Yöntem makalesi

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

DOI:

10.3791/55108

⸱

21 Ekim 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskemik inme trombüsü veya kan akımı beyin bölümlerine tıkayan embolinin kaynaklanan bir karmaşık beyin hasarı var. Bu oksijen ve enerji yetmezliği ve nöronal ölüm nedenleri glikoz yoksunluğu için yol açar. İskemik inme hakaret sonra astrocytes reaktif olmak ve bu geliştikçe yaralanma sitenin etrafına çoğalırlar. Bu senaryoda, astrocytes iskemi için maruz beyin bölgesi için belirli katkısını çalışma zordur. Bu nedenle, bu makalede birincil astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı oksijen glikoz yetmezliği (OGD) adı verilen bir iskemi gibi ortamının bir vitro modeli altında çalışmaya bir metodoloji tanıtılmaktadır. Astrocytes 1-4 gün izole-eski yenidoğan fareler ve non-spesifik astrositik hücre sayısı değerlendirildi astrocyte seçici marker gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) ve nükleer boyama kullanarak. Onlar maruz kalan oksijen yüzdesi yanı sıra astrocytes OGD koşuluna tabi olan dönem özelleştirilebilir. Hücre içinde vitrofarklı grupları iskemik benzeri durumda süresince ayırdetmek bilim adamları bu esneklik sağlar. Bu makalede astrocyte reaktivite, Hipertrofik morfoloji ve Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) kullanarak ayirt tarafından ölçülen yaygın neden zaman dilimleri OGD, anlatılmaktadır. Hızla çoğalmak, yanı sıra astrocytes enerji ve oksidatif stres geçmesi ve çözünür faktörler cep orta serbest bırakarak OGD için yanıt. Bu orta toplanan ve moleküller hücre hücre etkileşimi olmadan birincil nöronal kültürde astrocytes tarafından yayımlanan etkilerini çözümlemek için kullanılır. Özet olarak, bu birincil hücre kültür model verimli bir şekilde yaralanması üzerine izole astrocytes rolünü anlamak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontur "bir akut nörolojik disfonksiyon vasküler kökenli ani veya hızlı geliştirme belirti ve bulguları, karşılık gelen beyin Fokal alanlarda katılımı ile"1,2olarak tanımlanır. Kontur iki tür vardır: Hemorajik ve iskemik. Vasküler disfonksiyon ya beyin kanaması veya posterior bir arter rüptürü ile zayıflaması tarafından eşlik arteriyovenöz bir arıza neden olduğu bu, çoğu durumda, ölüme götürecek hemorajik inme3 olarak adlandırılır. Bir trombüsü veya bir pıhtısı kan akışını engelleyen, oksijen ve glikoz bir beyin bölgesine geçici bir yoksunluk neden iskemik inme4denir. Hücrelerin etkilenen bölge veya iskemik çekirdek liderlerine homeostatik ve metabolik dengesizlik, enerjik disfonksiyon, nöronal ölüm ve inflamasyon5yaşam boyu Engelli hastalar6tetikleyebilir, etrafında beslemek için hata oluştu.

İskemik inme hücrelerin bu tepki ve uygulamak etkileri farklı zaman noktalarda çeşitli türleri içeren multifaktöriyel bir yaralanma olduğunu. Çok etkileşimleri tek tek hücreler davranışını çalışmaya zor bir ortam oluşturun. Yani, bir belirli hücre türü'nün altında karmaşık bir ortam katkısını nasıl çalışıyoruz? Bir kabul edilen vitro modeli iskemi hücrelere oksijen ve glikoz yoksunluk (OGD), açığa belirli bir süre için bir normoxic ortamına hücreleri restorasyon tarafından takip oluşur. Bu sistem tarafından kan reperfüzyon takip bir iskemik inme taklit eder. Bu yöntemde, hücre ve dokulara oksijen kullanarak özel bir hipoksik odası, tasfiye bir ortamda glikoz-Ücretsiz medya maruz kalır. OGD kuluçka süresi birkaç dakika 24'e kadar s hipotezini test edilecek istiyor bağlı olarak değişebilir. Çalışmalar bu OGD kez bağlı olarak göstermiştir ve normoxic çevre, inme (Yani, akut veya Subkronik) belirli fenotipleri elde edilebilir. Normoxic koşulları, posterior restorasyon ile OGD için maruz birincil izole astrocytes kontur tüp bebek7taklit etmek için iyi çalışılmış bir hücresel model var. OGD izole hücreler bir inme benzeri ortamı altında bağımsız moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak mümkündür.

Astrocyte Biyoloji ile ilgili bilgilerimizi arttıkça, onlar sinapslarda Bakımı ve sinirsel tamir, geliştirme ve plastisite8sürdürülmesi için çok önemli olduğunu belirgin olmuştur. Normal şartlarda astrocytes yayın ve sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve gliotransmitters metabolik denge ve homeostasis sinapslarda5,9içinde tutmak, yanıtlar. İskemik inme gibi akut neuroinflammation içinde bu hücreler reaktif olmak, uzun vadeli overexpression, gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP'nin) gösterebilir ve onların morfolojisi5,10', hipertrofisi göster 11 , 12. iskemik enfarktüsü geliştikçe, astrocytes tarafından sağlanan homeostazı etkilenen olur, normal Glutamat alımı, enerji metabolizması, etkin moleküller ve antioksidan aktivite13değişimi ile ilgili.

Doğru lesioned alan14lökosit göç ederken yeniden etkinleştirilen astrocytes etrafında enfarktüsü doku çoğalırlar. Astrositik yayılması Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA), Ki67 ve bromodeoxyuridine (BrdU)15gibi işaretçileri kullanarak ölçülebilir. Bu proliferatif yanıt Saat-bağımlı bir şekilde oluşturulur ve gliyal yara, bir yaralanma9sonra bozuk sitesini parankimi boyunca geri dönüşümsüz reaktif astrocytes dizisi oluşturan yardımcı olur. Bu yara izi ilk işlevleri bu bölgeden bağışıklık hücre ekstravazasyonu kısıtlamaktır. Ancak, çalışmalar yara izi genişletmek, aksonlar büyüme inhibe moleküller serbest olarak ve yaralı alan16uzanan aksonlar engelleyen fiziksel bir bariyer oluşturmak aksonlar için fiziksel bir engeli olur göstermiştir. Yine de, bir omurilik yaralanması sonra tamamen gliyal yara oluşumu engelleyen aksonlar17rejenerasyon zarar olabilir olduğunu gösteren bilimsel kanıt. Böylece, belirli astrositik tepki ölçülür, okudu yaralanma framework düşünülmelidir bağlamında.

Sunulan metodoloji astrocytes bireyselleştirilmiş fonksiyonu oksijen glikoz yoksunluğu sonra eğitim için uygulanabilir ve araştırmacı cevap istiyor soruları bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, morfolojik değişiklik ve farklı OGD zamanlarda ifade işaretleri yanı sıra, OGD için maruz astrocytes üzerinden supernatants daha fazla çözünür faktörler veya bu hücreler tarafından serbest şartına bir medya olarak değerlendirmek için kullanılan belirlemek için analiz edilebilir, diğer beyin hücreleri yürürlükte. Bu yaklaşım yöneten ve onların yanıt bir iskemik inme senaryo olarak modüle faktörler aydınlatma yol açabilecek astrocyte reaktivite çalışmaları sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

doğum sonrası fareler (Sprague Dawley) 1-4 gün eski cortices izole etmek için kullanılır. Ötenazi işten çıkarma, NIH kurallar tarafından onaylanmış yöntemidir.

1. cerrahi için malzeme ve aletler hazırlık

  1. bir otoklav içinde Sterilize cihazları (sıcaklık: 121 ºC, basınç: 15 psi, Saat: 30 dakika) metal bir kutu ya da bir anlık sterilizasyon çanta mühürleme kullanarak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

2. DMEM hazırlık tamamlamak

  1. Dulbecco autoclaved 700 mL su içeren bir 1 litre kabı içinde eklemek ' s modifiye kartal ' s orta toz oda sıcaklığında.
  2. Çözüm bir manyetik karıştırıcı ile karıştırılır 3.7 g/L sodyum bikarbonat, eklemek.
  3. Ayar pH 7.4, autoclaved su ile Cilt 1 L getirin, sonra filtre. İstediğiniz birimin FBS ve % 1 ile medya kültür amaçlı ek penisilin/streptomisin ve 37 ˚C, sıcak. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.
    Not: PH pH metre elektrot medya içine ekleme üzerinden 7,4 için ayarlandı. Medya gerekir karıştırma, sonra yavaş yavaş ekleyin bir damlalık kullanarak 1 M NaOH.

3. Birincil Astrocyte kültür

Not: tohum sonra hücre medya üç günde değiştirilmelidir ve hücreleri confluency (11-13 gün) en fazla yetiştirilen olabilir. Üçüncü gün, birkaç kez için Asansör mikroglial hücreleri ve oligodendrocyte progenitör hücre kültürü kapalı şişe dokunun, Tümünü Kaldır ' eski ' medya, iki kez 10 mL PBS kullanarak yıkayın, PBS Aspire edin, sonra taze yeni medya nesnesi. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

  1. Yeni doğan sıçan beyin diseksiyon
    1. gerçekleştir diseksiyon bir doku kültürü Hood. 1-4 gün (2 sıçan beyin 75 cm 2 şişe kullanılır) eski yeni doğmuş fare pups edinin.
    2. Üç 60 mm petri yemekler hazırlamak ve 5 mL her tam DMEM de pipet.
      Not: Aşağıdaki gibi ayrılabilir: #1 her fare için beyin, beyin tüm cortices ve #3 (olmadan meninkslerde) soyulmuş cortices için için #2.
    3. Yavru ve sprey % 70 etanol ile kavramak. O başını kesmek ve vücuttaki küçük biohazard atık konteyner atın.
    4. Mikro-anatomi cımbız kullanarak, kafa tutun ve cilt kafatasını ortaya çıkarmak için baş üstüne kesmek.
    5. İle başka bir çifti makas yapmak bir " T " kesi burun doğru kafatasının arkasından başlayarak. Forseps çifti kafatası yavaşça kaldırmak için kullanın.
    6. Maruz kalan beyin cımbız bir çift ile kaldırın ve beyin bir petri yemekleri daha önce orta ile dolu yerleştirin.
    7. Steril aletlerin başka bir set için sonraki adımları kullanın.
    8. Mikro-anatomi forseps 60 mm petri kabına ters kapağını yavaşça bir beyin eklemenizi sağlar. Petri kabına steril gazlı bez yerleştirildiğinde, beyin açıkça görüntülemek mümkündür ve incelemek daha kolaydır.
    9. Beyin mikro-anatomi Forseps ile sakin ve yavaşça orta çizgi çatlak keskin sonuna mikro-anatomi Forseps ile alay tarafından serebral hemisfer ayrı.
    10. Deflect ve beyaz madde bırakarak cortices kabuğu ve daha önce #2 etiketli bir petri kabına için aktarabilirsiniz. #2 etiketli petri kabına bütün disseke cortices birleştirerek tüm beyin için yordamı yineleyin.
    11. Hipokampus her korteks altında çıkar ve bunu atma
    12. Mikro-anatomi cımbız ve 60 mm petri hafifçe kabuğu zarları bireysel kortikal loblar üzerinden kullanmak ve #3 etiketli petri kabına koyun.
  2. Doku ayrılma: homogenizer blender yöntemi
    1. doku/orta süspansiyon (soyulmuş cortices beyin) steril blender torba içine dökün ve Toplam hacim çantada 5 mL getirmek için yeterli orta ekleyin.
    2. Çanta çanta yaklaşık 2 cm yukarıda kapalı kapı görünür bırakarak homogenizer blender içine koyun. Hücre ayrışma sırasında yüksek hızda 2.5 min yapılır.
      Not: Alternatif olarak, bu çantayı kapatma ve yavaşça başlıklı bir ölçek ile vurma tarafından yapılabilir. Bir bez çanta ve kabı arasında sürtünme önlemek için kullandığınızdan emin olun.
    3. Hücre süspansiyon bir sayı 60 mesh elek dökün ve yerçekimi tarafından filtre uygulamak izin 100 numaralı elek üzerine aracılığıyla akış filtre uygulanmış dökün.
    4. Kullanarak 15 mL tüpler, santrifüj kapasitesi 200 x g 5 dakika süreyle klinik santrifüj (tercihen salıncak kova rotor) içinde de hücre süspansiyon
    5. Kapalı bir ölçek süpernatant dökün, sonra serolojik pipet kullanarak yeniden askıya alma ve en fazla 5 mL medya de hücrelerde Pelet ayırmak.
  3. Hücre sayımı
    1. bir micropipette ile hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 100 µL toplayabilir ve trypan mavi 100 µL ekleyebilir.
    2. Hemasitometre içinde toplanan süspansiyon 10 µL takın ve meydanın dört köşesine uygun tüm hücreleri saymak.
    3. Şişeler hazırlamadan önce hücreleri yoğunluğunu hesaplamak için formüller şunlardır:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. 25 cm 2 şişe başına en az 500.000 hücreleri ekleyin. DMEM 5 mL her şişeyi içine kadar pipet. Karışım şişeye boyun ulaşmak gerekir. 3 gün boyunca %5 CO 2, 37 ° C kuluçka koyup, sonra medya değiştirin.
  4. Astrocyte arıtma teknikleri: medya değiştirmek, mekanik ve kimyasal stratejileri
    Not: diğer hücre türlerine göre astrocytes metabolizma hızı yüksektir, bu nedenle, beslenme koşullar, bu hücreler bir kaç gün sonra düşük sağkalım oranları göstermek yoksun. Astrocytes, aksine microglia tarafından besin yoksunluğu etkilenmez ve bu tür ortamlar 18 ' çoğalırlar. Mikroglial sayısı azaltılmış korumak için yazarlar her 3 günde astroglial hücre kültür ortamı değiştirin. Bu sürekli bir değişim hücre medyada da astrositik hücre monolayer şişesi 19 üstüne büyüyebilir mikroglial nüfus azalır.
    1. Kullanımı bir Pasteur pipet medya yapışık olmayan mikroglial hücrelerden her biri şişeler ile Aspire edin. Herhangi bir enkaz yaptı dropwise bir şekilde (5 mL/şişesi) steril filtre PBS her şişeler kullanarak arkasında yıkama.
    2. Steril filtre DMEM (ile sığır serum antibiyotik ve fetal) dropwise her şişeyi (5 mL/şişesi) ekleyin. Tüm yüzey kapsayacak şekilde dairesel hareketlerle hafifçe kışkırtmak.
    3. Bir 37 hücrelerde yer ve#176; 8-10 şişe confluency ulaşana kadar gün için % 5 CO 2 C İnkübatör (> % 95 plaka kapsama).
      Not: Birkaç protokol astrocytes confluency ulaştığınızda, 2 kültür 24 h, sallayarak gibi mekanik yöntemleri, yol üstünde tepe-in bu astrocytes, esas olarak microglia ve öncü hücreleri yalan hücreleri dekolmanı göstermiştir 19 , 20.
    4. Sigara astrositik hücre kültüründe 30 dk için 180 RPM yörünge sallayarak gerçekleştirerek azaltılır. Hücrelerin içinde süpernatant kaldırdıktan sonra taze medya şişeye (~ 15 mL) pipetted.
      5. Oligodendrocyte progenitör hücrelerin ortadan kaldırmak için
    5. 6 h 21 , 22 , 23, aspiratı süpernatant ve damlalıklı taze medya için 200 d/d sallama hızını artırın.
      Not: Microglia kültürlerde varlığı azaltmak için iki kimyasal yöntem ardışık olarak kullanılabilir (aynı anda) birincil hücre kültür yöntembilim: arabinoz sitozin (Ara-C) ve L-lösin metil ester (LME) 24.
    6. Hücre confluency (% 100) ulaştığınız zaman hemen 3-4 gün microglia, mekanik çıkarıldıktan sonra bu hücreler antimitotic bileşik arabinoz sitozin (Ara-C) 8 µM ile DMEM içinde 5 gün (değişikliği DMEM taze Ara-C günlük) tedavi edilebilir.
      Not: Bu bileşik hızla bölen hücreleri microglia 19 , 25 ve fibroblastlar gibi sayısını azaltır antimitotic bir ilaç, Ara-C eklemek için zaman noktası kritik olduğu için 26 . Microglia aksine, konfluent ne zaman, astrocytes durmak via temas inhibisyonu 27 Proliferasyona.
    7. Ara-C tedaviden kurtarmak hücreler için 2 gün izin.
    8. Confluency, hücre ulaştıktan sonra daha da mikroglial kirliliği azaltmak için pH 7.4, 37 ˚C 1 h için sabit DMEM L-lösin metil ester (LME) 50 mM kullanın.
      Not: LME hücre ve organelleri membran aşar ve hidrolize sonra üretilen L lösin bu hücrelerde organellerin içinde birikir. Bu amino asit birikimi bir ozmotik şişlik ve rüptür organellerin 28 , 29 yol açar. LME diğer hücreleri 20 , 30 ' a göre microglia, ortadan kaldırarak son derece etkili.

4. Astrocytes 6-şey tabak içinde yetiştirilmesi

  1. kaplama coverslips Poli-D-lisin ile
    1. sonra her 35 mm petri kabına seyreltilmiş Poly-D-lizin çözüm her coverslip için 100 µL ekleyin ve 1 h. bekleyin yerine bir coverslip
    2. Poli-D-lizin kaldırmak ve iki kez 2 mL steril su ile yıka.
    3. Su kaldırmak ve coverslips kapağın içinde kurumasını bekleyin. Coverslips-20 ° c ilâ iki hafta için mağaza.
      Not: Don seyreltilmiş Poly-D-lizin eriyik; iki haftaya kadar saklanabilir.
  2. Trypsinization
    1. bir Pasteur pipet kullanarak şişeler ortamından Aspire edin. 5 mL/şişesi yavaşça hücreleri durulama için PBS steril süzülmüş ekleyin.
    2. Aspiratı PBS kapalı ve 5 mL/şişesi % 0.25 tripsin ve 0,5 mM EDTA çözüm steril süzülmüş ekleyin. 37 ˚C, % 5 CO 2 kuluçka 10 dakika süreyle şişeye koyun
      Not: Hücreleri kuluçka iken, 5 mL/şişesi taze tam DMEM 37, sıcak ° C.
    3. Sonra 10 dk, kuluçka, tahrik tüm hücreleri şişesi kaldırdı emin olmak için. 5 mL sıcak tam DMEM de her şişeyi tripsin etkisiz hale getirmek için hızlı bir şekilde eklemek.
    4. Yavaşça yukarı ve aşağı herhangi kadar kırmak için birkaç kez hücreleri pipette " kümeleri ". Askıya alınan hücreleri iki şişe 15 mL konik santrifüj tüpü transfer.
      5. Hücre Pelet toplamak için
    5. santrifüj 200 x 5 min için g. Pelet orta 500 µL içinde yeniden askıya alma ve şişeler içinde hücreleri yerleştirmek için devam.
      Not: Hücrelerle yapılacak analizler örnekleri: 1) gen ekspresyonu; analiz etmek için ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) 2) protein ifade değerlendirilemiyor Western blot; 3) Akış Sitometresi Analizi nöral progenitör hücre sayısı ve proteinler ilgi ölçmek için; 4) protein ifade ve yerelleştirme çözümlemek için ayirt.
  3. Tohumlama astrocytes
    1. sonra tripsin ile birincil astrocytes tedavi (4.2 için bakın), hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 100 μL toplamak ve % 0.5 trypan mavi 100 μL ekleyin.
    2. Ekleyin 10 μL trypan toplanan süspansiyon mavi için hemasitometre ve uygun tüm hücreleri saymak.
    3. Formüller adım 3.3 şişeler hazırlamadan önce hücreleri yoğunluğunu hesaplamak için kullanın.
      4. Bir steril ekleyerek
    4. hazırla çok iyi yemekler, Poli-D-lizin coverslip her şey için kaplı. 50.000 hücreleri pipette ve taze orta (yaklaşık 2 mL) ile çok iyi her yemeğin hacmindeki geri kalanını doldurun.
    5. Çok iyi yemekler 37 ˚C kuluçka %5 CO 2 içine koyun ve 5-7 gün sonra astrocytes olabilir büyümek ve coverslips tüm yüzeyine kapak.

5. OGD protokolü için birincil Astrocytes

  1. OGD orta hazırlık
    1. ek Dulbecco ' s modifiye kartal ' s orta-Alerjik glikoz 3.7 g/L sodyum bikarbonat ve % 1 ile penisilin/streptomisin. Tablo 4 malzemelerinde bkz:.
    2. Tasfiye glikoz ücretsiz orta 20 mL % 95'i N 2 / %5 köpüren tarafından CO 2 min bir akışı 15 L / (debimetre ile belirtilir) ortamda gaz sistemi için serolojik pipet ekleyerek, 10 dk için.
      Not: Oksijen orta tasfiye sonra pH 7,4 (adım 2.1 nota bakın) adlı ayarlayın.
    3. Filtre 50 mL tüp filtre sistemi kullanılarak silinen glikoz-Alerjik orta.
      Not: Taze OGD orta köpüren ile % 95'i N 2 / %5 her deneme için yapmak, hücreleri oksijen tasfiye bir ortama maruz kalır emin olmak için kullanmadan önce CO 2.
  2. Deneysel bir işlem
    1. doku kültürü başlık içinde önceden hazırlanmış coverslips (4.3.5 adıma bakın) astrocyte medya kaldırmak ve herhangi bir glikoz hücreleri üzerinde iki kez kaldırmak için hücresel PBS ile yıkama.
    2. 2 mL OGD medya ekleyin Her şey ve çok iyi yemekler ile onların kapakları kapalı hipoksi odası içine yerleştirin
    3. Gaz karışımı giriş Vana bağlanmak ve çıkış vanası açık bırakın. Gaz karışımı % 95'i N 2 / %5 ile odası sifonu CO 2, 15 L/min 5 dakika süreyle
    4. Gaz akışını durdurmak ve ilk çıkış vanası üzerinde kelepçe kapatın, sonra gaz giriş Vana boru üzerinde kelepçe kapatın.
      Not: Sabunlu su ile odası ve mühür kapsayan hiçbir gaz kaçağı olduğundan emin olun. Mühür güvenli ise, hava kabarcığı yok oluşturmalıdır.
    5. Hücre kültür kuluçka 37 ° c 6 h OGD veya 1 h için tüm odası yerleştirin.
    6. Kuluçka süresi bittikten sonra OGD medya Aspire edin ve dikkatli bir şekilde normoxic için de her 4,67 cm 2 tam DMEM 2 mL damlalıklı işlemek 24 h

6. Birincil Astrocyte ayirt hazırlık için protokol

Not: astrocyte saflık değerlendirmek için nöronlar, microglia ve oligodendrocytes tarafından tespit edilebilir gibi farklı beyin hücresi türleri ayirt farklı hücre işaretçileri kullanarak. Nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri, PCNA ve propidium iyodür (PI) birincil astrocytes normoxic koşulları tarafından takip OGD maruz üzerinde kullanılabilir. Malzemeleri Malzemeler tablo içinde görmek.

  1. Ayirt hazırlık
    Not: bu bir genel ayirt protokol, küçük değişiklikler (örneğin, uzun kuluçka dönemleri, en iyi bir sinyal elde etmek için gerçekleştirilen inkübasyon sıcaklığı). Her işareti Tablo 1-ebilmek var olmak kullanılmış üretici göre ' s protokolü.
      Hücre canlılığı, değerlendirmek için
    1. hücreleri ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe PI (tam DMEM içinde 5 mikron) ve yıkama iki kez 2 mL PBS için PI boyama gösteren 5 dk. daha az canlı hücrelerdir.
      Not: Kullanım hücreleri tedavi adım 5.2.6.
      2. PI boyama sonra hücreleri düzeltmek için
    2. ekleyin 2 mL % 4 formalin 4,67 cm 2 başına, 20 dk 4 ˚C az için. PCNA ile etiketli örnekleri için tercih edilen sabitleme metanol için 10 dk 4 ˚C az çözümdür.
      Uyarı: Formalin ve metanol zehirli.
      Not: Her zaman kontrol spesifik antikor her şirket iletişim kurallarından.
    3. Yıkama PBS 2 mL 5 min için hücrelerle ve 3 kez bu işlemi tekrarlayın.
    4. Çözüm engelleme hücreler kuluçkaya (% 0.5 iyonik olmayan yüzey aktif, % 10 PBS FBS) nazik sallayarak ile oda sıcaklığında 30 dk için.
    5. PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıka, yıkama 3 kez tekrarlayın.
    6. % 1'lik bir çözümde birincil antikor (PCNA, GFAP'nin) ile 4 ° C'de, gecede (16 h), kuluçkaya PBS FBS.
    7. Birincil antikor çözümü kaldırmak, PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıkayın ve 3 kez bu işlemi tekrarlayın.
    8. Incubate fluorophore % 1'lik bir çözümde ile Birleşik ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 h için PBS FBS.
    9. PBS 2 mL 5 min için hücrelerle yıka, 3 kez bu işlemi tekrarlayın. 1 µg/mL DAPI ekleyin (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) hücre çekirdeği leke 5 min için.
    10. Yıkama PBS 5 dk 2 mL hücrelerle, iki kez bu işlemi tekrarlayın ve PBS içinde devam.
    11. Coverslips montaj orta kullanma mikroskop Slayt üzerindeki hazırlayın.
  2. Confocal mikroskop
    1. mikroskobu ayarladıktan sonra coverslip yan mikroskop Sahne Alanı'nda yerleştirin.
    2. Yazılım kullanarak bir lazer ışını 543nm için GFAP'nin-Cy3 konjuge antikor adlı seçin.

7. Canlılığı tahlil hücre

  1. Trypsinize ve astrocytes numaralı adımları uygulayarak tarafından 4.3 ve 4.4 ölçmek.
  2. 1 x 10 4 hücreleri/iyi 96-şey tabakaları bana ekleyin ve onları confluency için büyümek.
  3. Adım 5 metodoloji kullanarak, her iki normoxic 1 h OGD kültürlü 96-şey tabak maruz veya 6 h OGD.
  4. Sonra OGD tedavi, normoxic medya 24 h için tüm hücrelere eklenir ve canlılığı MTT reaktif tahlil kullanılarak ölçülür (üretici firma olarak kullanmak ' s yönergeleri gösterir).
  5. Bir 5 mg/mL MTT çözümden her şey için toplam hacminin % 10 ekleyin ve 3 h 37 ˚C ile MTT reaktif için kuluçkaya.
  6. Ortamını çıkarın ve 200 µL Dimetil sülfoksit kullanarak kristalleri resuspend. Spektrofotometre, 570 plaka okuma nm.
    Not: Azalmış bir Absorbans kontrol hücreleri göre daha az canlılığı ile ilişkilendirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil astrositik kültürünün ana kaygıları nöronlar, oligodendrocytes, fibroblastlar ve microglia gibi diğer hücrelere varlığıdır. Şekil 1, izole sıçan cortices hücrelerden medya değişikliklerini her 3 günde ve vardı ya tedavi edilmemiş veya tedavi ile LME 1 h. 24 saat sonra eklendi, hücre immunostained GFAP'nin için vardı ve DAPI ile counterstained. Tedavi edilmezse hücreleri ortalama % 39 sigara-GFAP'nin pozitif hücrelerinin, LME tedavi hücreleri % 8 göst...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı astrocytes sıçan cortices üzerinden yalıtım açıklar. Bu yöntemde, microglia, oligodendrocytes ve fibroblastlar gibi hücresel diğer türleri ile kirlenme azaltmak için önemlidir. Microglia sayısını azaltmak için çeşitli adımlar alınabilir: medya, orbital sallayarak ve kimyasal tedaviler değiştirme. Kültür saflık ayirt seçici hücresel işaretçileri kullanarak veya en önemli hücre kirleticiler için onaylandıktan sonra deneyler yapılabilir. Örneğin, iyonize kalsiyum bağlama adaptör molekül 1 (Iba-1) karşı an...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Paola López Pieraldi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. A.H.M. hibe 8G12MD007600 ve bu yayın desteklenen U54-NS083924 için minnettar olduğunu. NIH-NIMHD-G12-MD007583 hibe tesis destek için teşekkür ediyoruz. D.E.R.A. NIHNIGMS-R25GM110513 tarafından sağlanan burs için minnettardır. Ortak araçları alan kullanım için minnettarız ve Dr Priscila Sanabria optik görüntüleme tesis tarafından RCMI programının kullanımı için yardım vermek G12MD007583. Buna ek olarak, Jose Padilla filme ve görsel iletişim kuralı düzenleme olağanüstü rolü için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cerrahi Aletler - Adım 1
Ameliyat makası 5.5"Roboz ŞirketiRS-6812Farelerin başını kesmek için kullanılan aletler.
Kavisli forseps 7"  Roboz ŞirketiRS-5271Kafatası çıkarılırken farenin derisini tutar.
Mikro diseksiyon makası 4"  Roboz ŞirketiRS-5882Farenin hem derisini hem de kafatasını keser.
Mikro diseksiyon forseps 4 "açılı, ince keskin Roboz ŞirketiRS-5095Kafatası çıkarılırken farenin derisini tutar.
Mikro diseksiyon forseps 4 "hafif kavisli 0.8Roboz CompanyRS-5135Korteksleri ayırmak için kullanılan alet.
Mikro diseksiyon cımbızRoboz CompanyRS-4972Beyin meninkslerini soyar.
Diseksiyon mikroskobuOlympusSZX16Meninksin kortekslerden çıkarılması için önemlidir.
DMEM Hazırlığı - adım 2
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)GibCo. Şirket11995-065Hücrelerin büyümesini destekler.
Hücre kültürü ortamı içinsodyum bikarbonatSigma-Aldrich CompanyS7277
Fetal sığır serumu (FBS)GibCo. Şirket10437-010Hücre kültürü için serum takviyesi.
Penisilin-Streptomisin GibCo. Şirket15140-148Hücre kültüründe bakteri üremesini engeller.
0.22um gözenekli Filtre Sistemi 1LCorning431098
Astrosit kültürü - adım 3
serolojik pipetler 5mLVWR89130-896DMEM'i hücreli kaplara pipetlemek için.
Serolojik pipetler 10mLVWR89130-898DMEM'i hücreli kaplara pipetlemek için.
Serolojik pipetler 25mLVWR89130-900DMEM'i hücreli kaplara pipetlemek için.
Santrifüj konik tüp 15 mLSanta Cruz Biyoteknolojisc-200250
Güvenli kilit tüpü 1.5 mLEppendorf022363204
Bariyer Uçları 200 uLSanta Cruz Biyoteknolojisc-201725
Bariyer Uçları 1 mLSanta Cruz Biyoteknolojisc-201727
Biyolojik Tehlike Turuncu Çanta 14 x 19 "VWR14220-048
60mm petri kaplarıFalcon351007
Steril gazlı bez pedleriHoneywell Safety89133-086
Mide 80 BiomasterSewar Lab Sistemi030010019 beyin dokusunu triture eder.
Mide 80 Blender Steril TorbalarSewar Lab SystemBA6040Mide hücresi homojenizatörü için steril torba.
Beher 400mLPyrex1000
Steril hücre ayrışma eleği, ağ # 60 & nbsp;Sigma-Aldrich CompanyS1020Tek tip bir tek hücreli süspansiyon elde etmek için.
Steril hücre ayrışma eleği, ağ # 100Sigma-Aldrich CompanyS3895Tek tip bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için.
Faz mikroskobunuters çevirin NikonEclypse Ti-SHücreleri kontaminasyon veya anormal hücre büyümesi açısından doğrulayın.
75cm2 steril şişelerFalcon353136
Çok kuyulu plakaFalcon353046
Mikro kapaklı camlar (lameller), 18mm, yuvarlakVWR48380-046
Bright-Line hematitometreSigma-Aldrich CompanyZ359629
Pasteur pipetleriFisher Scientific13-678-20D
Etil alkol Sigma-Aldrich ŞirketiE7023
L-lösin metil ester hidroklorür %98 (LME)Sigma-Aldrich ŞirketiL1002Birincil kortikal astrosit kültüründeki mikroglia hücrelerinin ortadan kaldırılmasını teşvik eder.
Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid (Ara-C)Sigma-Aldrich ŞirketiC1768
Poli-D-Lizin Hidrobromür, mol ağırlık 70.000-150.000Sigma-Aldrich ŞirketiP0899
Tripsin / EDTAGibCo. Şirket15400-054
Tripan MaviSigma-Aldrich ŞirketT8154
Fosfat tampon salin (PBS) tabletleriCalbiochem524650
Steril SuSigma-Aldrich ŞirketW3500
< güçlü> nbsp; OGD Orta Hazırlama - adım 5
Santrifüj konik tüp 50 mLVWR89039-658
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' Orta-içermeyen glikozSigma-Aldrich CompanyD5030Hücrelerin büyümesini destekler.
Hücre kültürü ortamı içinsodyum bikarbonatSigma-Aldrich CompanyS7277
Penisilin-Streptomisin GibCo. Şirket15140-148Hücre kültüründe bakteri üremesini engeller.
200mM  L-glutamin GibCo. Şirket25030-081Hücrelerin büyümesini destekleyen amino asit.
Fospahet tampon salin (PBS) tabletleriCalbiochem524650
Filtre Sistemi 50mL, 0.22um gözenekliCorning430320
Santrifüj konik tüp 50 mLVWR89039-658
Tek Akış Ölçer ve nbsp;Billups-RothenbergSMF3001Oksijen tahliyesinde gaz akışını ölçün.
Hipoksi İnkübatör Odası StemCell27310Hücre kültürü için hipoksik bir ortam oluşturur.
İzlenebilir Çözünmüş Oksijen ÖlçerVWR21800-022
%95 N2 / %5 CO2 Gazı KarışımıLindeOksijen ortamını temizler.
<> Birincil Astrosit İmmünofloresan - Adım 6< / Güçlü>
Fosfat Tampon Salin (PBS) TabletleriCalbiochem524650
Formalin Çözeltisi Nötr Tampon% 10Sigma-AldrichHT501128Hücreleri sabitlemek için kullanılan çözelti.
Metanol ve nbsp;FisherA4544Hücreleri düzeltmek için kullanılan çözelti.
İyonik olmayan yüzey aktif madde (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
Fetal sığır serumu (FBS)GibCo. Şirket10437-010Hücre kültürü için serum takviyesi.
Anti-NeuNHücre Sinyali24307Olgun nöronları tespit eder, astrositik kültürü doğrulamaya yarar.
Anti-PCNAHücre Sinyali2586Çoğalan hücreleri tespit eder.
Propidyum İyodür (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170Apoptoz boyama.
Anti-Olig1AbcamAB68105Olgun oligodendrositleri tespit eder.
Anti-Iba1+Wako016-20001Mikroglial hücreleri tespit eder.
Cy3  ile Konjuge Anti-GFAP;Sigma-Aldrich CompanyC9205Tedavi edilen hücrelerdeki reaktif astrositleri tespit eder.
Alexa Fluor 488Moleküler Prob Yaşam TeknolojisiA1101Anti-Fare İkincil Antikor.
Alexa Fluor 555Moleküler Prob Yaşam TeknolojisiA21428Anti-Tavşan İkincil Antikor.
4 ',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542Nükleer boyama.
Konfokal mikroskopOlympus
Eki. Eki.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574(2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282(2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987(2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Astrosit zolasyonuOksijen Glikoz Yoksunlu uPrimer Astrosit K lt rGFAP mm nofloresansPCNA Proliferasyon AnaliziNeonatal S an KorteksiDoku DissosiyasyonuHipoksi OdasH cre ProliferasyonuReaktif Astrositler

İlgili makaleler