Yöntem makalesi

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

DOI:

10.3791/55112

⸱

28 Aralık 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fizyolojik oksijen koşulları sırasında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan translasyon başlatma faktörlerini analiz etmek için insan hücre kültürü protokollerini sunuyoruz. Bu yöntem, Agaroz bağlantılı bir m7GTP başlık analoğu kullanır ve kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için uygundur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translasyonel kontrol, özellikle hücresel stres dönemlerinde gen düzenlemesinin odak noktasıdır. eIF4F kompleksi aracılığıyla kap bağımlı translasyon, ökaryotik hücrelerde protein sentezini başlatmak için açık ara en yaygın yoldur, ancak bu kompleksin strese özgü varyasyonları şimdi ortaya çıkmaktadır. Kapak bağlayıcı proteinlerin, Agaroz'a bağlı m7GTP'den (bir 5' mRNA kapak analogu) oluşan bir afinite reçinesi ile saflaştırılması, translasyon başlatmanın düzenlenmesinde yer alan faktörleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Hipoksi (düşük oksijen), fetal gelişim ve tümör ilerlemesi sırasında karşılaşılan hücresel bir strestir ve büyük ölçüde translasyon regülasyonuna bağlıdır. Ayrıca, yakın zamanda, insan yetişkin organlarının, hücrelerin rutin olarak kültürlendiği ortam havasından hipoksiye daha yakın olan daha düşük bir oksijen içeriğine (fizyoksi% 1-9 oksijen) sahip olduğu bildirilmiştir. Hipoksik bir eIF4F kompleksinin (eIF4FH) devam eden karakterizasyonu ile, 5' mRNA başlığı aracılığıyla oksijene bağlı translasyon başlangıcını anlamaya yönelik artan bir ilgi vardır. Yakın zamanda, oksijen mevcudiyeti ile düzenlenen kapak bağlayıcı proteinleri analiz etmek için bir insan hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Bu protokol, oksijene maruz kalmayı ortadan kaldırmak için hücre kültürü ve lizisin bir hipoksi iş istasyonunda gerçekleştirilmesini vurgular. Sıvı ortamın iş istasyonu içindeki atmosferle dengelenmesi için hücrelerin en az 24 saat inkübe edilmesi gerekir. Bu sınırlamayı önlemek için, daha kısa zaman noktaları gerekiyorsa hücrelere önceden koşullandırılmış ortam (oksijeni alınmış) eklenebilir. Bazı kapak bağlayıcı proteinler, ikinci bir baz ile etkileşimler gerektirir veya m7GTP'yi hidrolize edebilir, bu nedenle saflaştırma işleminde bazı kapak interaktörleri gözden kaçabilir. Enzimatik olarak dirençli kapak analoglarına bağlı agaroz bu protokolde ikame edilebilir. Bu yöntem, kullanıcının kapağa bağlı çeviride yer alan yeni oksijen regüle çeviri faktörlerini tanımlamasına olanak tanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeviri kontrol özellikle hücresel stres 1 dönemlerde, gen ifadesinin transkripsiyonel düzenlemeye eşit derecede önemli bir adım olarak ortaya çıkmaktadır. Çeviri kontrolünün odak noktası protein sentezi ilk adımları 7-methylguanosine ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E) bağlanma içeren başlatılması hız kısıtlayıcı adım (m 7 GTP) mRNA 2 5 'kapak olan . eIF4E eIF4A, bir RNA helikaz ve eIF4G, diğer çeviri faktörleri ve 40S 3 ribozom alımı için gerekli bir iskele protein içerir eIF4F adında bir trimerik kompleksinin bir parçasıdır. Normal fizyolojik şartlar altında, mRNA büyük çoğunluğu bir kapak-bağımlı mekanizma yoluyla çevrilir, hücresel stres dönemlerinde, insan mRNA yaklaşık% 10 1,4 intiation kap bağımsız çeviri izin verebilir 5 'UTRs içerir. Cap-bağımlı çeviri tarihsel eşanlamlı olmuşturous eIF4F ile, ancak, eIF4F stres özgü varyasyonlar eğilimi konu 5-8 haline gelmiştir.

Çeşitli hücresel stresler eIF4E aktivite rapamisin kompleksi 1 (mTORC1) memeli hedefin üzerinden bastırılmış neden olur. Bu kinaz hedefleri birinin aktivite artışı ile sonuçlanır stres altında güçleşir, (4E-BP) proteini 4E bağlayıcı değildir. Fosforilatlanmamış 4E-BP eIF4E ve bloklar eIF4G kap bağımlı çeviri 9,10 baskı neden ile etkileşim yeteneğini bağlanır. İlginç bir şekilde, eIF4E2 (veya 4EHP) adı eIF4E bir homologu, belki de stres kaynaklı baskı kaçmasına izin 4E-BP 11 için daha düşük bir afiniteye sahiptir. Gerçekten de, ilk bağlı eIF4G 12 ile etkileşim olmayışı nedeniyle çevrilmesinin bir bastıncısı olarak, özelliği, eIF4E2 hipoksik strese 6,13 sırasında 3 'UTR RNA hipoksiya tepki unsurları içeren mRNA yüzlerce çeviri başlatır. Bu aktivasyon, IeIF4G3, RNA hipoksik eIF4F kompleksi veya eIF4F H 6,13 teşkil protein motifi 4, ve hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 2a bağlayıcı etkileşimler yoluyla elde s. Normal koşullar altında, bir bastıncısı olarak eIF4E2 GIGYF2 ve ZNF598 14 ile bağlanmaktadır. Bu kompleksler, kısmen, Agaroz bağlanmış m 7 GTP afinite reçinesi ile tespit edilmiştir. Bu klasik yöntem 15 çeviri alanında standart ve en iyi ve en yaygın aşağı çekme de kap-bağlama kompleksleri izole etmek için tekniği kullanılmıştır ve in vitro bağlanma deneyleri 16-19 olduğunu. Kap-bağımlı çeviri makine arası değişen parçalar 6-8,13 gibi esnek ve uyarlanabilir ortaya çıkmaktadır olarak, bu yöntem hızla stres yanıtı katılan yeni kap-bağlayıcı proteinlerin tanımlamak için güçlü bir araçtır. Birkaç ökaryot model sistemler stres yanıtları gibi bir eIF4E2 homolog kullanmak göründükleri gibi Dahası, eIF4F değişimleri geniş etkileri olabilirC. thaliana 20 gibi, S. Pombe 21, D 22 melanogaster ve C 23 elegans.

Kanıt eIF4F değişiklikler sıkı koşullar stres, ancak normal fizyolojisi 24 dahil olmak sınırlandırılamaz düşündürmektedir. (Mikroelektronlar üzerinden ölçülen) (kılcal uçlarında) ya da dokular içinde dokulara oksijen kaynağı beyindeki 25% 2-6 arasında değişmektedir, akciğerlerde 26% 3-12, bağırsak 27,% 4 in 3,5-6% karaciğer 28, böbrek 29% 7-12, kas 30 içinde% 4 ve kemik iliği 31% 6-7. Hücreler ve mitokondri% 1,3 oksijen 32 daha az içerirler. Bu değerler hücrelerinin rutin olarak kültürlendiği olan çevre havası daha hipoksiye daha yakındırlar. Bu ne daha önce hipoksi özgü hücresel süreçleri fizyolojik bir ortamda ilgili olabileceği gibi düşündüm olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, eIF4F ve eIF4F H aktif fizyolojik oksijen ya da "physioxia" 24 maruz çeşitli insan hücre çizgileri belirgin havuzlar ya da mRNA sınıfları için başlatma katılabilir. Düşük oksijen, aynı zamanda uygun fetal gelişim 33 sürücüler ve hücreler genellikle daha yüksek çoğalma oranları, uzun ömürleri, daha az DNA hasarını ve physioxia 34 daha az genel stres yanıtları var. Bu nedenle, eIF4F lH olasılıkla fizyolojik koşullar altında seçme genin ifadesinde önemli bir faktördür.

Burada, sabit fizyolojik oksijen koşullarında veya doku mikroçevrelerde büyük olasılıkla daha fazla temsilcisi olan dinamik bir dalgalanma aralığı kültür hücreleri bir protokol sağlar. Bu yöntemin bir avantajı, hücre hipoksi iş istasyonu içinde lize olmasıdır. Hücre lizizi hipoksik hücre kültüründen geçiş diğer protokollere yapılan ne sıklıkta açık değildir. Hücreler genellikle ilk olarak küçük bir hipoksi inkübatör kaldırılır olmakoksijene hücresel yanıtı (bir ya da iki dakika) 35 hızlı olduğu ön parçalama, ancak oksijen bu poz biyokimyasal yollar etkileyebilir. Bazı kap-bağlayıcı proteinler ikinci bir baz ile etkileşimleri gerektiren veya bu nedenle bazı kapak interaktörler arıtma sürecinde gözden kaçabilir m 7 GTP, hidrolize olabilir. Agaroz bağlanmış enzimatik dayanıklı kap analoglarına Bu protokolde ikame edilebilir. Burada anlatılan yöntemi ile aktivite ve eIF4F H ve eIF4F diğer varyasyonları kompozisyonunu keşfetmek hücreler fizyolojik koşullar ya da stres yanıtları sırasında kullanmak karmaşık gen ifadesi makine ışık tutacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre Kültürü 1. Hazırlıklar

  1. insan hücrelerinin ticari olarak temin stoklarının al.
    NOT: Bu protokol, HCT116 kolon karsinomu ve birincil insan renal proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (HRPTEC) kullanır.
  2. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 7.5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş / yüksek glukoz ortamı: HCT116 kültürü için 500 mi tanesidir.
  3. % 5 FBS,% 1 epitel hücre büyüme takviyesi ile takviye Epitelyal hücre ortamı, ve% 1 P / S: 500 mi HRPTEC kültürü için tanesidir.
  4. 140 mM NaCI, 3 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4: 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 500 ml hazırlayın. 7.4 pH ayarlamak ve 121 ° C'de 40 dakika süre ile otoklavlama sureti ile sterilize.

Hücre kültürü 2. Başlatma

  1. Dikkatle t bozmadan% 80-90 konfluent çanak orta aspireO hücreleri.
  2. kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın.
  3. 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yıkanır ve hafifçe eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelere kaya kısım. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 90 sn için 4000 xg, 15 ml'lik bir santrifüj tüpü ve santrifüje müstakil hücreleri aktarın.
  5. tam DMEM 1 ml tekrar süspansiyon hücre pelet.
  6. bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Cm2 başına yaklaşık 2,500-5,000 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu elde etmek için gereken kaç pirojenik olmayan ve polistiren 100 mm'lik bir hücre kültür kaplarına hesaplayın.
  7. adım 30-45 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1.2 veya 1.3 yapılan ön sıcak tam hücre kültürü ortamı.
  8. % 70 etanol ile orta şişe ve hücre şişesini dekontamine. ileriye bu noktadan itibarenişlemler aseptik olarak yapılmalıdır.
  9. Kısım adım 2.6 belirtilen tohum ekme yoğunluğu olan dondurulmuş hücre, tüm birimi kullanmak, çok 100 mm hücre kültür kaplarına tam DMEM 6 mi.
  10. 100 mm kültür çanakları her adım 2.6 hesaplanan hücre süspansiyonu hacmi aktarın. eşit plaka yüzeyi üzerinde hücreleri dağıtmak için elle her plakayı sallayın.
  11. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübatörde tohumlanmış 100 mm hücre kültür çanağı yerleştirin. Hücreler sonraki adımlarda önce en az 24 saat inkübe izin verin.

3. besi yerinden

  1. Hücre konfluent yüzdesini (çanak alanı kapsayan% hücreleri) belirlemek için bir mikroskop altında her bir hücre kültür çanağı gör. kuvöz ve öncesi sıcak tam orta ve 1x PBS hücreleri dönün. Hücreler% 80-100 konfluent iseniz bir sonraki adıma geçin.
  2. Dikkatlice bozmadan harcanan orta aspireHer bir kültür kabı hücreler.
  3. kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın.
  4. Kısım 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin-EDTA ve yavaşça kaya eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelerine temin etmektedir. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Bu kuluçka sırasında, kısım kadar kültür tabaklarında tam ortam, 10 ml cm2 başına 2,500-5,000 hücre hücre yoğunluğu elde etmek için gereklidir.
  6. Hücreler plakasından ayrılmış olduğunda, hızlı bir şekilde 1 x tanımlanan tripsin inhibitörü 3 ml ilave edilir ve yavaşça tripsin-EDTA tüm nötralize edilmiş olmasını sağlamak için 1 dakika için çanak girdap.
  7. steril bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne ayrılmış hücreleri aktarın ve kenara. Kalan hücreler bir araya ve aynı 15 mi santrifüj borusuna bu transfer çanak PBS 1X 3 ml ekleyin.
  8. 150 xg santrifüj edilerek pelet hücreleri5 dakika karıştırıldı.
  9. Süpernatant aspire ve tam ortam 3 ml hücre pelletini.
  10. Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı ve cm2 başına 2,500-5,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek için tam ortam 15 ml ihtiva eden 150 mm kültür kaplarına tohum. Her bir kap-bağlanma tahlili için iki 150 mm kullanın.
    Not: sıvı ortam ile hücrelere oksijen difüzyon Cilt 36 bağlıdır. Süspansiyon içindeki yapışan hücreler veya hücre kullanılıp kullanılmadığını deneyler arasında tutarlı medya hacmini tutulması tavsiye edilir. Medya yayılmasında bu değişkenliğe önlemek için (Tartışma tartışıldığı gibi 24 saat iş istasyonu inkübe) önceden klimalı edilebilir.
  11. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübatör tohumlanmış kültür yemekler yerleştirin. Hücreler sonraki adımlara geçmeden önce en az 24 saat inkübe izin verin.

4. Physioxic Pozlama

  1. mikroskop altında hücre gör. bes içint sonuçları, hücreler 24 saat pozlama için% 70-80 konfluent, 48 saat pozlama için% 50-60 konfluent ve 72 saat pozlama için% 40-50 konfluent olduğundan emin olun.
  2. İstenen süre (24, 48, ya da deneye bağlı olarak 72 saat) hipoksiyaya iş istasyonuna hücreleri yerleştirin.
  3. Uygun physioxia için iş istasyonu ayarlayın.
    NOT: Örneğin,% 3 O 2 ayar% 5 CO 2 ve% 92 N2 eşlik ediyorum.
    NOT: Dinamik aralık içinde oksijen dalgalanmaları aracı haline belirli bir zaman çizelgesi, program takvimi üzerinde istenen veya manuel olarak istenen aralıklarla oksijen ayarlarını varsa.
  4. % 60 nem ayarlayın. iş istasyonu atmosfer yine de çok kuru ve medya belirgin uzun deneyler (> 48 saat) boyunca buharlaşır. (Ortam iş istasyonu bir atmosfer ile dengelenir böylece) hücre kültürü DIS ortamı doldurmak için iş istasyonu olan bir hücre kültür şişesi içinde ortam rezervini muhafazahes.
    Not: çözünmüş oksijen, atmosferik oksijen 36 dengelenir, böylece (örneğin, PBS ve tripsin-EDTA gibi) liziz önce hücreler ile etkileşim herhangi bir çözüm hipoksi iş istasyonu olan, kullanımdan önce, 24 saat için önceden şartlandınlmalıdır.
  5. lizis kadar iş istasyonu içinde hücreler tutun.

Cap-bağlama deneyi 5. hazırlanması Tamponlar

  1. 1x Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) hazırlayın.
    1. DH 2 O 800 ml, 8.76 g, NaCl ve 6.05 g Tris baz çözülür.
    2. 1 M HCI kullanılarak 7.4'luk bir nihai pH'a çözüm sağlamaktadır.
    3. DH 2 O. kullanarak 1 L son hacim kazandırın
  2. denatüre lizis tamponu hazırlayın. Cap-bağlama analizinin yapılacağı güne liziz tamponunda hazırlanır. Boş agaroz boncuk ve γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk (7,9 ve 7.13 adımlar) yıkamak için ekstra lizis tamponu yapın.
    1. DH 2 O 7 ml, 160 ul 5 M NAC eklemeL, 160 ul 1 M Tris-HCI pH 7.4, 40 ul 200 mM NaF, 40 ul 1 M MgCl2, 40 ul 1 mM sodyum ortovanadat.
    2. 7 mi çözeltisine Igepal 40 ul ekle. son derece viskoz olduğu gibi Igepal ™ almak yardımcı olmak için pipet ucu kesin.
    3. Igepal tüm çözünmüş kadar, aşağı yukarı pipetleme veya vorteks 7 ml solüsyon karıştırın.
    4. 8 ml çözeltinin son hacmi kaldırın ve buz üzerinde tutun.
  3. 4x sodyum dodesil sülfat (SDS) -PAGE Örnek Tamponu hazırlayın.
    1. Bir cam kaba, 16 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8, 12.64 ml gliserol, ve 8 ml ditiotreitol (DTT) birleştirir.
    2. SDS 3.2 g ve bromofenol mavisi, 0.16 g ekleyin. Toz tamamen manyetik karıştırıcı ile karıştırılarak erimesine izin verir.
    3. -20 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kısım ve mağaza.

6. Hücre Liziz

  1. denatüre edici olmayan lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde th günlük tutmakE Cap-bağlanma tahlili.
  2. 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1 x PBS öncesi sıcak ve tripsin.
  3. Her bir kap-bağlanma tahlili için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine lizis tamponu kısım 980 ul yapılmaktadır.
  4. liziz tamponu 980 ul 4- (2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorür 10 ul ve 100x proteaz önleyici kokteyl 10 ul ekle. buz üzerinde tutun.
  5. hipoksi iş istasyonu içinde bir çöp konteynırına her 150 mm çanak medya atın.
  6. Sıcak 1x PBS 3-4 ml hücreleri yıkayın ve tüm sıvı atın.
  7. Her bir tabak sıcak% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml ilave edilir ve 2 dakika boyunca ya da hücreleri artık plakaya tutunur kadar bekletin.
  8. Bir pipet kullanarak, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir plaka hücreleri transferi. hücrelerin her plaka ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılır, böylece gerektiğinde tekrar edin.
  9. 90 saniye t 6,000 xg'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri santrifüjO pelet hücreleri.
  10. pelet bozmadan pipet kullanarak tripsin aspire. pelet 90 saniye boyunca 6.000 xg, yeniden santrifüj 1,5 ml'lik ependorf tüp rahatsız edilirse.
  11. nazikçe sadece pelet yukarıda tüpe PBS 200 ul pipetleme sıcak 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Yeniden santrifüj pelet rahatsız olup olmadığını.
  12. pelet bozmadan PBS aspire.
  13. 1 ml Pipet 500 ul birinci hücresel pelet üzerine liziz tampon çözeltisi hazırlandı. Yukarı ve aşağı pipetleme tamamen pelletini.
  14. İkinci hücre pelet ile yeniden süspanse hücreleri birleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleme ikinci pelletini. Tüm topaklar birleştirildi ve her bir örnek için yeniden süspanse edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
  15. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde liziz tamponunda kalan 500 ul lizat birleştirin.
  16. hipoksi iş istasyonundan örnekleri çıkarın.
    Not: liziz tamponu ilave edildikten sonra, birII Daha sonraki aşamalar, hipoksi, iş istasyonu, 37 ° C olarak ayarlanmış ve aşağıdaki adımlar soğuk (4 ° C veya buz üzerinde) gerçekleştirilir edilecek olduğu gibi çevre havası ifa edilecek olan vardır.
  17. Lyse 1.5-2 saat boyunca 4 ° C'de örnekleri çevirerek nazik ajitasyon kullanılarak hücreler.
  18. selüler artığın ayrılması için 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de lize hücreleri santrifüjleyin.
  19. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp lizat aktarın ve pelet atın.
  20. Süpernatantın bir kısmı (% 5-10), gelecekte Western blot analizi için bir bütün hücre lizatı giriş kontrol olarak kullanılmak üzere ayırın.

7. Cap-bağlanma deneyi

  1. Her numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ayırmak için boş agaroz boncuk kontrol bulamacın 50 ul ve γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlanmış boncuk çamuru 50 ul transfer. boncuk bulamaç toplanmasını kolaylaştırmak için pipet ucu çıkarmak için makas kullanın.
  2. boncuk b peletY 30 sn boyunca 500 xg'de bulamaç santrifüj.
  3. dikkatlice Süpernatantı ve TBS 500 ul boncuklar tekrar süspansiyon.
  4. Tekrarlayın 7.2 ve 7.3 adımları tekrarlayın. 30 saniye boyunca 500 xg'de boncuk Pelet ve süpernatant kaldırmak.
  5. Boş agaroz boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp adım 6.19 lizat içeren süpernatant aktarın.
    NOT: Boş agaroz boncuklar non-spesifik boncuk ile etkileşime lizat proteinleri kaldırmak için bir ön temizleme adımı olarak hareket ederler.
  6. yavaşça sallanarak 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
  7. 30 saniye boyunca 500 xg'de santrifüj edilerek boş agaroz boncuk pelet.
  8. Γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne lizat aktarın.
  9. Liziz tamponu 500 ul boncuk yeniden süspanse 30 sn boyunca 500 xg'de santrifüjleme ile boncuk tane haline ve Superna ayıklayarak boş agaroz boncuk yıkayıntant. Beş yıkar toplam bu dört kez tekrarlayın.
  10. 1x SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde boş bir agaroz boncuklar tekrar süspansiyon ve 95 ° C'de 90 sn için boncuk kaynatın. gelecekteki Western blot analizi için -20 ° C'de saklayın ilgili protein boncuk olmayan spesifik olarak bağlanan bakmaktır.
  11. Cap bağlayıcı proteinler yakalamak için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar ile lizat inkübe edin.
  12. 30 saniye için 500 x g'de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet. süpernatant atın.
  13. Adım 7.9 yineleyerek γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk yıkayın.
  14. liziz tamponu 600 ul boncuk tekrar.
  15. 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar GTP ekleyin.
  16. 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar + 1 mM GTP inkübe edin. Not: Bunon-spesifik m 7 GTP ile etkileşim proteinleri ilişkisini (yani, non-metile GTP ile etkileşim).
  17. 30 saniye için 500 x g'de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet.
  18. yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatantı aktarın ve 4x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) 200 ul ilave edin. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C 'de GTP kontrol örneği saklayın. adım 7.9 tekrarlayarak boncuk yıkayın.
  19. 90 sn için 95 ° C 'de 1 x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) ve kaynama boncuk tekrar. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C 'de 7 m GTP'ye bağlı fraksiyonu saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir m 7 GTP Affinity Sütun içinde eIF4E ve eIF4E2 ve Oksijen Cevabı Cap-bağlama yeteneği analizi

1. Şekil 2, iki insan hücre çizgileri oksijen dalgalanmalara tepki olarak iki ana kap bağlayıcı proteinler tipik m 7 GTP afinite saflaştırma western lekelerinin temsil etmektedir: F ŞEKIL 1 ve kolorektal karsinom primer insan renal proksimal tübüler epitelyel hüc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizyolojik oksijen koşullarına maruz insan hücrelerinde kap bağlayıcı proteinlerin analizi, yeni oksijen regüle çeviri başlatma faktörlerinin tanımlanması için izin verir. MRNA veya başka bir kap ile ilişkili proteinlerin hem 5 'başlık için bu faktörlerin afinite m 7'ye olan ilişkilerine gücü ölçülebilir agaroz boncuklar GTP-bağlı. Bu tekniğin bir uyarı proteinlerin post-lisis kapağı bağlama potansiyelini ölçer, ancak, protein-protein etkileşimleri ve post-translasyonel modifikasyonları (PTMS) muhafaz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi ve Ontario Araştırma ve Yenilik Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
γ-aminofenil-m7GTP agaroz C10 bağlı boncuklarJena BioscienceAC-1555Agaroz bağlantılı m7GTP
100 mm kültür kabıCorning87722210 cm kültür kabı
150 mm kültür kabıThermofisher13018315 cm kültür kabı
AEBSF HidroklorürACROS OrganiklerA0356829AEBSF
Agaroz BoncukJena Bioscience AC-0015Agaroz boncuk kontrolü
Bromofenol BlueFisherBP112-25SDS-PAGE yükleme tamponunun bileşeni
1.5 ml Santrifüj TüpleriFroggaBio1210-00SKüçük hacimleri santrifüjlemek için kullanılır
15 ml Konik Santrifüj TüpleriFisher1495970CBirincil hücrelerin kültürlenmesinde kullanılır
Tanımlanmış tripsin inhibitörüFisherR007100DTI
DitiyotreitolFisherBP172-25DTT
Epitel hücre ortamı (komple kit)ScienCell4101Serum ve büyüme faktörü takviyeleri içerir)
GliserolFisherBP229-1SDS-PAGE yükleme tamponunun bileşeni
100 mM Guanozin 5'-trifosfat, 1 mlJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 kolorektal karsinomATCCCCL-247İnsan kanseri hücre hattı
İnsan renal proksimal tübüler epitel hücreleriATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/Yüksek GlikozGE Yaşam BilimleriSH30022.01İnsan hücre kültürü için standart ortam
Hipklon Penisilin-Streptomisin çözeltisiGE Yaşam BilimleriSV30010DMEM'in
H35 HypOxystationHypoxygenN/AHipoksi iş istasyonu
Igepal CA-630MP Biyomedikal2198596Lizis tamponunun deterjan bileşeni
Monopotasyum fosfatFisherP288-500KH2PO4
Potasyum klorürFisherP217-500KCl
Magnezyum klorürFisherM33-500MgCl2
Sodyum klorürFisherBP358-10NaCl
Sodyum florürFisher5299-100NaF (lizis tamponunun fosfataz inhibitörü bileşeni)
Disodyum fosfatFisher5369-500Na2< / sub>HPO4< / sub>
Premium Sınıf Fetal Sığır SerumuSeradigm1500-500FBS
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)Hücre Sinyalizasyonu58715Lizis tamponunun bileşeni
Sodyum Dodesil SülfatFisherBP166-100SDS
Sodyum OrtovanadatSigma56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5Tamponların bileşeni
% 0.05 Tripsin-EDTA (1x)Life Technologies2500-067Tripsin yapışkan hücreleri ayırmak için kullanılır
antibiyotik bileşeni

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90(2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394(2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cap binding ProteinsOxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolPhysiological Oxygen ConditionsTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

İlgili makaleler