İnsan postmortem beyin leptomeninkslerde eksplant kültür protokolü 6-8 hafta içinde fibronektin pozitif meningeal fibroblastlar elde ve yaklaşık 20-30 mikrogram milyon hücre cryopreserve için teknik sağlam ve basit bir yoludur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Büyük ilerleme Parkinson hastalığının klinik karakterizasyonu yapılmış olsa bile, bazı çalışmalar Parkinson hastalığı tanısı patolojik klinik olarak teşhis Parkinson hastalığı% 25 kadar teyit olmadığını bildirmektedir. Bu nedenle, doku yanlış tanı yüksek oranda olabilir idiyopatik Parkinson hastalığı olan klinik tanısı alan hastaların toplanan; Bir klinik öncesi bir model beyhude olabilir gibi dolayısıyla bu tür dokulardan in vitro çalışmalar Parkinson hastalığı incelemek için.
Parkinson hastalığının bir teyit nöropatolojik tanısı ile postmortem insan leptomeningial toplama ve nigrostriatal hücre kaybı ve Lewy cisimcikleri denilen hücre içi protein kapanım ile karakterize tarafından, bir klinik gözlenen parkinsonizm altta yatan başka bir hastalık süreci (örneğin tümör, damar sertliği) neden olmadığından emin olabilirsiniz.
Bu protokol, miyodiseksiyon ve meningeal fibroblast kültürü türetilmesi için postmortem insan leptomeninks hazırlanması ts. Bu prosedür sağlam ve yüksek bir başarı oranına sahiptir. Beyin tedarik genellikle steril koşullar altında yapılır değil gibi kültürün meydan kısırlık olduğunu. Nedenle, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B bir kokteyli ile kültür ortamı tamamlanması önemlidir
Parkinson hastalığı olan otopsi doğrulanmış vakaların gelen Meningeal fibroblast türetme Parkinson hastalığı in vitro modelleme için temel sağlar. Meningeal fibroblastlar 3-9 gün numune hazırlandıktan sonra ortaya çıkar ve yaklaşık 20-30 milyon hücre 6-8 hafta içinde dondurularak saklanabilir. Meningeal fibroblast kültürü homojen ve hücreler fibronektin, meninksler tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici ifade eder.
Giriş
dura mater, araknoid ve pia mater: zarları beyni korumak üç membranların oluşur. Daha yakın zamanlarda, meninksler da beyin gelişimi ve beyin homeostazında 1 önemli bir rol oynadığı kabul edilmiştir. Zarları mezenşimal ve nöral tepe türetilmiş hücrelerden elde edilir ve ilginç bir şekilde, in vitro ve in vivo, 2, 3, 4 ve transplantasyon sonrası nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir meninks ikamet eden progenitör hücreler gösterilmiştir. Bunlar dopaminerjik nöronlar
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Beyin bağış kaydı bağışlamak için kendi niyet tescil ile belgeleri içerir. yasaların izin verdiği şekilde doku alımı için otopsi izni yakın akraba tarafından sağlanmaktadır. Toplanan otopsi örnekleri kullanarak araştırma çalışmaları Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) düzenlemelerine uyum sağlamak için kurumsal inceleme kurulu (KİK) tarafından gözden geçirilmektedir.
NOT: leptomeninkslerde örnekleri beyin diseksiyonu sırasında beyin dissektör veya nöropatolog ile toplanır ve 25-30 ml Meninksler büyüme ortamı içeren 50 ml konik tüpler saklanır. Numune, numune hazırlama kadar 4 ° C'de saklanır. hücre yaşamı sürd....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
leptomeninkslerde işleme protokolü başarılı olmuştur bu beyin otopsi aralığının uzunluğuna bağlıdır rağmen, meningeal fibroblast akıbet, üç ile dokuz gün diseksiyonu sonrası gözlenen ilk edilir. Şekil 1, dört farklı donörlerin meningeal fibroblast kültürleri göstermektedir. Şekil 1A 10 saat 20 dk otopsi aralığına sahip 88 yaşındaki bir donörden işlendikten sonra doku dört gün etrafında bir cam kapak slip (koyu çapraz çizgi) ve fibroblast akıbet aşağı tut.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, beyin bağışı ile birlikte toplanan insan postmortem leptomeninks bir meningeal fibroblast kültürü elde etmek için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır. postmortem insan malzemeden hücre kültürleri elde etmek için protokoller çok az açıklamaları vardır. İki çalışma, Cilt türevli, fibroblast kültürler 7, 8, 9, bir çalışma dura numuneler 10 tarif eder ve bir başka olmayan dondurulan don.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu protokolün geliştirilmesi, Parkinson Enstitüsü Beyin Bağışı Programına yönlendirilen özel bağışlarla finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Corning Petri kapları | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6 oyuklu plaka | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15 mm lamel | fişler Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Neşterler, steril bıçak, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Kavisli hassas uç forseps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serolojik pipetler | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pastör pipetleri | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Jelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Fosfat Tampon Tuzlu | Su Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filtre ünitesi | Fisher Scientific | 430770 | Ortam bileşenlerini birleştirin ve filtre. |
| Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş Filtre Kapaklı Şişeler, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name< / strong> | Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Comments< / strong> |
| Growth Media< / strong> | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Bilimsel | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Balıkçı Bilimsel | SH30910.03 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Takviyesi (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodyum Piruvat (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amfoterisin B (Sarı Çözelti / 250 & mikro; g / mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name< / strong>< | strong>Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Yorumlar< / strong> |
| Fibronektin Boyama< / strong> | |||
| 8 kuyu odası kaydırağı | Fisher Scientific | 1256518 | |
| %20 paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| %100 Gliserol& | BioRad | 9455 | |
| %100 normal keçi serumu | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronektin antikoru [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 bloke edici solüsyonda seyreltme |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 bloke edici solüsyonda seyreltme |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 bloke edici solüsyonda seyreltme |
| Anti-Nestin | Millipore MAB5326 | 1:200 engelleme çözeltisinde seyreltme | |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1: 1.000 engelleme çözeltisinde seyreltme |
| Alexa Fluor 488 anti-tavşan | Thermo Fisher | A11029 | engelleme çözeltisinde 1:400 seyreltme; (Yeşil Kanal; Ör/EM2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-fare | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 engelleme çözeltisinde seyreltme; (Kırmızı Kanal; Eski/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 leke | Thermo Fisher | H3570 | 1.0 & mu'luk bir nihai konsantrasyona seyreltin; g/mL; (Mavi Kanal; Ex/EM2 358/461 nm) |
| Tedarikçiler öneridir, alternatif satıcılardan benzer ürünler de kullanılabilir. |
Kaynaklar
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
