Yöntem makalesi

yetiştirme Caenorhabditis elegans Laboratuvarı Üç boyutlu

DOI:

10.3791/55048

⸱

12 Aralık 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz NGT-3D ve NGB-3D olarak adlandırılan 3D nematod yetiştirme sistemlerini inşa etmek basit bir yöntem mevcut. Bu standart 2D laboratuvar C. elegans kültür plakaları daha doğal Caenorhabditis elegans habitatlar daha benzer habitatlarda nematod fitness ve davranışları incelemek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans gibi genetik model organizmaların kullanımı, son elli yılda biyolojide ufuk açıcı keşiflere yol açmıştır. C. elegans hakkında bildiklerimizin çoğu, normalde doğada yaşadıkları ortamları yansıtması gerekmeyen nematodların laboratuvarda yetiştirilmesiyle sınırlıdır. C. elegans'ın, solucanların doğada çürük meyvelerde ve vejetatif kompostta karşılaştıkları 3 boyutlu matrise daha çok benzeyen 3 boyutlu bir habitatta yetiştirilmesi, 2 boyutlu olarak gözlemlenmeyen yeni fenotipleri ve davranışları ortaya çıkarabilir. Ek olarak, 3D'deki deneyler, 2D'de gözlemlediğimiz fenotiplerin doğadaki solucan için nasıl alakalı olduğunu ele alabilir. Burada, C. elegans'ın normal olarak üç boyutta büyüdüğü ve çoğaldığı yeni bir yöntem sunulmaktadır. C. elegans'ın Nematod Büyüme Tüpü-3D'de (NGT-3D) yetiştirilmesi, C. elegans suşlarının üreme uygunluğunu veya 3D ortamda farklı koşulları ölçmemize izin verebilir. Ayrıca, mikroskobik analiz için C. elegans'ı 3D olarak yetiştirmek için Nematod Büyüme Şişesi-3D (NGB-3D) olarak adlandırılan yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemler, bilim adamlarının C. elegans biyolojisini doğada karşılaştıkları ortamları daha fazla yansıtan koşullarda incelemelerine olanak tanır. Bunlar, laboratuvarda gözlemlediğimiz C. elegans'ın fizyolojisi ve davranışının altında yatan evrimsel önemi anlamamıza yardımcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nematod Caenorhabditis elegans'ın laboratuvarda incelenmesi, son elli yılda biyoloji alanında ufuk açıcı keşiflere yol açmıştır1. C. elegans, 1998'degenomu dizilenen ilk çok hücreli organizmaydı 2 ve bireysel genlerin bütün bir organizmanın gelişimine, fizyolojisine ve davranışına katkılarını anlamada paha biçilmez olmuştur. Bilim adamları şimdi bu genlerin organizmaların doğal ortamlarında hayatta kalmasına ve üreme sağlığına nasıl katkıda bulunabileceğini daha iyi anlamaya çalışıyorlar ve genetik düzeyde ekoloji ve evrim hakkında sorular soruyorlar3-5.

C. elegans bir kez daha bu soruları cevaplamak için mükemmel bir sistem sağlayabilir. Bununla birlikte, doğal nematod habitatlarında C. elegans biyolojisi hakkında çok az şey bilinmektedir ve laboratuvarda C. elegans'ın kontrollü doğal koşullarını simüle etmek için mevcut bir yöntem yoktur. Laboratuvarda, C. elegans, E. coli bakterileri6 ile tohumlanmış agar plakalarının yüzeyinde yetiştirilir. Bununla birlikte, doğada, C. elegans ve ilgili nematodlar, dünya genelinde seyrek olarak yaşayan topraklarda bulunabilir, ancak özellikle çürüyen meyvelerde ve bitkisel maddelerde gelişirler7,8. Bu üç boyutlu (3D) karmaşık ortamlar, solucanların laboratuvarda maruz kaldığı basit 2D ortamlardan oldukça farklıdır.

Nematodların biyolojisi ile ilgili soruları daha doğal bir 3D ortamda yanıtlamaya başlamak için, nematodların laboratuvarda yetiştirilmesi için Nematod Growth Tube 3D veya kısaca NGT-3D olarak adlandırdığımız bir 3D yaşam alanı tasarladık9. Amaç, standart 2D Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları10 ile karşılaştırılabilir büyüme, gelişme ve doğurganlığa izin veren bir 3D büyüme sistemi tasarlamaktı. Bu sistem, bakteri ve nematodların tüm yaşam döngüleri boyunca 3D olarak büyümesini destekler, solucanların üç boyutta serbestçe hareket etmesine ve davranmasına izin verir ve üretimi ve kullanımı kolay ve ucuzdur.

Mevcut çalışmada, NGT-3D'yi üretmek ve solucan gelişimini ve doğurganlığını değerlendirmek için adım adım bir yöntem sunuyoruz. Solucan uygunluğunu 3D olarak değerlendirmenin yanı sıra, 3D yetiştiricilikte solucan davranışını ve fizyolojisini görüntülemeye, videoya çekmeye ve değerlendirmeye çalıştık. Bu nedenle, NGT-3D'ye ek olarak, burada 3D yetiştirme sırasında C. elegans'ın mikroskobik görüntülenmesi için Nematod Büyüme Şişesi 3D veya NGB-3D adı verilen alternatif bir yöntem sunuyoruz. Bu, 2B'de tanımlanan bilinen davranışların incelenmesi ve 3B yetiştirmeye özgü yeni davranışların tanımlanması için özellikle önemli olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. NGT-3D ve NGB-3D Çözümler hazırlayın

  1. Aşağıdaki steril çözeltiler hazırlayın: 0,1454 M NaCl çözeltisi 1 L'lik, 1 M CaCl2, 1 M MgSO 4 ile 1 L 1 L lizojeni Broth (LB), KH 2, 1 M KPO 4 tampon (108.3 g, 1 L PO 4 ve K 2 35.6 g HPO 4 ve dolgu H2O 1 l). Bu çözümleri kullanarak NGM üretimi bir önceki protokolde 10 bulunabilir.
  2. 121 ° C, 15 dk Otoklav çözümler.
  3. Steril 5 mg / ml, kolesterol çözeltisi 50 ml hazırlayın. 50 ml'lik konik bir tüp içinde, kolesterol 0.25 g ve% 99.99 50 ml etanol karışımı ve iyice karıştırın. Otoklavlamayın. 0.45 um'lik bir şırınga filtresi ile 50 ml'lik bir şırınga kullanarak, kolesterol solüsyonu sterilize edin. Bu aynı zamanda herhangi bir çözülmemiş kolesterolü ortadan kaldıracaktır.
  4. 2'-deoksi-5-f (FUDR) stokunun 150 mM 10 ml hazırlayın (İsteğe bağlı). 15 ml konik tüp içinde, 0,3693 g mixFudR ve damıtılmış su, 10 ml. İyi çalkala.

2. NGT-3D ve NGB-3D Bakteriler Kültür hazırlayın

  1. Bakteri 10 mi LB suyu inoküle. Besleme C. elegans için kullanılan standart bakteri E. coli OP50 olduğunu.
  2. Kültür gece boyunca bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C sıcaklıkta bakteriyel aşılama.
  3. Seri seyreltme için hazırlık olarak, steril 15 ml konik tüp içine NaCl solüsyonu tümböleni 9 mi. Örneğin, 7 tüpler toplam içine kısım 9 mi OP50 soyu, E. coli 10 -7 seyreltme yapmak.
  4. NaCl çözeltisi 9 ml steril yeni bir tüp içine steril 1000 ul pipet, pipet bakteri kültürü 1 ml ya da seyreltilmiş bakteri kültürü kullanılarak ve de 10 mi karışımı girdap. İstenilen bakteriyel seyreltme ulaşana kadar tekrarlayın.
    Not: İstenilen bakteriyel seyreltme Çeşidi ve durum bakterilerin yanı sıra tam deney koşullarına bağlıdır.Örneğin, bir 10 6 - 6.5 mi NGT-3D tüp başına 200 bakteri kolonilerinin - OP50 soyu, E. coli 10 -8 seyreltme 1 üretilmesi için yeterli idi. Solucanlar güvenilir geliştirilen ve kolonilerin sayısı 10 -6 dilusyondaki meydana geldiği, 60 üzerinde iken normalde yeniden - 10 -7. NGB-3D, 10 -8 bir seyreltme kullanın.

3. yapma NGT-3B ve NGB-3D (200 mi)

  1. bakteri kültürü hazırlandıktan sonra, 0.6 g NaCl, 1 g granüle agar ve 500 ml'lik bir şişe içinde 0.5 g pepton karıştırın. şişeye, bir manyetik karıştırma çubuğu ile yerleştirin.
  2. 195 ml damıtılmış su ekleyin ve alüminyum folyo ile balonun ağzını kapsamaktadır.
  3. 15 dakika boyunca Otoklav 121 ° C.
  4. bir heyecan plaka üzerine sıcak otoklava balon yerleştirin ve en az 2 saat süreyle orta hızda karıştırın. 40 ° C'ye kadar balon soğutun. Bitmiş agar Clouding yol açabilir burada yüksek sıcaklıklarda devam eden olarak yeterince soğumasını emin olun.Bununla birlikte, daha düşük sıcaklıklar agar zamanından önce sertleşmesini neden olabilir.
    1. (İsteğe bağlı), soğutma sürecini hızlandırmak bir heyecan plaka üzerinde yerleştirmeden önce 40 ° C su banyosunda 15 dakika içinde balon yerleştirin.
  5. Agar ortamı sıcaklığı 40 ° C'ye ulaştığında çözelti, karıştırılmaya devam ederken, 200 ul 1 M CaCl2, 5 mg / ml, kolesterol çözeltisi 200 ul, 200 ul 1 M MgSO 4 ve 5 ml 1 M KPO 4 tampon eklemek 1 mM CaCl2, 5 ug / ml kolesterol, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4 son konsantrasyonlara.
    1. NGT-3D ömrü deneyi için (İsteğe bağlı) 120 uM, 12 bir son konsantrasyona kadar, 150 mM FudR 80 ul ekle.
  6. doğrudan balona adım 2.4 bakteri kültürü seyreltilmiş 10 ml 6 ml ekleyin.
    1. , NGT-3D için (İsteğe bağlı) adım 3.6 önce agar medya 6 ml çıkarın ve ayrı sıcak tutmak. Bu ortam için kullanılacak bakterilerden arındırılmışÜst tabaka.
  7. Steril prosedürler kullanılarak, steril bir kültür odasına ortamı dağıtmak. Emin odasının kapağı sıkıca kapatır emin olun.
    1. (İsteğe bağlı), agar üst yüzeyinde şekillendirme bakteri kolonileri önlemek 3.7 tamamen sertleşir adımdan medyada önce üst aşama 3.6.1 bakteri serbest ağar medya bir katman yapmak için. Bu NGT-3D üstündeki bir bakteri serbest bölge oluşturur.
    2. NGT-3D, bir bakteri ağar katman yapmak ve dikkatle ince bir bakteri yapmak için yarı sertleştirilmiş 3D medya üstünde bakteri özgür medya 200 ul dağıtmak için 8 ml şeffaf plastik test tüpleri içine 6,5 ml medya dökmek üstünde ücretsiz tabaka.
    3. NGB-3D, 25 cm 2 şeffaf plastik hücre kültürü şişe içine medya 65 ml dökün. Bu miktar 25 cm 2 hücre kültürü şişe gövdesini doldurmalıdır.
  8. Bakteri kolonileri büyümesine imkan vermek üzere bir hafta süreyle dikey oda sıcaklığında odaları boşen az 1 mm çapında önemli bir boyuta.
    1. NGT-3D ömrü deneyi için (İsteğe bağlı), alüminyum folyo ile kapak odaları FUDR ışık bozulmasını önlemek için.

NGT-3D (Bağıl Brood Boyut Testi) üzerine Solucan Nüfus 4. Tedbir Spor

  1. almak ve bir bakteri ücretsiz NGM plaka transfer platin tel kullanarak bir L4 sahne solucanı almak. Solucan serbestçe bünyesine bağlı bakteri kaldırmak için bir kaç dakika dolaşmak için izin verin.
  2. adımı 4.1 tekrarlayın ve solucan bakterilerden arınmış olduğundan emin olun. Genellikle, 4.1 iki tekrarlar yeterlidir.
  3. Dikkatlice bir platin tel çekme ile 3D medya yüzeyine temiz solucan yerleştirin. Solucan sonunda 3D agar matrisi içine agar girmelidir.
  4. Kapak gevşek bazı hava tüpüne almak için izin ancak agar medya kurumasını önleyen kapatın.
  5. 20 ° C'de 96 saat süreyle inkübe edilir.
  6. 4 gün sonra, sıkıca kapaklarını kapatın ve koyun88 ° C su banyosu içine NGT-3D kültür odası agar eritmek için. Isı solucanlar öldürür ama vücutları sağlam kalır.
    Not: NGT-3D 8 ml tüpler kullanılarak, 20-30 dakika kuluçka genellikle yeterlidir.
  7. Cam bir pipet kullanılarak, 9 cm plastik petri kabı üzerine erimiş ortamı aktarın. solucanlar genellikle onlara sopa gibi plastik pipetler, tavsiye edilmez.
  8. Bir iletim stereo diseksiyon mikroskobu kullanılarak, L3, L4 solucanlar, ve yetişkin aşamaları sayısını. F1 ve F2 nesil burada karışabilir olarak, L2 sahne ve genç solucanlar saymayın. Böylece, bu testte göreceli kuluçka boyutu tahlil yerine toplam kuluçka büyüklüğü testtir.

5. Görüntü ve Kayıt Worm Davranışı NGB-3D

  1. platin tel kullanarak bir L4 sahne solucanı almak almak ve bir bakteri ücretsiz NGM plaka transfer ve serbest bir kaç dakika hareket sağlayan yüzeye yapışmış herhangi bakterileri yok.
  2. Adımı yineleyin 5.1 wo emin olmak içinrm bakterilerden arınmış.
  3. Dikkatlice bir platin tel çekme ile şişenin boyun yakın NGB-3D agar yüzeyinin merkezi üzerine temiz solucan yerleştirin. Solucan sonunda 3D agar matrisi içine agar girmelidir.
  4. Agar medya kurumasını önlerken kapak gevşek, bazı hava tüpüne almak için izin kapatın.
  5. Görüntü veya iletim stereo mikroskop altında solucan kaydedin. solucan 3D matris boyunca hareket ederken odağı ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NGT-3D inşaat agar (Şekil 1A) boyunca aralıklı küçük bakteri kolonileri ile bir agar dolu test tüpünde sonuçlanan basit ve kolay bir protokoldür. Solucanlar serbestçe bakteri kolonileri bulma ve tüketen, ağar matriks boyunca taşıyabilirsiniz. C. elegans çoğaltmak ve NGT-3D normal büyüyebilir olmadığını teyit etmek, biz doğurganlık ve standart 2D NGM plakalar ile 3D larva gelişimi karşılaştırıldı. Göreceli yavru boyutu deneyde, yetişkin C. bakteri koloni...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klasik nematod büyüme ortamı plakaları kullanılarak C. elegans laboratuvar ekimi sağlamıştır C. elegans araştırma önemli keşiflerinden yüzlerce önemliydi. Burada, daha doğru kendi doğal üç boyutlu habitatları yansıtan bir ortamda C. elegans yetiştirmek için yeni yöntemler sunuyoruz. Diğer yöntemler 3D 13 C. elegans gözlemlemek için kullanılmışsa da, bu katı 3 boyutlu matris solucanlar ekimi sağlayan ilk protokoldür. Burada gösterilen iki yöntem, NGT-3D ve NGB-3D, bilim adam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ile desteklenmiştir Yeni Araştırmacı Grant [2014R1A1A1005553] Liberal Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) 'dan; ve Yonsei Üniversitesi Gelecek Lider Mücadelesi Grant [2015-22-0133] Liberal için

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LB et suyu, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
Sodyum klorürDAEJUNG7548-440058.44 MW
Agar, GranülDifco214530
PeptonBacto211677
Kalsiyum klorür, dihidratBio BasicCD00502*H2O; 147.02 MW
Kolesterol BioBasicCD0122386.67 MW
Etil alkolB& JRP090-1%99,99; 46,07 MW
Magnezyum sülfat, susuzBio BasicMN1988120,37 MW
Potasyum fosfat, monobazik, susuzBio BasicPB0445136,09 MW
2'-Deoksi-5-florouridinTokyo Kimya EndüstrisiD2235246,19 MW
Potasyum fosfat, dibazik, susuzBio BasicPB0447174,18 MW
Çok Amaçlı Test TüpleriStockwell ScientificST.85708 ml
Test Tüpü KapaklarıStockwell ScientificST.8575
Hücre Kültürü ŞişesiSPL Lifescience7012525 cm2
Research Stereo MikroskopNikonSMZ18
Yüksek Çözünürlüklü Renkli Kamera KafasıNikonDS-Fi2
PC Tabanlı Kontrol ÜnitesiNikonDS-U3
NIS-Elements Temel Araştırma, Mikroskop Görüntüleme YazılımıNikonMQS32000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056(2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484(2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C elegans K lt r3 Boyutlu Nematod B y mesiNGT 3D Y ntemiNGB 3D Y ntemiNematod B y me T pNematod B y me i esiSteril Kolesterol zeltisiSeri Dil syon ProtokolBakteriyel Koloni B y mesiRelatif Bat n Boyutu

İlgili makaleler