Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

Özet

İnsan postmortem beyin leptomeninkslerde eksplant kültür protokolü 6-8 hafta içinde fibronektin pozitif meningeal fibroblastlar elde ve yaklaşık 20-30 mikrogram milyon hücre cryopreserve için teknik sağlam ve basit bir yoludur.

Özet

Büyük ilerleme Parkinson hastalığının klinik karakterizasyonu yapılmış olsa bile, bazı çalışmalar Parkinson hastalığı tanısı patolojik klinik olarak teşhis Parkinson hastalığı% 25 kadar teyit olmadığını bildirmektedir. Bu nedenle, doku yanlış tanı yüksek oranda olabilir idiyopatik Parkinson hastalığı olan klinik tanısı alan hastaların toplanan; Bir klinik öncesi bir model beyhude olabilir gibi dolayısıyla bu tür dokulardan in vitro çalışmalar Parkinson hastalığı incelemek için.

Parkinson hastalığının bir teyit nöropatolojik tanısı ile postmortem insan leptomeningial toplama ve nigrostriatal hücre kaybı ve Lewy cisimcikleri denilen hücre içi protein kapanım ile karakterize tarafından, bir klinik gözlenen parkinsonizm altta yatan başka bir hastalık süreci (örneğin tümör, damar sertliği) neden olmadığından emin olabilirsiniz.

Bu protokol, miyodiseksiyon ve meningeal fibroblast kültürü türetilmesi için postmortem insan leptomeninks hazırlanması ts. Bu prosedür sağlam ve yüksek bir başarı oranına sahiptir. Beyin tedarik genellikle steril koşullar altında yapılır değil gibi kültürün meydan kısırlık olduğunu. Nedenle, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B bir kokteyli ile kültür ortamı tamamlanması önemlidir

Parkinson hastalığı olan otopsi doğrulanmış vakaların gelen Meningeal fibroblast türetme Parkinson hastalığı in vitro modelleme için temel sağlar. Meningeal fibroblastlar 3-9 gün numune hazırlandıktan sonra ortaya çıkar ve yaklaşık 20-30 milyon hücre 6-8 hafta içinde dondurularak saklanabilir. Meningeal fibroblast kültürü homojen ve hücreler fibronektin, meninksler tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici ifade eder.

Giriş

dura mater, araknoid ve pia mater: zarları beyni korumak üç membranların oluşur. Daha yakın zamanlarda, meninksler da beyin gelişimi ve beyin homeostazında ¹ önemli bir rol oynadığı kabul edilmiştir. Zarları mezenşimal ve nöral tepe türetilmiş hücrelerden elde edilir ve ilginç bir şekilde, in vitro ve in ^{vivo, 2, 3, 4 ve} transplantasyon sonrası nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir meninks ikamet eden progenitör hücreler gösterilmiştir. Bunlar dopaminerjik nöronlar ⁵ embriyonik kök hücre farklılaşması için stromal hücre türevli indükleyici aktivite gösterirler zarları kültürleri de başarılı bir şekilde, besleyici tabakalar olarak kullanılmıştır. Ayrıca, leptomeninkslerde doğrudan iskemik koşullarda ⁶ altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere içine ayırt etme potansiyeline sahiptir.

Bu protokol için, insan postmortem zarları örnekleri topluca, araknoid ve pia mater toplanan leptomeningial denilen ve araştırma amaçlı bir insan beyninin bağışı parçası olarak temin edilir edilir. beyin Diseksiyon ölüm 24 saat içinde gerçekleştirilir, bu protokolde burada gösterildiği gibi leptomeninkslerde Örnek daha sonra 6-8 saat içinde daha fazla işlem için soğuk büyüme ortamı içinde yerleştirilir.

Bu protokol, hastaya primer leptomeninkslerde hücre kültürü gelişimi için diseksiyon ve insan beyin zarı numunelerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Doku, yaklaşık 3 mm x 3 mm kare 25-30 parçalar halinde kesilir. Üç adet her biri 6-kuyu yerleştirilir jelatin kaplı iyi ve yuvarlak cam lamelleri aşağı düzenledi. zarları diseksiyon yaklaşık 25-35 dakika sürer. Bu kültürün ana zorluk beyin tedarik, taşıma ve diseksiyon olarak sterilite genellikle steril koşullar altında yapılır edilmemektedir. Therefore, penisilin, streptomisin, ve amfoterisin B'nin bir kokteyl ile kültür ortamını desteklemek ve ayrı ayrı kültür doku parçaları çok iyi yemekler kullanmak önemlidir.

Meningeal fibroblast akıbet genellikle ilk hafta içinde ortaya çıkar. Hücreler birleştiklerinde kadar Ortam, her iki ya da üç günde bir değiştirilir ve hücreler, enzimatik olarak geçirilir. Meningeal fibroblastlar dondurulması medyada ml / şişe başına 1 Milyon hücre Kriyoprezerve bulunmaktadır. Bu protokol ile, 20-30.000.000 meningeal fibroblastlar dondurulması için 6-8 hafta içinde elde edilebilir. Bu Meningeal fibroblastların Mansap uygulamaları hastalık araştırması, doğrudan nöronal farklılaşma ya da hastalık mekanizmalarının anlaşılması için ve ilaç geliştirme leptomeninks gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin derivasyon için birincil kültürleri vardır.

Protokol

Beyin bağış kaydı bağışlamak için kendi niyet tescil ile belgeleri içerir. yasaların izin verdiği şekilde doku alımı için otopsi izni yakın akraba tarafından sağlanmaktadır. Toplanan otopsi örnekleri kullanarak araştırma çalışmaları Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) düzenlemelerine uyum sağlamak için kurumsal inceleme kurulu (KİK) tarafından gözden geçirilmektedir.

NOT: leptomeninkslerde örnekleri beyin diseksiyonu sırasında beyin dissektör veya nöropatolog ile toplanır ve 25-30 ml Meninksler büyüme ortamı içeren 50 ml konik tüpler saklanır. Numune, numune hazırlama kadar 4 ° C'de saklanır. hücre yaşamı sürdürme kabiliyeti zaman otopsi azalır gibi işlem mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır.

1. Ayar leptomeninkslerde Diseksiyon başlayarak önce

NOT: - 1.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 1.1 adımlar.

1. 375 mL Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde birleştirerek zarları büyüme ortamının hazırlanması, fetal sığır serumu, 100 mL, 5 mL 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 5 ml 200 mM L-alanil-L-glutamin, 5 ml 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 10,000 U / ml penisilin / streptomisin ve 5 mL, 250 ug / ml Amfoterisin B 500 mL filtre ünitesinin. Filtre ve karıştırın. kadar dört hafta ortam kullanın.
2. diseksiyon başlamadan önce biyogüvenlik kabini tüm malzemeleri koyun: 4x Petri kapları, 2x 6-kuyu plakaları, 2x neşter, 15-20 sterilize 15 mm kapak fişleri, pipetler aspire fosfat tampon salin (PBS), serolojik pipetler.
3. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna steril otoklava% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml. 30-60 dakika boyunca bir kenara plaka ayarlayın. 2x 6-kuyu tabak hazırlayın.

Leptomeninkslerde Numune 2. Hazırlık

NOT: - 2.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 2.1 adımlar.

1. PBS yaklaşık 10 ml ekleyinsteril 10-cm doku kültürü çanak ve çanak meninks numuneyi yerleştirin. forseps kullanarak, yavaşça kan kaldırmak için PBS ile leptomeningial yıkayın.
2. Taze 10 ml PBS ihtiva eden yeni bir 10 cm'lik bir doku kültürü kabı içine meninksleri aktarın ve yıkama devam edin. mümkün olduğunca çok kan çıkarmak için gerektiği kadar tekrarlayın.
3. yaklaşık 6 cm x 6 cm büyük parça halinde dokuya leptomeninkslerde kesilmiş iki neşter, kullanma.
4. yatay laminer akış kaputu bir mikroskop bir kültür çanak ve transfer yerleştirin kapağı.

Leptomeninkslerde Doku 3. Diseksiyon

NOT: - 3.3 diseksiyon mikroskobu kullanılarak yatay laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır 3,1 adımlar.

1. en az 20-25 3 mm x 3 mm parçaları oluşturmak için yeterince büyük leptomeninkslerde parça (adım 2.3) bir bölgeden kan damarlarını çıkarın. bir neşter ile yerde leptomeningial tutun ve diğer, nazik ve sığ kazıma mo kullanıntion damarları ayırmak.
2. Hazırlanan bölgeden doku küçük kareler kesin. İlk büyük parçaları yapma ve daha küçük bölümlere olanlar dilimleme kademeli süreçte kesin.
3. Sallanan hareketi ile doku kesmek için yerinde doku ve başka neşter tutmak için bir neşter kullanabilirsiniz. doku kıvamına bağlı, birbirine karşı neşter slayt zordur. Bu sadece ayrı doku gözyaşı ve düzensiz kenarları sonuçlanır olacaktır.
4. 20-25 3 mm x 3 mm parçalar vardır kadar yarısında parçaları kesme devam edin.

Doku kültürü plakaları üzerine Dissected zarları Adet 4. Transferi

Not: Aşama 4, bir biyo-güvenlik kabini içinde yapılacak olan.

1. 6-çukurlu plaka (adım 1.3) aspire jelatin. Her bir oyuğa zarları büyüme ortamı 1 ml. Steril forseps kullanarak, her kuyuya 3-4 biyopsi parçaları yerleştirin.

M üzerinde Kapak Slips 5. YerleştirmeEninges adet

NOT: - 5.2 diseksiyon mikroskobu kullanılarak yatay laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır 5.1 adımlar.

1. kuyu başına 1-2 steril 15 mm yuvarlak lamelleri ile parçaları örtün.
2. adet plakanın alt dokunmadan emin olmak için forseps ile sıkıca bastırın. Bu iyi altına, doku parçalarının bağlanmasına izin vermektedir.
3. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör içine 6-plaka.

6. Hücre kültürü Bakım

NOT: - 6.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 6.1 adımlar. lamelleri taşımak ve meninks parçaları çıkarmak değil gerektiği gibi özenle kültür kaplarına anlaştım.

1. kültür içinde 2 gün sonra, her bir oyuğa taze zarları büyüme ortamı ilave 1 ml.
2. 7. Günde dikkatle medya aspire ve her iyi taze medya 2 mL ekleyin.
3. Gün 9 sonra büyüme ortamı her değişmeye devamkültür kadar geçen gün birleşen.

7. Pasajlanması

NOT: Tüm adımlar biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır vardır. Meningeal fibroblastlar Meningeal doku parçaları dışarı göç ve büyük kültür kabına menengial fibroblastlar, kültür geminin kenarlarına doğru büyümeye genişletmek başlar sonra.

1. 15-30 dakika süreyle% 1 jelatin ile Pasajlanması, ceket kültür çanak başlamadan önce.
2. Aspire 6-iyi çanak medya ve 2 ml PBS ile yıkayın hücreleri.
3. Her kuyucuğa tripsin / EDTA 1 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kapak slipi veya bu aşama için zarı doku kaldırmak için gerekli değildir.
4. Hücreler yuvarlak ve, ayırmak kültür ortamı 2 mL ekleyin başladığınızda.
5. Pipet hücreleri yukarı ve tamamen tüm kümeleri bozmak ve büyük kültür çanak hücre çözümü transfer aşağı.
6. 1 ila 3: 1 bir oran için 4 üç 6 oyuklu tabaklar hücreleri birleştirmekbir T75 kültür çanak.
7. Meningeal fibroblastlar hücreleri T75 kültür şişelerinde birleştirilebilmeli sonra, hücreleri trypsinize ve 1x10 ⁶ hücre / ml şişe başına en kriyoprezervasyon medya cryopreserve. konfluan meningeal fibroblastlar Tek T75 kültürü şişesi yaklaşık 5-7 milyon hücre içeriyor.

Immün Meningial Fibroblast 8. Karakterizasyonu

Not: prosedürü başlamadan önce, PBS (bloke tamponu) içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi,% 5 normal keçi serumu hazırlamak% 0.3 Triton X-100, PBS (permeabilizasyon tamponu), primer ve sekonder antikor çözeltileri ve 1 ug / mL Hoechst 33342, 10 mg / ml stok PBS içinde seyreltilmiştir.

1. 8-iyi odasının slayt Tohum 15.000 30.000 meningeal fibroblastlar% 0,1 jelatin ile kaplı.
2. Hücreler eklendiğinde 24 saat sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca oyuk başına 100 uL% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100, 150 uL hücreler geçirgenliği. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
4. Oda sıcaklığında 1 st için bloke etme çözeltisi 200 uL (PBS +% 5 normal keçi serumu) ekleyin.
5. Engelleme çözüm aspire ve çözümü engelleme seyreltilmiş istenen birincil antikor 150 mcL ekleyin. çift ​​boyama için, aşağıdaki gibi, buz üzerinde ayrı bir santrifüj tüplerine birincil antikor çalışma dilüsyonları hazırlayın:
   1. Anti-Fibronektin + 1 300 seyreltme: çözümü engelleme, anti-Nestin 200 seyreltme 1 hazırlayın. Anti-SERPINH1 + 1 250 seyreltme: çözümü engelleme, anti-Tuj1 1000 seyreltme 1 hazırlayın. 1 hazırlayın: Anti-SERPINH1 250 seyreltme + 1: çözümü engelleme, anti-Sox2 100 seyreltme
6. gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
7. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
8. Bir çalışan 1 hazırlayın: ikincil antikorlar anti-tavşan keçi floresan etiketli 400 seyreltme (yeşil; Ex / Em ² 495/519 nm) ve keçi anti-fare (kırmızı Ex / Em ² 590/617 nm) bloke çözeltisi içinde ve her bir kuyucuğa 100 uL ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 saat boyunca inkübe edilir. Daha sonra 1 x PBS ile bir kez kuyu yıkayın.
9. Her bir çözüm de ve 3 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir; / ml Hoechst 1 ug ile 100 uL 33342 (Örnek / Em ² 358/461 nm mavi) ekleyin. iyi son 1x PBS yıkama bırakarak, 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve alüminyum folyo ile slayt kapsamaktadır.
10. floresan mikroskop altında hücrelerin analiz.

Sonuçlar

leptomeninkslerde işleme protokolü başarılı olmuştur bu beyin otopsi aralığının uzunluğuna bağlıdır rağmen, meningeal fibroblast akıbet, üç ile dokuz gün diseksiyonu sonrası gözlenen ilk edilir. Şekil 1, dört farklı donörlerin meningeal fibroblast kültürleri göstermektedir. Şekil 1A 10 saat 20 dk otopsi aralığına sahip 88 yaşındaki bir donörden işlendikten sonra doku dört gün etrafında bir cam kapak slip (koyu çapraz çizgi) ve fibroblast akıbet aşağı tut...

Tartışma

Bu protokol, beyin bağışı ile birlikte toplanan insan postmortem leptomeninks bir meningeal fibroblast kültürü elde etmek için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır. postmortem insan malzemeden hücre kültürleri elde etmek için protokoller çok az açıklamaları vardır. İki çalışma, Cilt türevli, fibroblast kültürler ^{7, 8, 9,} bir çalışma dura numuneler ¹⁰ tarif eder ve bir başka olmayan dondurulan don...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Corning Petri kapları	Fisher Scientific	351029
Nunc 6 oyuklu plaka	Fisher Scientific	14-832-11
15 mm lamel	fişler Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Neşterler, steril bıçak, No. 15	Miltex	4-415
Kavisli hassas uç forseps	Fisher Scientific	16-100-122
Serolojik pipetler	Fisher Scientific	13-678-11E
Pastör pipetleri	Fisher Scientific	22-230490
Jelatin	Sigma	G1890-100G
Fosfat Tampon Tuzlu	Su Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filtre ünitesi	Fisher Scientific	430770	Ortam bileşenlerini birleştirin ve filtre.
Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş Filtre Kapaklı Şişeler, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Growth Media< / strong>
Hyclone DMEM	Fisher Bilimsel	SH30081.02
Hyclone FBS	Balıkçı Bilimsel	SH30910.03
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Takviyesi (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodyum Piruvat (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amfoterisin B (Sarı Çözelti / 250 & mikro; g / mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name< / strong><	strong>Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Yorumlar< / strong>
Fibronektin Boyama< / strong>
8 kuyu odası kaydırağı	Fisher Scientific	1256518
%20 paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
%100 Gliserol&	BioRad	9455
%100 normal keçi serumu	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronektin antikoru [F1]	Abcam	ab32419	1:300 bloke edici solüsyonda seyreltme
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 bloke edici solüsyonda seyreltme
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 bloke edici solüsyonda seyreltme
Anti-Nestin	Millipore MAB5326		1:200 engelleme çözeltisinde seyreltme
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1: 1.000 engelleme çözeltisinde seyreltme
Alexa Fluor 488 anti-tavşan	Thermo Fisher	A11029	engelleme çözeltisinde 1:400 seyreltme; (Yeşil Kanal; Ör/EM2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-fare	Thermo Fisher	A21424	1:400 engelleme çözeltisinde seyreltme; (Kırmızı Kanal; Eski/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 leke	Thermo Fisher	H3570	1.0 & mu'luk bir nihai konsantrasyona seyreltin; g/mL; (Mavi Kanal; Ex/EM2 358/461 nm)
Tedarikçiler öneridir, alternatif satıcılardan benzer ürünler de kullanılabilir.

: ,, ,