Yöntem makalesi

Mürin Tam kat Cilt Nakli

20.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55105

⸱

2 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sidney-Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Liver and Transplantation Surgery, Chang-Gung Transplantation Institute, Chang-Gung Memorial Hospital, Chang-Gung University College of Medicine, 3Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mürin tam kalınlıkta deri transplantasyonu alloimmun ortamda reddini incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. > C57BL / 6 tam kalınlıkta deri nakli - Burada bir BALB / c performans katılan her adımda bir öğretici sağlar.

Özet

Mürin tam kalınlıkta deri transplantasyonu alloimmun tepki ve greft reddini incelemek için iyi kurulmuş bir in vivo modeldir. insanlara sınırlı uygulanmasına rağmen, farelerde deri transplantasyon yaygın Nakil için kullanılmıştır. Prosedür öğrenmek ve kolay uygulanabilir olması ve hassas mikrocerrahi teknikler de kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Ayrıca, bu modelde graft reddi çok tekrarlanabilir immünolojik reaksiyon meydana gelir ve kolayca doğrudan kontrol ve elle muayene ile izlenir. Buna ek olarak, donör uyumlu veya üçüncü taraf deri grefti ile ikincil deri nakli alternatif ve donör spesifik tolerans değerlendirmek için basit bir yöntem olarak daha karmaşık nakli modellerinde yapılabilir. komplikasyonlar düşük ve işlem sonrası anestezi doz aşımı ya da solunum sıkıntısı ile sınırlı genel olarak. Greft yetmezliği, diğer taraftan, gr yetersiz hazırlık sonucu sık görülürgreft yatakta kıç, yanlış konumlandırma, ya da bandaj uygunsuz yerleştirme. Bu yazıda, farelerde tam kalınlıkta deri transplantasyonu için bir protokol mevcut ve başarılı bir işlem için gerekli olan önemli adımları açıklar.

Giriş

Organ nakli son dönem organ yetmezliği olan hastalarda tercih edilen tedavi olup, sonuçlar cerrahi işlemler ve immünsüpresyondaki gelişmeler ile son derece düzeldi. Ancak, uzun süreli immünsüpresyon önemli yan etkileri ile ilişkilidir ve hoşgörüyü teşvik yeni stratejilerin geliştirilmesi, modern nakli araştırmanın amacı kalır.

Çeşitli hayvan modelleri allograft reddinin mekanizmaları incelemek ve immünosupresyon aşı reddinin engellenmesi için ve uzun vadeli dayanıklılık 1-3 teşvik etmek için yaklaşımlar test etmek için, transplantasyon temel araştırma için geliştirilmiştir. Fare modelleri nedeniyle tanı ve tedavi antikorlar ve iyi tanımlanmış kendilenmiş ve transgenik suşlar seçkin ve geniş müsaitlik durumuna immünolojik araştırmaların temelini haline gelmiştir. Cilt nakli özel mikrocerrahi beceri gerektiren ve can değil basit bir işlemdirKolayca postoperatif izlenecektir. Birlikte ele alındığında, fare deri nakli greft reddi 4,5 sırasında antijen sunumu, hücre kaçakçılığı ve doku yıkımı da dahil olmak üzere immün yanıt katılan birçok açıdan incelemek için olağanüstü bir araç olmuştur.

Burada, fare modeli kullanılarak tam kalınlıkta deri transplantasyonu için adım-adım prosedürü göstermek ve biz nakledilen deri başarılı bütünleşme için gerekli önemli adımlar açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemler Bakım ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca yapılmıştır ve Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (JHUACUC) tarafından onaylanmıştır. Belirli uygulama usulleri ACUC protokolleri MO13M292 ve MO13M370 altında yapıldı.

1. Donör Cilt Hasat

  1. (- Fare konisi ile 2% 1 bakım,% 4 indüksiyon buharlaştırıcı) izofluran ile donör fare anestezisi. anestezi derinliği izlemek için ayak tutam çekilme refleksi kullanın.
  2. Bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak, hayvanın arka tıraş ve (örneğin, Betadine)% 10 povidon iyot ile dezenfekte edin.
  3. areolar bağ dokusu düzeyinde künt diseksiyon ile steril makas, eldiven ve aseptik teknik, boyun kalça hasat donör arka cilt, kullanma.
  4. hasat sonrası servikal dislokasyon ile hayvan Euthanizederi grefti.
  5. Mikroskop altında, ince tenotomi makas kullanarak geri deriden bağ dokusu, yağ dokusu ve panniculus carnosus ayırın. panniculus carnosus cilt seğirmesi hareketleri sorumlu ince, şeffaf bir kastır.
  6. Steril aletler tekniği kullanarak, 15 mm x 15 mm greft yatağına 10 mm x 10 mm geri deriden 15 mm x 15 mm greft kesip.
  7. Buz üzerinde bir petri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile ıslatılmış etme yöntemleriyle ilgili greft saklayın.
    Not: 8-10 greft, bir verici bir fare elde edilebilir.

2. Alıcı Cilt Nakli

  1. (- Fare konisi ile 2% 1 bakım,% 4 indüksiyon buharlaştırıcı) izofluran ile alıcı fare anestezisi. anestezi derinliği izlemek için ayak tutam çekilme refleksi kullanın.
  2. Ameliyat sonrası ağrı tedavisi için Buprenorfin 0.02 mg / kg BW yönetme.
  3. Hayvanın arka tarafı Tıraş nerede greft will takılı olması ve% 10 povidon iyot ile dezenfekte edin.
  4. makas kullanarak, derinin x 15 mm kare 15-mm 10 mm x 10 mm'lik kesti. kusur boyutu greft daha (% 10) biraz daha büyük olması gerekir. kadar yüzeysel mümkün olduğunca kesin. panniculus carnosus ve damarları korumak için özen gösterin. panniculus carnosus onun hareketlilik ve buna yüzeysel koşmak kan damarları tarafından altta yatan fasya ayırt olabilir.
  5. kenarları boyunca kıvrımlar kaçınarak, greft yatakta greft yerleştirin.
  6. Köşelerde ve her kenarın ortasında 8 sütür yerleştirin. Her sütür için, çevredeki alıcı deri altına yatak greft panniculus carnosus yoluyla daha sonra greft içinden iğne geçmesi ve.
  7. anestezi maskesi çıkarın ve hayvan yapışkan bandaj uygulamadan önce anestezi kısmen kurtarmak edelim.
  8. greft üzerine katlanmış gazlı bez ile bir yapışkan bandaj alıcı fare sarın. kesme, iki bandaj birleştirerek bandaj yapmakyapışkan birinin parçası ve birlikte iki emici pedler yerleştirerek.
  9. bandaj toraks gezi kısıtlayan ve nefes olmadığından emin olmak için kurtarma sırasında yakından fare izleyin. solunum sayısı azalır ya da hayvan sığ gasp ya da nefes başlarsa bandajı çıkarın.

3. Ameliyat Sonrası Bakım

  1. Enfeksiyon profilaksisi için ameliyattan sonra enrofloxacin 5 mg / kg yönetmek.
  2. tamamen anestezi kurtarır kadar mikrodalga ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafes içinde nakledilen fare yerleştirin.
  3. konut tesisine iade postoperatif önce 1 saat için fare gözlemleyin.
  4. Yedi gün ameliyat sonrası Adım 2.1 gibi fare uyutmak. bandaj ventral tarafta boyunca sadece keserek bandaj çıkarın.
  5. Gözlemlemek ve kabuklanma, kasılma veya sertlik belirtileri ertesi gün greft palpe. Varsa, greft uygun vasculariza elde olmayabiliryon ve teknik bir arıza düşünülmelidir.
  6. ret belirtileri günlük izleyin. greft dokusunun ≥90% nekrotik hale geldiğinde reddedilen greft düşünün.
  7. reddedilen hayvanları euthanize ve analiz için onları hasat.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Alıcı fare üzerindeki bandajın yerleştirme işleminin önemli bir adımdır. Deri grefti omuz, kalça, omurga ve (Şekil 1) arasında, alıcı gövde üzerinde konumlandırılmış. Bandaj katlanmış gazlı bez ve iki plastik yapışkanlı bandaj kombinasyonu ile yapılır. Alıcı fare bandajın ortasına gazlı bez üzerinde aşağı greft ile yerleştirilir. iki kavisli mikro forseps kullanılarak, bandajın alt ucu, ilk çekilir ve daha sonra bir bandaj üst karın fare üzerinde sarılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tavşan ve farelerde daha sonra insan çalışmalarında ilk ve Medawar tarafından piyasaya sunulmasından bu yana, deri transplantasyonu allojenik bağışıklık tepkilerinin 6,7 çalışmaları için paha biçilmez bir model olmuştur. Bu yazıda, üst ve alt sırt derisi kullanılarak büyük ölçekli, non-vaskülarize, tam kalınlıkta deri nakli bir model sunuyoruz. Kuyruk deri veya Nakledilecek doku kaynağı olarak fare kulak derisi kullanılarak da dahil olmak üzere çeşitli alternatif yöntemler, 8,9 bugüne kadar rapor e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibe R01AI077610 tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Düz mikro forsepsSigmaF4017
Kavisli mikro forsepsAesculapBD333R
Kavisli Stevens tenotomi makasıAesculapBC905R
Mayo diseksiyon makasıSigmaS3146
Mikro iğne tutucuAesculapBM563R
Steril gazlı bezCovidien
6-0 Naylon sütürMWI31849
Plastik Şerit Bandı &# 45; Johnson & Yardım: JohnsonEczaneden temin edilen
10 cm Petri kabıFisherbrandFB0875712
PBSKalite Biyolojik119069131
BuprenorfinDEA Numarası gerekli; Hastane eczanesi
EnrofloxacinBayer Health Care186599'den
441218 alındı

Kaynaklar

  1. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
  2. Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
  3. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
  4. Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
  5. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
  6. Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
  7. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
  8. Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. , (2008).
  9. Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724(2014).
  10. Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
  11. Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
  12. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).
  13. Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
  14. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
  15. Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
  16. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
  17. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Greft ReddiMurin ModelAlloimm n Yan tDon rle Uyumlu Greftlernc ah s GreftleriMetabolik Terapimm ns presyon ProtokolGreft Sa kal mBandaj Yerle imi

İlgili makaleler