4. Her bir örnek için buz gibi% 100 etanol 3 cilt. girdapkarıştırmak. -80 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  5. 4 ° C'de 20,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj. Dikkatle pelet rahatsız değil emin olarak süpernatant süzün.
  6. Yavaşça pelet rahatsız değil emin olun, taze buz soğuk% 70 etanol yapılan 500 ul ekleyin. 4 ° C'de 20,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice süzün.
  7. 45 ° C'de bir hızlı vakumda yaklaşık 20 dakika boyunca (ya da kuru kadar) için kuru pelet.
    NOT: Bu protokolde bir duraklama noktasıdır. Kuru DNA pelletleri -20 ° C'de saklanabilir.
  8. Arka arkaya, DNA pelet, kurutuldu pelet görülemez halde alanı üzerinde 10 ul GKD 2 O Pipet pelet tekrar.
  9. örneklerin sayısına bağlı olarak, yeni bir 0.3 ml PCR tüpü ya da 8-raf için her numune 10 ul aktarın.

19. P7 primer uzama reaksiyonuyla

  1. Doldurun P7 Primer Uzatma master karışım hesaplamaları (Tablo 18). Uzatma buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. Her 10 ul örnek Uzatma karışımı 10 ul (eksi Φ-29 polimeraz) ekleyin. Pipet karıştırın.
  3. 30 ˚C kadar şablona tavlama astar programı (Tablo 19) kullanılarak termosikler çalıştırmak numuneler adım "tutun".
  4. 30 ˚C sırasında 1 ul Φ-29 polimeraz ekle programında adım "hold". Pipet karıştırın. Program (Tablo 19) geri kalan kısmını devam edin.

20. Reaksiyon A-atık

  1. A-atık master miks hesaplamaları (Tablo 20) doldurun. buz üzerinde 1.5 ml tüp A-atık karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Her bir numune için A-atık karışımı 10 ul ekleyin. Pipet karıştırın.
  3. PCR, 75 ° C'de 20 dakika süre ile inaktive ısı, daha sonra 37 ° C'de 30 dakika boyunca numune inkübe ve.

21. P5 Adaptör ligasyon reaksiyonu

  1. fill dışarı P5 Adaptör ligasyonu master karışım hesaplamaları (Tablo 21). Ligasyonu buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. P5 Ligasyonu 20 ul her bir örnek için karıştırın ekleyin. Pipet karıştırın.
  3. PCR, 25 ° C'de 2 saat boyunca örnekleri inkübe edin.

22. Boncuk Temizlik-up

Not: temizlemek boncuk üzerinde üretici ayrıntılar için malzemeler bölümüne bakınız.

  1. yeni bir 1.5 ml'lik tübe her biri 50 ul örnek aktarın.
  2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 15 hız ayarında küçük bir tüp rotator boncuk temizlemek yeniden süspanse edin. boncuk pipetleme önce yerleşmek izin vermeyin.
  3. örnek 60 ul temizlemek boncuk ekleyin (1.2: oranını örnek boncuk temizlemek 1 kısa 200'den baz çifti olan DNA kaldırmak için kritik öneme sahiptir). Pipet 20 saniye karıştırın.
  4. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 15 hız ayarında bir mini tüp rotator boncuk temizlemek tekrar süspansiyon. Kısaca tüpler dönerler.
  5. 1 dakika boyunca manyetik rafa tüpler yerleştirin.kapalı pipetlemeyin ve supernatant atın.
    NOT: temiz-up boncuk kadar emmek çünkü bu bölümde vakum aspirasyonu kullanmayın.
  6. onlar manyetik rafa ise her bir örnek taze yapılmış RT% 70 etanol 400 ul ekleyin. Karıştırma. Süpernatant aspire. 2x tekrarlayın.
  7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca temizlik boncuk kurutun. boncuk renk boncuk kuru olduğunda reçine pelet görünür olacak açık kahverengi ve çok küçük çatlaklar koyu dönecek.
  8. DNA elüte etmek için, 40 ul 10 mM Tris (pH 7.5) ilave edilir. İyice 20 saniye karıştırın pipetlemeyin.
  9. 1 dakika boyunca manyetik rafa örnekleri yerleştirin. Yavaşça pipetlemeyin ve 0.3 ml PCR tüplerine 36 ul eluat doğrudan aktarmak.
  10. -20 ° C'de PCR reaksiyonu veya mağaza elüsyonların doğrudan geçin.

4. Gün: PCR ve Jel Analiz

23. PCR

  1. PCR master mix hesaplamaları (Tablo 22) doldurun. PCR karışımı olun. Pipet çok yavaşça önlemek için karıştırmak içinkabarcıklar.
  2. PCR 14 ul her 36 ul DNA örneği için karıştırın ekleyin. Pipet karıştırın. Termosikler koymak için hazır olana kadar buz üzerinde örnekleri tutun.
  3. Pozitif PCR kontrolü için, önceden hazırlanmış kütüphane yer almaktadır. PCR negatif kontrolü için, su içerir. PCR programı (Tablo 23) kullanarak termosikler çalıştırın örnekler.

24. Jel hazırlanması, DNA eksizyonu ve Görselleştirme

  1. İyice temiz ve deiyonize su ile uygun bir boyut jel kutusunu durulayın. % 1.5 agaroz jeli Hazırlama 60 ul tutabilir kalınlığında çok oyuklu bir tarakla (ihtiva eden 0.5 mg / ml etidyum bromid).
    NOT: Etidyum bromür (EtBr) kanserojen ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
  2. yoğunlaşmayı toplamak için kısaca PCR örnek tüplerini aşağı doğru döndürün.
  3. Kombine örnek 6x ksilen, DNA boya 1/5 hacim ekleyin. numune DNA ile aynı yerde göç beri DNA boyada Bromophenol maviyi kullanmayın.
  4. Tüm örnek int Yüko her bir kuyunun, tercihen örnekler arasında boş kuyular ile.
    Not: Aynı dizin ile Kütüphaneler aynı jel çalıştırmak OLMAMALIDIR.
  5. Yük 7 ul numuneler her iki yanı üzerinde, 100 bp'lik bir basamağı ifade. Yaklaşık 30-45 dakika süreyle 140 V de jel çalıştırın merdiveni Bromophenol boya ¾ yolu jel aşağı kadar.
  6. Görüntü bir düşük UV ayarında bir transilluminator'de üzerinde jel görselleştirmek ve. 500 bp - DNA fragmanlarını 200 içeren agaroz bölümleri tüketim. 125 bp çalışır adaptör dimer bandı kesmek önlemek için çok dikkatli olun.
  7. 15 ml'lik bir tüp içine, her kesilmiş jel dilim yerleştirin. Her jel diliminin rekor net ağırlığı. tüp doğrudan bu ağırlık yaz.
  8. Görüntü, kaydetmek ve doğru boyutu aralığı seçilmiş onaylamak için eksize jel açıklama.

25. Jel saflaştırma

  1. aşağıdaki değişikliklerle, üreticinin talimatlarına uygun olarak, çıkarılan jel dilimine DNA saflaştınlır.
  2. sallanan tarafından jel dilim çözülürplatformu sallanan üzerinde oda sıcaklığında. Bu çözmek için yaklaşık 20 dakika sürer.
  3. yüksek ölçüde saflaştırılmış DNA elde etmek için, kolon içinden geçtikten 0.5 mi Tampon QG sonra çözünür jel ile sütun yıkayın.
  4. 5 dakika - Tampon PE yıkamadan sonra, sütun 2 RT'de bekletin. Oda sıcaklığında 13.000 xg'de 1 dakika için Spin.
  5. Taze 1.5 ml tüp içine PCR reaksiyon ana karışımı, 40 ul EB Tampon ile uzaklaştırma numuneler için oda izin vermek için.

26. DNA Niceleme

  1. Üreticinin talimatlarına (Tablo 24) 'e göre numune hazırlayın. optik tüpler ile belirtilen enstrüman Ölçü örnekleri.
  2. ChIP-ekzo kütüphaneleri sayısal sonra, sıralama-by-sentez Bu protokolde, DNA adaptörleri ile uyumludur kimya 16 kullanan bir platform üzerinde sıralama için gönderin.
    Not: Genellikle, örneğin 2 ul miktarının için yeterli olmakla birlikte, daha fazla örnek konsantrasyonu düşük ise, gerekli olabilir. DNA, tipik verimler50 ile 200 ng arasında ly aralığı.
  3. ölçümü sonrasında, mağaza örnekleri -20 ° C'de.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki şekiller Burada sunulan ChIP-exo protokol temsili sonuçlar göstermektedir. Birkaç enzimatik adımda bilinen bir çipin seq metodolojilere aksine, yonga-ekso on ardışık göre enzimatik reaksiyonları (Şekil 1) gerekmektedir. Bu nedenle, bakım, her reaksiyon bileşeni, ilgili reaksiyon ana karışıma ilave edilir sağlamak için her adımda alınmalıdır. Biz ortaya çıkan tablo baskı, otomatik olarak reaksiyon master miks hesaplamaları gerçekleştirmek için reaksiyon Tablolar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kromatin yakın baz çifti çözünürlükte bir tarafsız, genom şekilde proteinlerin etkileşim için kesin bağlayıcı konumunu belirlemek için fonksiyonel genomik protokol mevcut. İmmüno manyetik reçine kalırken yakın baz çifti haritalama çözünürlük elde etmek için en kritik adım ChIP zenginleştirilmiş DNA eksonükleaz tedavi yöntemidir. Görünüşte, protein kompleksleri potansiyel herhangi bir alt birimi (örn kromatin remodeling kompleksleri veya nükleozom çekirdek parçacık) in vivo ayak izi engelleyeb...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Venters Lab'a ve Moleküler Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olduğum sırada ChIP-exo'nun nüansları üzerine rehberliği, akıl hocalığı ve birçok anlayışlı tartışması için Frank Pugh'a özel teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%37 formaldehit, metanol içermez, 10 x 10 ml ampulThermoFisher Scientific28908Bölüm 3
Komple Proteaz İnhibitörü kokteyli (CPI)Roche Life Science11873580001Bölüm 4, 8
Bioruptor sonikatörDiagenodeUCD200Bölüm 5
15 ml polistiren tüplerBD Falcon352095Bölüm 5
MagSepharose Protein G Xtra boncukGE Healthcare28-9670-66Bölüm 6
DynaMag-1.5 ml Yan Manyetik RafInvitrogen12321DBölüm 6-17, 22
Mini Tüp DöndürücüFisher Scientific05-450-127Bölüm 7, 22
T4 DNA PolimerazNew England BioLabsM0203Bölüm 9
DNA Polimeraz I, KlenowNew England BioLabsM0210Bölüm 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaksiyon Tamponu 2)New England BioLabsB7002Bölüm 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer CEppendorf5382Bölüm 9-16
ATPRoche Yaşam Bilimleri010419979001Bölüm 9, 11, 13
dNTP'lerNew England BioLabsN0447Bölüm 9, 12, 19, 23
T4 Polinükleotid KinazNew England BioLabsM0201Bölüm 9, 13
dATPNew England BioLabsN0440Bölüm 10, 20
Klenow 3'-5' Exo EksiNew England BioLabsM0212Bölüm 10, 20
T4 DNA ligaz New England BioLabsM0202Bölüm 11, 21
&;-29 DNA polimerazNew England BioLabsM0269Bölüm 12, 19
10x Φ-29 TamponNew England BioLabsB0269Bölüm 12, 19
Lambda EksonükleazNew England BioLabsM0262Bölüm 14
10x Lambda TamponuNew England BioLabsB0262Bölüm 14
RecJf EksonükleazNew England BioLabsM0264Bölüm 15
Proteinaz KRoche Yaşam Bilimleri03115828001Bölüm 16
GlikojenRoche Yaşam Bilimleri010901393001Bölüm 18
10x T4 Ligaz TamponuNew England BioLabsB0202Bölüm 21
AMPure XP (temizleme) boncuklar Beckman CoulterA63881Bölüm 22
Q5 Sıcak Başlangıç DNA Polimeraz New England BioLabsM0493Bölüm 23
5x Q5 Tamponu (5x PCR Tamponu)New England BioLabsB9027Bölüm 23
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704Bölüm 25
Qubit FlorometreInvitrogenQ33216Bölüm 26
Optik Şeffaf Qubit tüpleri InvitrogenQ32856Bölüm 26
Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyetli Test kitiInvitrogenQ32851Bölüm 26

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339(2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lambda Ekzon kleaz SindirimiKromatin mm nopresipitasyonY ksek Verimli SekanslamaSonikasyon Ko ullarManyetik Raf nk basyonuRecJf N kleaz ReaksiyonuBioanalyzer De erlendirmesiTranskripsiyonel Ba lang B lgeleri

İlgili makaleler