Yöntem makalesi

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

11.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55150

⸱

20 Ocak 2017

 , 
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

Bu makalede

Özet

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Özet

Hastalık belirtileri moleküler mekanizmalarını aydınlatmak bitki bilimi patolojileri ve semptom gelişimini anlamak önemlidir. Bakteriler kendi çıkarları için ev sahibi metabolizmasını işlemek için farklı stratejiler geliştirmişlerdir. Bu bakteri manipülasyon sıklıkla şiddetli semptom gelişimi veya etkilenen bitkilerin ölümü ile birleştirilir. konak manipülasyon sorumlu özel bakteriyel molekülleri belirlenmesi mikrobiyolojik araştırmalarda önemli bir alan haline gelmiştir. adı bu bakteriyel moleküllerin tespit edilmesinden sonra "efektörleri," kendi fonksiyonu ortaya çıkarmak için önemlidir. Basit bir yaklaşım, bir efektör işlevi, bir maya iki-hibrid (Y2H) ekran ile doğal konukçuda da proteinli bağlanma ortağı tespit etmek belirlemek için. Normalde ev sahibi siliko algoritma herhangi biri tarafından yeterince tahmin edilemez çok sayıda potansiyel bağlanma ortakları barındırır. Nedenle perfo için en iyi seçimdirifade konak proteinlerin bir bütün kütüphane karşı varsayımsal efektör içeren bir ekran rm. etkeni phytoplasma gibi İşlenen ise özellikle zordur. Bu protokol phytoplasma enfekte odunsu konukçu bitki, potansiyel efektör yükseltilmesi ve Y2H ekrana sahip tesisin moleküler etkileşim ortağı sonraki kimlik DNA saflaştırılması için adım adım yönergeler sağlar. Y2H ekranlar yaygın olarak kullanılan olsa bile, bir ücret karşılığında Y2H hizmeti sunan biyoteknoloji şirketleri bu tekniği fason bir eğilim vardır. Bu protokol, standart laboratuvar teknikleri kullanarak herhangi bir terbiyeli donanımlı moleküler biyoloji laboratuarında bir Y2H gerçekleştirmek ilişkin yönergeler sağlar.

Giriş

Bira mayası iki-hibrid ekranlar (Y2H), 11 yaklaşık 27 yıl önce 1 geliştirilmiş ve yaygın olarak özel protein-protein etkileşimlerini 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 belirlemek için çeşitli alanlarda kullanılmaktadır zamandan beri edildi . bir konakçı hedef proteine ​​bakteriyel efektör fiziksel etkileşim genellikle, bu hedef proteinin fonksiyonel manipülasyonu için bir ön koşuldur. Bu etkileşimler analiz enfeksiyon biyoloji 12, 13, 14, 15, birçok farklı sektörlerin odak taşındı,"16, 17, 18. Y2H ekran ilkesi iki proteinin etkileşim haberci genlerin ekspresyonunu tahrik eden bir fonksiyonel bir transkripsiyon faktörünün sulandırıldıktan neden olmasıdır. Bilinmektedir efektör (>" yem ") translasyon birleştirilir DNA bağlama sahası transkripsiyon faktörünün (DBD), ve potansiyel etkileşim mümkün ( "av") karşılıklı etkileşim eşleri, potansiyel bir kütüphane bilinmediği için., ilgili transkripsiyon faktörünün aktivasyon alanı (AD) kaynaştırılmış oldukları Uygulayıcılar sözde klonlanır "av-kütüphane". Normal olarak, bu kütüphane yapılır DBD kodlanmış yem vektör ile uyumlu AD kodlayan uygun bir av vektörü ifade plazması içine cDNA'ları klonlanmasıyla. etkileşim halinde, yeniden transkripsiyon faktörleri genellikle maya büyümesi seçilmesine olanak tanır haberci genlerin ekspresyonunu indükler.interactors tanımlama plazmid özgü primerler ile bir av plasmidi dizilenmesi ile elde edilir.

Bakteriler işlemek ve ev sahibinin metabolizmasını istismar veya savunma mekanizmalarını kaçmasına ve farklı bakteri salgı sistemlerinin 19, 20, 21 üzerinden efektör molekülleri salgılaması için çeşitli stratejiler geliştirmiştir. Bu bakteri etkileyiciler bağlayıcı partnerleri belirlenmesi ve böylece ev sahibi manipüle yolu belirlemede ilk adımdır. Bu özel patojenite mekanizmaları daha iyi anlaşılması yol açar.

Y2H ekranlar phytoplasmoses sırasında bakteriyel efektör etkileşimlerini tespit etmek için gerçekleştirilir ve genellikle, Y2H fitoplazmalar Research 22, 23 moleküler patojenite mekanizmaların daha fazla karakterizasyon için çok önemli bir başlangıç deneydir. Bununla birlikte, bir araya geldiEn yayınlarda hod açıklama oldukça azdır ve bu teknikler genellikle biyoteknoloji şirketleri için yaptırılmaktadır. Bu yöntemin fizibilite dikkat çekmek için, bu protokol doğal konakta bakteriyel efektör molekülünün etkileşim ortakları belirlemek için adım-adım bilgi sağlar.

Geniş kullanım ve Y2H ekranlarının hızlı ileri yaklaşıma rağmen, belli etkileşimler maya sistemde meydana olmayabilir unutmamak gerekir. Bu maya hücresi, belirli bir biyolojik sınırlamalar ile "in vivo Reaksiyon kabı" bir tür olarak kullanılması gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Birçok yazar avantajları ve Y2H ve türevleri 11, 24, 25, 26, 27 dezavantajları ele alınmıştır. Genel hususlar maya hücresi, uygun temin olmayabilir, örneğin, şunlardırGen ifadesi, (post) translasyonel veya ilgili proteinlerin translocational koşullar çalışılmaktadır. Bu ekranda yalancı negatif sonuçlara yol açabilir. Olumlu etkileşimler da eserler olabilir ve (uygun bir konak içinde efektör durumunda, örneğin), doğal durumda ortaya olmayabilir. Bir daha yakından ilişkili biyolojik sistemde bağımsız bir etkileşim testi ile heterolog maya ifade sisteminden etkileşimi onaylamak için böylece vazgeçilmezdir.

Bu çalışmada, sigara tarıma bitki patojeni mali Candidatus fitoplazmalar (S. Mali) efektör ATP_00189 bağlayıcı partnerleri tespit edilmiştir. Sonuçlar elma çoğalması 28, Avrupa'da 29 etkilenen elma büyüyen bölgelerde yüksek ekonomik kayıplara neden olan bir hastalık belirtisi gelişimine neden olan moleküler mekanizmalar önemli bir anlayış sağlamak.

Protokol

1. Enfekte Elma Ağaçlarının gelen Kök ve yaprak örnekleri Toplama

Not: Patojen spesifik DNA kök ya da yapraklardaki saflaştırılabilir. Aşağıdaki bölüm hem örnekleme için bir protokol sağlar.

  1. DNA hazırlığı için
    1. köklerinden numune toplama ve hazırlama
      1. "Elma çoğalması" e özgü belirtiler 30, 31 ve semptom-ücretsiz kontrol ağaçları ile enfekte ağaçları belirleyin. 1 cm ve yaklaşık 5 sm bir uzunluğa - temiz budama makası kullanılarak, 0.5 bir çapa sahip kök örnekleri kesti. ve kök sisteminin üç farklı, uzak sitelerden kesilmiş numuneler, yeterince etiketli plastik torbalar içine koydu.
        1. soğutulmuş termal paketleri ile soğuk kutu içinde örnekleri tutmak ve daha fazla işlem kadar 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
          Not: Kök mimarisi ve yapısı fizyolojik durum o göre değişebilirAğacın f. Üç farklı sitelerde örnek ve çok ince rootlets almak önemlidir. örnekler 4 ° C 'de pek çok gün süre saklanabilir, fakat, daha uzun depolama süresi kalıp riskini arttırır. Küflenmiş örnekleri DNA hazırlanması için kullanılamaz.
      2. toprağı temizlemek için su ile kök örnekleri durulayın. steril bir petri koyun ve kök epidermis ve korteks kaldırmak için steril bir neşter kullanabilirsiniz.
        1. % 70 (v / v) etanol su çözeltisi daldırma, silme temiz, tüy bırakmayan bir doku ile neşter temizleyin ve bir açık alev (örneğin, Bunsen beki) ters ısı sterilize edin. steril bir 2.0 ml reaksiyon tüpüne doğranmış floem 100 mg - 30, neşter ile floemi Scratch küçük parçalar halinde doğrayın ve kısım. Birkaç ay boyunca -80 ° C 'de numuneler saklayın.
    2. Numune toplama ve yapraklardan hazırlanması
      1. Bir virüslü ve asemptomatik kontrol ağacı tespits aşama 1.1.1.1 açıklanan ve ağaç başına on yarasız yaprakları seçin. durum başına bir ağaç yeterlidir.
      2. Su ile yaprakları durulayın ve% 70 (h / h) etanol çözeltisi püskürtülerek yüzeyleri temizlemek. steril bir petri yaprakları koyun ve steril bir bisturi ile her yaprağın orta damarı (santral ven) teşrih. , Yaprak orta damarı epidermisi ve korteks kaldırmak küçük parçalar halinde kesilmiş yaprak orta damarı ve steril bir 2.0 ml reaksiyon tüpüne yaprak orta damarı doku kısım 100 mg. Birkaç ay boyunca -80 ° C 'de, DNA hazırlama veya deposu için hemen örnekleri kullanın.
        100 mg bölümler halinde bitki materyali kana uygun ve eninde sonunda depolama için onları dondurmak için: edin. Her eş pay, doğrudan DNA hazırlamak için de kullanılabilir. Donmuş bitki materyali parçaları oluşturmak eğilimindedir beri derin dondurulmuş bitki materyali Tartı, hantal.

2. setiltrimetilamonyum bromit (CTAB) DNA hazırlama tabanlı

Not: DNA, bitki malzemesi için herhangi bir sütun-bazlı DNA saflaştırma yöntemi kullanılarak saflaştırılabilir. Bu bölümde, DNA arıtma için bir CTAB-bazlı yöntem tarif edilmektedir. DNA saflaştırma başka yerde 32 tarif değiştirilmiş protokole dayalı olarak yapılır.

  1. Aşağıdaki tamponlar hazırlamak:
    1. CTAB tamponu: (: 364,45 g / mol CTAB, E r), 100 mM trishidroksimetilaminomethan (Tris, E r: 121.14 gr / ml), 1.4 M sodyum klorür (NaCI, E r: 58.44 g V setiltrimetilamonyum bromid% 1 w / çözündürün / mol), ve 20 mM etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (NaEDTA, E r: 372,24 g / mol), su ve bunların pH 8.0'a ayarlayın.
    2. N-loroilsarkosin tamponu: ve 100 mM Tris, ve su içinde 20 mM NaEDTA 8.0 pH ayarlamak N-loroilsarkosin sodyum tuzu 33 (293,38 g / Mol M R) a / h% 10 içinde çözündürülür.
    3. Tris-EDTA (TE) tampon maddesi: Su ve autocl 10 mM Tris ve 1 mM NaEDTA çözülürçözüm ave.
    4. Amonyum asetat solüsyonu: su içinde solüsyonu ve 120 ° C'de otoklav ve 20 dakika boyunca 1.2 bar: 5 M amonyum asetat (77,0825 g / mol M R) hazırlayın.
  2. CTAB tamponu, 300 uL, N-loroilsarkosin tamponu 30 uL, proteinaz K 6 uL (10 ug / ml) ve 12 uL taze veya dondurulmuş doğranmış bitki malzemesinin (aşama 1.1.2.2.), 100 mg - 30 karıştırın 2-merkaptoetanol 34 (M R: 78,13 g / mol). 60 ° C'de 60 dakika boyunca çalkalayın. mix geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
  3. amonyum asetat çözeltisi 360 uL ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. Çözelti 5 dakika için oturup, ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj olarak bildirin. Temiz bir şişeye süpernatantı aktarın ve buz gibi soğuk izopropanol 35 720 mcL ekleyin. -20 ° C'de en az 30 dakika boyunca DNA hızlandırabilir.
  4. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj karışımıC ° ve supernatant atın. buz soğukluğundaki% 70 etanol, 500 uL pelet yıkanır ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15,000 x g'de aşağı döndürün.
  5. Etanol Süpernatantı atın ve hemen kalıntı damlacıkları çıkarmak için temiz bir kağıt havlu üzerine flakon batırın. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için emin olun. 15-20 dakika boyunca veya bir vakum yoğunlaştırıcı santrifüj içinde 2-3 dakika için pelet hava-kurutun. Aşırı ısıtma veya genişletilmiş buharlaşma kez pelet aşırı kurutmayın.
  6. TE tamponu, 700 uL pelletini ve sonunda çözülmesini kolaylaştırmak için 37 ° C'ye ısıtın. RNAse 10 uL (10 ug / ml) ilave edilir ve 300 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de 15 dakika için inkübe edilir.
  7. Izoamil alkol 36: 24: 1 ve iyice karıştırın kloroform 700 uL ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin karışımı ve yeni, temiz bir şişeye yüzer üst faz transfer.
  8. ekleyerek üstte yüzen madde içindeki DNA çökeleği(: 60.1 g / mol izopropanol, E r) ve -20 ° C'de en az 30 dakika süreyle inkübe edilmesi, 2-propanol 35 ve 700 uL. 4 ° C'de 30 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin karışımı ve supernatant atın.
  9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g'de 70% etanol ve santrifüj 500 uL pelet yıkayın. Adım 2.5 açıklandığı gibi pelet kurutun. TE 50 uL içinde eritin.

PCR ile 3. Tespit Candidatus fitoplazmalar mali-spesifik DNA

  1. Nükleaz içermeyen su içinde bitki maddesinden 1:10 saflaştınldı DNA seyreltilir ve patojen-spesifik primerler 37 ile bir PCR çalıştırın.
    1. S. Mali phytoplasma 37 için primer ve spesifik problarla kantitatif PCR protokol kullanılarak bitki malzemesinin P. Mali özgü DNA'nın varlığını tespit etmek. Ca, ilgili prob ile aynı PCR gerçekleştirilerek diğer 16SrX phytoplasma üyeleri olmadığını kontrolnd. P. prunorum ve cand için. P. pyri DNA 37.
      NOT: enfekte olmayan ağaç DNA Bu kontrol bir patojene olmadığını teyit etmek için de test edilmelidir. Bu adımda, P. Mali dışında bir phytoplasma türden efektör amplifiye riskini arttıracaktır yana diğer yakından ilgili phytoplasma türe ait DNA, numunede mevcut olması önemlidir. Başka yakından ilişkili P. mali 16SrX grup phytoplasma ile karışık enfeksiyon ilgili problar ile örnek analiz ederek dışladı. beklenen sonuçlar, diğer 16SrX phytoplasma için negatif olmalıdır beri, PCR etkinliğini göstermek doğru pozitif kontrolleri dahil etmek önemlidir.

4. Potansiyel Efektör Gene Genişletici ve Y2H Bait vektör içine alt klonlama

  1. Primerler 5 kullanan Mali P. phytoplasmal gen atp_00189 (sinyal peptit parçası içermeyen) yükseltmek-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (ileri) ve 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (geri), sırasıyla 5 've 3' uçları, EcoRI ve SalI kısıtlama bölgeleri ile genişletilmiştir. Bir sütun tabanlı DNA saflaştırma yöntemi ile PCR ürünü saflaştırılır.
  2. EcoRI ve Sall ligasyonu yoluyla Y2H yem vektörü pLexA-N içine amplikon Clone.
    Not: Burada, EcoRI ve SalI 100 ng pLexA-N vektörü Benzer PCR amplikonu, 1 U T4 ligaz atp_00189 sindirilmiş 15 ng ile birleştirildi linearize. Ligasyon (25 ° C'de pH 7.9) 40 mM Tris-HCl içeren tampon içinde gerçekleştirildi, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol (DTT, E r: 154,25 g / mol) ve 0.5 mM adenozin trifosfat (ATP, E R: 16 ° C, gece boyunca (14-20 saat) 10.0 uL toplam hacim içinde 507,18 g / mol). Malus x domestica bağlanarak spesifik primer ekarte etmek için aynı primerler ile enfekte olmamış ağacından DNA analiz </ Em> DNA.
  3. E.coli elektro hücrelerine ligasyon karışımı 1 uL Dönüşümü ve Luria-Bertani kanamisine dirençli klonlar seçmek (LB) plakaları 50 ug / ml kanamisin sülfat 38 ile takviye edilmiştir.
  4. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir sütun-bazlı plazmid mini hazırlık seti ile seçilen bakteri klonlarından geri plazmid DNA saflaştınlır, ve sıralama 39 ile insertin başarılı entegrasyon ve yönünü kontrol edin.

Potansiyel Efektör Protein Öz aktivasyonu (Otomatik aktivasyon) için 5. Test

  1. Aşağıdaki tamponlar ve büyüme ortamının hazırlanması:
    NOT: maya-selektif plakalar hyphenates için isimlendirme ile ilgili ortam eksik amino asit kısaltmaları bir "-" kısaltma öncesinde. Örneğin, SD-Trp-Leu-Plakasını tüm amino asitleri, ancak Trp Leu ve onun içerir.
    1. 10x Bırakma karışımı: tartılırL-arginin monohidroklorür, 200 mg (E R: 210,66 g / mol), L-izolösin, 300 mg (E R: 131.17 g / mol), L-lisin monohidrat 269 mg (E R: 164.21 g / mol), L-metionin, 200 mg (E R: 149,21 g / mol), L-fenilalanin (500 mg E R: 165,19 g / mol), L-treonin 2 g (E R: 119,12 g / mol), 300 mg L-tirosin (MR: 181,19 g / mol), L-urasil (112,09 g / mol) ve 200 mg, ve L-valin 1.5 g (E R: 117,15 g / mol). iki kez damıtılmış su, 1 L bunları çözülür ve çözelti otoklav. 4 ° C'da, çözelti tutun.
      NOT: İlgili bırakma karışımı da satın premix olabilir.
    2. 10x L-adenin ek L-adenin hemisülfat tuzu (ADE, E r: 184,17 g / mol), 100 mg ağırlığında ve iki kez damıtılmış suyun 50 mL içinde çözülür. Filtre 0.22 mikron gözenek filtre ile çözüm sterilize edin.
    3. 10x L-histidin ek: L-histidin monohidroklorür monohidrat 100 mg tartılır (onun, M r : iki kez damıtılmış su ve filtre 50 ml 209,63 g / mol), 0.22 mikron gözenek filtresi ile sterilize edin.
    4. 10x L-lösin ilave: iki kez damıtılmış su, 50 mL ve filtre 0.22 mikron gözenek filtresi ile sterilize: L-leucine (113.17 g / mol leu, E r), 500 mg tartılır.
    5. 10x L-triptofan Ek: iki kez damıtılmış su, 50 mL ve filtre 0.22 mikron gözenek filtresi ile sterilize: L-triptofan (204,23 g / Mol, trp, E r), 100 mg ağırlığında.
    6. SD-Trp-Leu-His-ADE orta ve levhalar (amino asitler olmadan) v maya azot baz w /% 0.67 çözülür ve% 2 ağırlık / hacim, D-glükoz monohidrat: çiftli (M R 198,17 g / Mol) su ve otoklav damıtıldı. agar plakaları için,% 2 w / otoklavlama öncesi hacim agar (mikrobiyolojik kalite) ekleyin.
    7. Seçici plakaları hazırlamak otoklava Sd-Trp-Leu-His-ade ortama amino asit stok çözeltisi 1x ekleyin. levhalar hazırlanırken, ağar eklemeden önce ~ 50 ° C'ye kadar soğutuldu olduğundan emin olunamino asitler. Steril stok çözümleri tutun.
    8. İpad ortamı (: 184,17 g / mol M R) ve / h glukoz monohidrat% 2 w 1 v maya hülasası w /%% 2 w / v pepton (mikrobiyolojik derecesi), ağırlık 0.004 / hac% adenin hemisülfat tuzu çözülür su ve otoklav iki kez damıtılmış. İpad agar plakaları, V agar w / otoklavdan önce% 2 ekleyin. 2x İpad hazırlanması için, yukarıda sözü edilen maddelerin iki katı konsantrasyonlarda kullanmak.
      Not: nedeniyle orta yüksek glukoz konsantrasyonuna (İsteğe bağlı), 2x İpad orta otoklav sonrası koyu kahverengimsi olur. Bir seçenek olarak, bir% 40 (a / h) glukoz stok çözeltisi hazırlanmış ve 0.22 um'lik bir filtreden geçirilerek sterilize edilebilir. Filtre ve sterilize edilen glukoz stok çözeltisi daha sonra steril şartlar altında otoklava 2x İpad (eksik glukoz) ilave edilir. hacim hatalarını önlemek için, 2x İpad 10x glikoz çözeltisi daha sonra ilave edilir akılda tutarak, hazırlıklı olmalıdır. Bu demektir ki, örneğin, yerine 1 L u nedenlef ortamı, sadece 900 ml (glikoz dışındaki tüm bileşenleri içeren) hazırlanmış ve otoklavlanmış ve glukoz, stok çözeltisi 100 ml ilave edilir.
  2. Test kendi kendine aktivasyonu için lityum asetat dolayımlı dönüşüm maya
    1. Streak Saccharomyces cerevisiae muhabir suşu NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( LexAOp) 4-HIS3 ura3: :( LexAOp) 8-lacZ ade2: :( LexAOp) 8-ADE2 GAL4) a dan bir İpad agar plakası üzerinde dondurulmuş gliserol stok ve 30 ° C sıcaklıkta 48 saat için inkübe edilir. Bu plaka koloniler ve İpad ortamı 50 mL inoküle. Maya büyür ve büyümesini izlemek için düzenli olarak OD 600 ölçmek edelim.
    2. Maya son OD 0.5-0.8 600 büyümek edelim. 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj bunların hücreleri pelet ve iki kez damıtılmış, otoklava 2.5 mL su bunları tekrar süspansiyon.
    3. maya süspansiyonu 100 uL altı alikotları hazırlayın ve 50 240 mcLAğ / hac% polietilen glikol 4000 (PEG, E r: 3,500-4,000 g / mol), 1 M lityum asetat dihidrat 36 uL (LiOAc, E r: 102,02 g / mol) ve ağırlık / hacim% 2 25 uL salmon sperm DNA'sı (çözünmüş). iki kez damıtılmış, steril su ile tüm reaktifler hazırlayın.
    4. Aşağıdaki plazmid vektörü DNA, "a" "F" maya süspansiyonu içeren altı şişe etiketleme ekleyin: negatif kontrol: (a) 1,5 efektör (pLexA-N-atp00189 28) ile bir yem plazmid ug, (b) boş av plazmid 1.5 ug pGAD HA 41, (c), boş bir yem vektörünün 1.5 ug pLexA-K 41, ve (d) 1.5 boş yem vektörü pLexA-N ug boş av plazmid pGAD-HA 1.5 ug; Pozitif kontroller: (e) Pozitif kontrol yem plazmid DNA pLexA-p53 41 ve pozitif av plazmid Paktı-larget 41 1.5 ug 1.5 ug; ve öz-aktivasyon testi: (f) ba 1.5 ugo efektör (pLexA-N-atp00189) ve boş av plazmid pGAD-HA 1.5 ug plazmid.
    5. kuvvetli tepkiler karıştırın ve bir su banyosu içinde 42 ° C 'de 45 dakika süre ile inkübe. 700 x g'de 5 dakika boyunca hücreler pelet ve süpernatant atılır. Aşağıdaki seçici plakaları üzerine 50 uL yayıldı (48.44 g / mol NaCI, E r):% 0.9, 250 uL (ağırlık / hacim) sodyum klorür çözeltisi içinde hücrelerin tekrar SD-Trp, Sd-Leu, SD-trp Leu, SD-Trp-Leu-His, ve SD-Trp-Leu-His-ade.
    6. 30 ° C'de 4 gün - 3 inkübe edin. inkübasyonun ilk günün ardından, kurumasını plakaları önlemek için plastik parafin film ile plakaları mühür.
    7. plakalar üzerinde maya büyüme kontrol edin.

6. Test efektör ifade

  1. Efektör zaman N-terminalinde birleştirilir Lex A etikete karşı bir antikor ile Western blot 42 efektör ekspresyonunu testpLexA-N olarak ifade edilmiştir.
    Not: translasyonel erimiş Lex-A etiket ilgilenilen proteinin gerçek ağırlığı yaklaşık 24 kDa ekler düşünün. Western Blot protein büyüklüğünü belirlerken bu önemlidir.

7. Y2H Ekran

  1. Streak pLexA-atp00189 (efektör) taze SD-trp plaka üzerinde NMY51 -transformed ve 2 büyümesine izin - kırmızı koloniler görünene kadar, 30 ° C'de 3 gün.
  2. agar plakasından kırmızı koloni ile küçük çalkalama şişesi içinde SD-Trp ortamının 3 mL inoküle 120 çalkalayarak 30 ° C'de gece boyunca inkübe - 150 rpm.
  3. Bir gecelik kültürün 1 mL bir çalkalama şişesi içinde SD-Trp 'nin 20 mL inoküle ve 8 saat süre ile büyümesine izin.
  4. SD-Trp ortamı eklenerek 600 = 0.2 OD ve başlatıcı kültürü, her 10 mL şişeler çalkalanarak 2x 100 mL aşılamak için kültür ayarlayın. 30 ° C de çalkalanarak bir gece boyunca büyütün.
    Not: maya 6 OD büyümek değil emin olun00> 0.5 ve taze SD-trp ile seyreltin.
  5. OD 600 ve pelet 120 OD 600 ölçün "birimleri." 600 1.2 OD ölçülmüştür, örneğin, 100 ml aşağı spin supernatant atmak ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile bir çalkalama şişesi içinde önceden ısıtılmış 2x İpad 800 mL pelletini.
    1. , 2 ml kısım aşağı Spin süpernatant kaldırmak ve su pelletini. Maya süspansiyonunun OD 600, 0.15 ile 0.2 arasında olduğundan emin olun. Değilse, 2x İpad ile ayarlamak veya gece kültürden daha mayayı ekleyin.
      Not: 2x İpad koyu kahverengi ve OD ölçümü sonuçlarını etkileyebilir. Nedenle, OD belirlemeden önce su içinde maya hücrelerini yeniden askıya almak için gereklidir. orta koyu renklendirme önler aşama 5.1.8 notta tarif edildiği gibi bir seçenek olarak, 2x İpad ayrı glikoz sterilize edilerek hazırlanabilir.
  6. Bir uygulamada kalan maya kültür inküberopriately (2 L'lik bir çalkalama şişesinde 800 ml ya da iki 1 L sallama şişeleri içine 2 x 400 mL bölmek) çalkalama şişesi boyutlu ve 30 ° C, 120 ° inkübe - 150 rpm. 0.6 600 ulaşıldığında bir OD (- 6 saat 4 sürer) kadar her 1.5 saat yaklaşık OD 600 ölçün. Bu arada, bir sonraki aşamada tarif edilen çözüm hazırlanması.
  7. Lityum asetat dolayımlı dönüşüm
    1. su içinde hac somon sperm DNA /% 2 w çözülür ve 100 ° C 'de bir su banyosunda 5 dakika boyunca 500 ul kaynatın. 2 dakika süreyle buz tüpü yerleştirin ve ısıtma adımı tekrarlayın. sonraki kullanıma kadar buz üzerinde DNA tutun.
    2. Aşağıdaki karışımları hazırlayın:
      1. TE / LiOAC karışımı: ve steril, iki kez damıtılmış su 21.84 mL 1 M LiOAC 3.08 mL, 100 mM Tris 3.08 mL / 10 mM EDTA (7.5 pH) karıştırın.
      2. PEG / LiOAc karışımı: ve PEG 4000 (w / v) 50% 33.6 mL 1 M LiOAc 4.2 mL, mM Tris 4.2 mL / 10 mM EDTA (7.5 pH) birleştirin.
    3. Santrifüj 800 ml maya kültürü (OD 600 = 0.6)700 x g'de 5 dakika pelet hücreleri için. Süpernatantı ve steril, iki kez damıtılmış 200 ml su içinde tekrar süspansiyon pelet. 5 dakika boyunca 700 xg'de tekrar pelet hücreleri ve supernatant atın. Not: santrifüj için çeşitli şişe içine gerekli bölmek ise süspansiyon. 7.7.3 sıvı hacimleri. ve 7.7.4. 800 mL 'lik süspansiyon elde bütün pelet bakın.
    4. TE / LiOAc karışımı 16 mL pelletini (adım 7.7.1.1 bakınız); 5 dakika boyunca 700 xg'de aşağı spin ve süpernatant atın. TE / LiOAC karışımı 9.6 mL pelletini.
    5. pGAD-HA-cDNA kütüphanesi vektör 7 ug 12 şişeler,% 2 somon sperm DNA (adım 7.7), 100 uL, ve PEG / LiOAc karışımı 2.5 ml: aşağıdaki reaksiyon uygun şekilde boyutlandırılmış Reaksiyon polipropilen damarlarının karışımları hazırlayın. 12 viallerin her adım 7.10 maya hücre süspansiyonu 600 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın.
    6. Bir su banyosu içinde 30 ° C'de 45 dakika boyunca reaksiyon karışımı inkübeşiddetle her 15 dakikada karıştırın d. Her flakon DMSO 160 mcL ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 42 ° C'de 20 dakika daha karışım inkübe edin.
    7. 5 dakika boyunca 700 xg'de hücreleri topak süpernatantı atmak ve 2x İpad 3 mL her pelletini. Havuzu tüm 100 ml'lik bir çalkalama şişesinde (12 şişeleri 36 mL toplam) hücreleri ile 30 ° C de 90 dakika ve 120 devir için maya inkübe edin.
    8. 700 x g'de 5 dakika boyunca hücreler pelet ve süpernatant atılır. NaCI (ağırlık / hacim) steril% 0.9 4.5 mL pelet yeniden süspanse edin ve 10 ml serolojik pipet yardımıyla dikkatli bir şekilde pipetli ve aşağı iyice karıştırın. 50 uL çekiniz ve on kat 1 kadar 1:10 ila% 0.9 NaCl içinde dilüsyonları hazırlamak: 1,000. SD-Trp-Leu agar içeren 90 mm Petri tabaklarda her seyreltme plaka 100 uL.
    9. SD-trp-leu-onun-ade agar ile 16- x 150 mm çaplı petri üzerinde seyreltilmemiş maya tabanda kalan yayıldı. Kendi kendine aktivasyonunu azaltmak için ortama 3-AT ekleyin. SD-Trp-Leu inkübe30 ° C'de dört gün boyunca üç gün plakalar ve SD-Trp-Leu-His-ade plakalar.
      NOT: seçici plakalar üzerinde görünen klonlar (potansiyel) etkileşim çiftleri ve yem etkileşim ortağı pGAD-HA plazmid kodlama taşırlar.
    10. SD-Trp-Leu seçme plakaları üzerinde farklı seri dilüsyonları kolonileri sayılarak transfeksiyon etkinliğini belirler. çekme ve taze SD-Trp-Leu-His-ADE seçici plakalar üzerine Steril bir pipet ucu ile koloni çizgiler, her bir klon aktarın. 30 ° C'de 24 saat süreyle inkübe edin. Beş pasajların toplam ulaşana kadar her gün bu adımı yineleyin.

Seçici Tabaklar Klonların 8. Analiz

  1. Steril örtünün altındaki her klon için SD-Trp-Leu-His-ade 1 mL bir steril 2-ml tepkime tüpü hazırlayın. sıcak bir iğne ile her bir tüp içine bir delik ve gaz geçirgen mühürleyen bir parça ile deliğe kapsamaktadır. Taze koloni arkadaşı ile her flakon aşılamak 150 rpm'de çalkalanarak, 30 ° C'de 24 saat boyunca inkübe, bir klon (5. geçtikten sonra klonlar kullanımı adım 7.17) için arteryel.
    Not: 4 ° C'de birkaç gün muhafaza plakalardan alınan maya, sıvı bir ortam içinde 24 saat içinde yeterli büyümez, çünkü yeni bir plaka klonları almak önemlidir.
  2. 4.000 x g'de 5 dakika boyunca maya pelet ve süpernatant atılır. (Ilgili plazmid DNA miniprep kiti) uygun tabanda tampon içinde pelletini ve taze bir 2.0 mL reaksiyon tüpüne aktarın. asitle yıkanmış cam boncuklar (425- 600 um çapında), 100 uL ilave edilir ve 5 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın.
  3. İlgili lizis tamponu ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmid hazırlama, mini kiti kullanılarak plazmid saflaştırma ile devam edin. su 50 uL plazmid DNA yıkayın.
  4. av plazmid özgü primer GAL4ADseq bir sıralama reaksiyonunun Aşama 8.3 DNA kullanarakref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3 '.
  5. Tarafından etkileşimi doğrulayın de novo eş-dönüşüm 43, 44 yem ve av vektör. SD-Trp-Leu-His-ade seçme plakaları üzerinde dönüştürülmüş maya seçin.

Sonuçlar

Gerçek Y2H ekranı uygulanmadan önce yem kendi kendine aktivasyonu için test edilmelidir. Bu, boş bir av kütüphane vektörü ile birlikte yem ekspresyon vektörü dönüştürme ve seçici plakalar üzerine büyüme kontrol ederek elde edilir.

Bölüm 5. yem plazmid gezimi tamamlayan ve av S. cerevisiae NMY51 40 ley oksotrofinin plazmid açıklandığı gibi phytoplasmal protein ATP_00189 kendini aktive edici olup olmadığını analiz etmek için, kendi kendine aktivasyon testi yapıldı. Başarılı bir ko-transformasyon, böylece Trp ve Leu yoksun seçici plakalar üzerine büyümesiyle karakterize edilir. yem ve av protein etkileşimi NMY51 ve onun ve ade oksotrofinin bir tamamlama yol açar. etkileşim yokluğunda yem ile kendini etkinleştirme belirirse, maya, onun ve ade eksik seçici plakalar üzerinde yetişir. Güçlü ve zayıf özAktivasyon oluşabilir. yem güçlü kendi kendine aktivasyon Trp-Leu-His-ADE tükenmiş seçme plakaları üzerinde eş-dönüştürülmüş maya büyümesi ile karakterize edilir. Zayıf kendilik aktivasyonu üzerinde büyümesine yol açar trp-leu-onun değil trp-leu-onun-ade tükenmiş seçim plakalar üzerinde. Uygun pozitif kontroller kendine aktivasyon tahlilinin sonuçlarını yorumlamak için vazgeçilmezdir. Bir öz-aktivasyon testinin beklenen sonuçların özeti ve yorumlanması Tablo 1'de verilmiştir ve Şekil 1'de görüntülenmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Bir Y2H Ekran Gösteri Önce bir Bait Bait Öz-aktivasyon Testleri örneği. , Zayıf bir kendi kendine aktive olan bir artı boş bir av Terazi: S. Cerevisiae NMY51 pozitif bir kontrol (AC sol panel) ve (Plex-p53) ve yırtıcı (Paktı-larget) yem etkileşim ile birlikte transforme edilmiş olanry vektörü (orta panel: df) ve kendinden aktive yem artı boş av kütüphane vektörü (sağ panel: gi). , Trp, Leu ve (orta panel: B, E, H): CO-dönüştürülmüş maya Trp ve Leu (a, D, G, üst panel) barındırmayan SD tabakalarına kültürlendi ve Trp, Leu, His ve ade (düşük Panel: c, f, i). yem vektör trp oksotrofinin ve av vektör NMY51 (SD-trp-leu üzerinde büyüme) ve leu oksotrofi tamamlar olarak orta eksik trp ve leu üzerinde seçim, başarılı ko-dönüşüm için olumlu bir kontroldür. yem ve yırtıcı ya da yem kendi kendine aktivasyonu arasındaki etkileşim halinde, NMY51 muhabiri ifadesi açık ve onun ve ade oksotrofi (SD-trp-leu-onun-ade üzerinde büyüme) tamamlar. Zayıf bir kendilik aktivasyonu SD-trp-leu-onun plakaları üzerinde büyüme ile karakterizedir (orta panel, df). Bir yem zayıf kendilik aktivasyonu önce yem analiz etmek için azalmış olmalıdırBir Y2H ekranında, seçici ortama 3-AT ekleyerek örneğin. Amino asit fakirleşme ile gösterilir "-" ilgili ortam adı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

pLexA-N-atp00189 Yok koloniler büyüme yok büyüme yok büyüme yok büyüme yok
Yok pGAD-HA büyüme yok koloniler büyüme yok büyüme yok büyüme yok
pLexA -N Yok koloniler büyüme yok büyüme yok büyüme yok büyüme yok
pLexA -N pGAD-HA koloniler koloniler koloniler büyüme yok büyüme yok
pLexA p53 Paktı-larget koloniler koloniler koloniler koloniler koloniler
pLexA-N-atp00189 pGAD-HA koloniler koloniler koloniler büyüme yok büyüme yok

Tablo 1: Bait Öz aktivasyon Testi Beklenen sonuçlar. S. Cerevisiae NMY51 dönüşüm birlikte dönüştürülmüş yem ve av özelliklerine göre seçici ortam üzerinde farklı büyüme elde edilir. seçici plakalar üzerine büyüme 30 ° C de 72 saat inkübe edildikten sonra, farklı vektör kombinasyonları (AF) transformasyonu sonra değerlendirildi. Zayıf kendilik aktivasyonu üzerinde maya büyüme ile karakterizedir SD-trp-leu-onun ve SD-trp-leu-onun-ade seçim plat üzerinde büyüme ile güçlü kendilik aktivasyonubir etkileşim ortağının yokluğunda es. pLexA-N kodlanmış phytoplasmal efektör ATP_00189 NMY51 kendisinin ve ade yokluğunda büyüme dönüştürülmüş yem vektörünün yetersizlik ile karakterize kendine aktivasyonu, sergilemez.

yem bağlı olarak, bir Y2H ekran seçici plakalar üzerinde büyüyen çok sayıda maya klonları elde edebilirsiniz. Tüm klonlar, analiz ve olası işten kontrol edilmelidir. normalleştirilmiş cDNA kütüphanesi kullanılmıştır bile, bir uygulayıcı farklı klonlar temsil edilir çok muhtemeldir. Kütüphane klonlama tekniğe bağlı olarak, tam genin sadece fragmanları bir av vektörlerine eklenir da mümkündür. (CDNA'dan) yükseltmek ve uygulayıcının tam uzunlukta geni alt klon ve bire-bir Y2H analizi (Şekil 2) bir etkileşim test etmek de novo böylece tavsiye edilir.

figure-results-2
Şekil 2: Bir Y2H Deney Yem ve Prey arasında bir etkileşim örneği. Bir maya iki-hibrid (Y2H) Ekran uygulandı ve pozitif uygulayıcı klonlardan plazmidler saflaştırılmıştır. Av vektör dizisi ve Malus x domestica konak etkileşim ortakları MdTCP24 ve MdTCP25 tespit edilmiştir. Bir negatif kontrol MdTCP34 (bunlar için herhangi bir uygulayıcı Y2H kitaplık taraması tespit edilmiştir) ve paralel alt-klonlanmıştır. Tam uzunluktaki genleri av vektörü (ko-cistronically aktivasyon alanı AD eksprese) içine alt klonlanmış, elma cDNA'dan amplifiye edildi de novo DNA bağlama sahası (BD) birleştirilmiş bakteriyel efektör ATP_00189 ifade yem vektörü ile ko-transformasyona. Bu rakam, 28 alınır. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Tartışma

Y2H ekranında potansiyel efektör protein, farklı hipotetik etkileşen proteinlerin (basamak 7) benzer olan eksprese eş. Her büyüyen maya klonu yem ama (potansiyel olarak) farklı interaktör içerir. etkileşen proteinler av plazmid içine klonlanır bir cDNA kütüphanesinden kodlanır. yem ve av, bir maya transkripsiyon faktörünün bir kısmını, her eş-cistronically kodu plazmidler. yem (efektör) ve av plasmidle kodlanmış uygulayıcının arasında fiziksel bir etkileşim halinde, iki transkripsiyon faktör parçaları (DNA bağlama domeni ve aktivasyon alanı) birleşirler ve raportör gen ekspresyonu indüklenir. maya histidine- ve adenin tükenmiş SD seçimi plakalar üzerinde büyümek mümkün. av cDNA kütüphanesinin tür filtrelenmiş efektör bağlıdır ve buna göre seçilmelidir. av ve yem vektörü olarak maya suşu, uyumlu olmalıdır. Bu ekranda, bir LexA DNA etki alanı ve Gal4 aktivasyon Domai bağlayıcın uyumludur, Maya transkripsiyon faktörü birimler olarak kullanılmıştır. cDNA kütüphanesi tek tek özel elde ticari olarak yapılan ya da inşa edilebilir. cDNA av kütüphanenin hazırlanması Bu protokolün bir parçası değildir. Bu protokol, Malus domestica X yaprakların RNA'dan İnşası normalleştirilmiş cDNA kütüphanesi kullanıldı ve pGAD-HA 41 içine klonlandı. Maya suşu -expressing efektör (yem) av kütüphanesi ile transforme edildi ve klonlar histidine- ve adenin tükenmiş SD seçme plakaları üzerinde seçilir. Maya kolonilerden plazmid DNA elde etmek için, bakteriler için bir sütun-bazlı DNA plazmid mini kiti maya hücrelerinin yok (adım 8) geliştirmek için, cam boncuklar kullanılarak bir mekanik aksama aşama ile birlikte tavsiye edilmektedir. Bu plazmid saflaştırma olarak, yem ve av vektörü nispeten düşük konsantrasyonlarda eş zamanlı olarak saflaştırılabilir olacaktır. Bununla birlikte, plasmid DNA miktarı dizi wit ile etkileşimi ortak tanımlamak için yeterlidirhout önce plazmid yayılma (adım 8.4). Bir alternatif olarak, adım 8.4 içinde saflaştırılmış DNA kompetan E. coli 'ye transforme edilebilir (ör pGAD-HA halinde ampisilin) av vektör aracılı antibiyotik direnci seçilebilir. Seçilen E. koloniler yalnızca pGAD-HA Kitaplık plasmidi taşıyan coli ve yüksek verimli plazmid saflaştırma, bu klonlar ile gerçekleştirilebilir.

pLexA N ve pGAD-HA konstruktlarının başarılı dönüşüm NMY51 triptofan ve lösin oksotrofi tamamlar. efektör ve bir proteini (pGAD-HA kodlanmış) arasında bir etkileşim NMY51 suşları raportör sistemin aktivasyonuna yol açar. kendi kendine aktivasyon durumunda, NMY51 bağlı NMY51 raportör sistemi istenmeyen aktivasyonuna pGAD-HA Trp-Leu-His-ade eksik seçici plakalar üzerinde yetişen boş kütüphanesinin vektör ile kombinasyon halinde pLexA-N eksprese efektör ile transforme 40. kendi kendine aktivasyon W olabilirEAK ve yokluğunda oluşabilecek Trp-Leu-His ya da etkinleştirme güçlü ve Trp-Leu-His-ade plakalar 41 büyüme ile karakterize edilebilir. Kendinden aktivasyon gerçek Y2H ekranında yanlış pozitif klonların büyük bir arka plan neden olabilir. Bunu önlemek için, yem ile kendi kendine aktivasyon testi olan efektör-eksprese eden vektör ko-transforme edilmiş boş kütüphanesinin vektörü ile, yapılmalıdır. Bu deneysel ortamda, raportör gen sentezleme neden olmamalıdır. Kendi kendine aktivasyon (yani, seçici plakalar üzerine büyüme) test görülebiliyorsa, ortam 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT) farklı konsantrasyonları ile desteklenebilir. 3-AT imidazoleglycerol fosfat dehidrataz (HIS3), histidin biyosentezi 46 boyunca önemli bir enzim olan bir inhibitördür. 3-AT ile takviyesi, Y2H ekranlarında 47 sırasında kendini aktivasyonu zayıf etkilerini azaltabilir48. 3-AT farklı konsantrasyonları test edilmelidir. Bu protokol, 1-40 mM 3-kullanılmıştır. kendi kendine aktivasyon baskıya neden en düşük konsantrasyon, daha sonra Y2H ekranında kullanılmalıdır. ko-transformasyon, SD-Trp-Leu plakalar klon yeterli sayıda içeren self-aktivasyon tahlili seçici plakalar sadece değerlendirilebilir. bir gösterge ≥ olarak 90 mm (çap) bir petri 500 koloni yeterlidir. Tam transfeksiyon etkinliğini belirlemek için, ko-transforme edilmiş maya seri dilüsyonları hazırlamak ve SD-Trp-Leu plakaları üzerine yayılır önerilir.

Kendi kendine aktivasyonunu önlemek için, efektör pLexA-C, proteinin C-ucuna LexA etiketi sigortalar bir yem sentezleme vektörü içine klonlanabilir. Lex-A etiketinin oryantasyon kendini aktivasyonunu 24 azaltabilir. Bununla birlikte, her durumda azaltılması ya da kendi kendine aktivasyonunu ortadan kaldırmak mümkün değildir. oluşumukırmızı veya kırmızımsı koloniler zayıf ya da yanlış pozitif etkileşim gösterir. Bu, bir protein-protein etkileşimi için söz konusu olduğunda NMY51 bölgesinin ade2 raportör gen sadece aktif olan bir dönüş blokları bu maya kökü 40 kırmızı boya birikimi. Güçlü inter aktörlerin taşıyan klonlar beyazdı sırasında başka bir etkileşim olmaması durumunda, NMY51, kırmızımsı. Seçim plakalar üzerinde koloni renginin gözlem ve böylece söz konusu koloniler true-ya da yanlış pozitif interaktörler olup olmadığını yargılamak başka bir önemli ipucu sağlar.

Uyum ya da yem niteliği ve etkileşim özellikleri açısından belirli tahlil ayarlarını değiştirmek için sonunda gereklidir. Artık, iyileştirmeler ve ortak Y2H türev bir dizi teknik, farklı ev sahibi sistemlerinde oldukça zor protein etkileşimleri analiz için kurulmuştur. Stynen ve arkadaşları tarafından bir inceleme. 49 adreslerind Y2H, onun iyileştirmeler ve uyarlamalar farklı yönlerini açıklar ve böylece uygun etkileşim deneyi nasıl seçileceği hakkında yararlı bilgiler sağlar.

Y2H ekranlar ve türetilmiş teknikleri yaygın ikili protein etkileşimleri belirlenmesi gerekli olduğu her yerde farklı araştırma alanlarında, kullanılır hale gelmiştir. Kritik kontrolleri, yem kendi kendine aktivasyon testi ve tespit etkileşen proteinlerin bire bir tekrar dönüşüm olarak gerçekleştirilse bile, Y2H yanlış sonuçlar 26, 50, 51 oluşturmak için müsaittir. bir model olarak maya tüm etkileşim çalışmaları için uygun değildir. Maya mutlaka her protein 24 için uygun post-translasyonel modifikasyonu ve katlama destekleyen bir hücresel ortam teşkil etmez. Ayrıca, Y2H ortamda proteinler aşırı ifade edilir ve ifade kontrol değildirdoğal promoter tarafından yol açtı. Y2H mutlaka doğal hücre içi hedef değil çekirdeği, proteinli etkileşim ortakları zorlar. etkileşim yerli hücresel koşullar dolayısıyla maya tarafından yansıtılması değil ve-yanlış negatif ya da yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. En Y2H seçici bir madde olarak maya oksotrofi tamamlama dayanmaktadır. Bu besin seçimi yüksek hassasiyet ile karakterize, ancak diğer karşılaştırıldığında azalmış seçicilik pahasına (örneğin, kromojenik raportör) 49 deneyleri edilir. Azaltılamaz kendine aktivasyon (yukarıya bakınız) veya başka sınırlamalar belirli efektör için oluşursa, Y2H uygun bir deney, 25 değildir. Tablo 1 ve Şekil 1 'de, kendi kendine aktivasyon testinde beklenen sonuçlar verilmiştir. Gerçek etkileşimler (yani, yanlış negatif) yokluğu protein zehirlenmesi, yanlış çeviri proteini neden olabiliretkileşim 24 için gerekli işleme, etkileşim sterik engel, av kütüphanede az temsil edilen etkileşim ortakları, yem membran lokalizasyonu, ya da eksik parçalar.

Bu de novo önerilir pGAD-HA alt-klonlanmıştır, cDNA'dan tanımlanır etkileşim proteininin tam uzunlukta genini çoğaltmak ve üretilen pGAD-HA içine inşa dönüştürerek bire bir etkileşim deneyi gerçekleştirmek yem eksprese NMY51 süzün. av kitaplığında gözlenen uygulayıcı sadece daha büyük bir proteinin bir parçası olabilir, çünkü bu gereklidir. Ancak, ilgili tam uzunlukta geni için bilgi önemli genomik ve transkriptomik dizi verileri mevcut ise sadece erişilebilir. Burada tarif edilen kendi kendine aktivasyon deneyi için transformasyon protokolü, bire-bir tahlil için uygulanabilir ve yem ve uygulayıcının arasındaki etkileşim tekrar üretilebilir olmalıdır.

bir Y2H ekranında tanımlanan etkileşimler her zaman başka bir bağımsız tekniği ile teyit edilmesi gerekir. Bu bağımsız bir teknik, gerçek protein-protein etkileşimi, doğal ortamda daha yakın olması gerekir. Phytoplasmal efektör ATP_00189 durumunda, Malus domestica X TCP transkripsiyon faktörleri ile etkileşimi, Nicotiana benthamiana bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile planta doğrulanmıştır 28 (bu protokol parçası değil) protoplastlannda. efektör protein ATP_00189 bitki patojeni P. mali'nin türetilmiştir. Planta BiFC böylece Malus x domestica transkripsiyon faktörleri ile ATP_00189 etkileşimlerini doğrulamak için seçildi Daha önce Y2H 28 tespit edilmiştir. BiFC raportör sistemi 52. Ayrıca, içinde planta ifadesi ve modifikasyon makine taklit onun bitki konak bitki bakteriyel efektör arasındaki doğal etkileşim ortamı. Bununla birlikte, BIFC kullanarak küresel ekran mümkün değildir.

dikkatle ele alınması gereken protokol çeşitli adımlar vardır. Çevrede (basamak 4) geni amplifiye, primerler, bitki DNA'ya bağlanan ekarte etmek önemlidir. Bu nedenle, enfekte olmayan bitkilerden DNA, bir negatif kontrol olarak dahil edilmesi gerekir. ilgi konusu genin dizisinin ucun doğrudan klonlanması için kullanılan, EcoRI ve SalI kısıtlama alanları içermemelidir. dizisi bu siteleri içeren olursa, klonlama için farklı sınırlama enzimleri seçilmelidir. Maya dönüşüm Bu protokol sırasında merkezi bir yöntemdir. Transfeksiyon verimi maya hücrelerinin yetkinlik, bunların canlılığı, büyümesi durumu ve transfeksiyon Reaktifler kalitesine bağlıdırent 53, 54. Önerilen protokolü için, son derece dönüşümleri yaparken (4 ° C'de muhafaza) iki hafta daha eski olmayan yeni plakalardan mayayı kullanılması tavsiye edilir. Seçici sıvı kültürler bir agar plakalarından koloniler ile aşılanır, çoğu zaman, dönüştürülmüş maya büyümesi geciktirilir. Plaka doğrudan mayayı kullanmak gerçek deneyler için bir aşı gibi bir sıvı starter kültür kullanımı ve de yararlıdır. Düşük verimlilik, belirli av proteinleri (potansiyel interaktörler) underrepresentation yol açabilir yem-ifade mayaya av transfecting ve böylece bütün ekranı çarpık zaman. Bu protokolde, Y2H içinde ~ 150,000 cfu / ug transfekte DNA maya transfeksiyon verimliliği iyi çalıştı.

Y2H tekniğinin kusurları ve dezavantajları bilmek ve eleştirel ve uygun bir şekilde sonuçları yorumlama Corr çizim için vazgeçilmezdirEKT sonuçlar. Y2H deneyleri ve türevleri yıllardır kullanılmaktadır ve farklı yem özelliklerine göre birçok yenilik ve uyarlamalar geçirmiş, etkileşim hücre içi lokalizasyonu, etkileşim için gerekli olabilecek beklenen bağlama partnerleri ve diğer faktörler (bkz Y3H 55, 56, 57). Son zamanlarda, bir dizi-bazlı Y2H ekranları ile av 58 milyonlarca karşı çok sayıda yemler otomatik yüksek verimli analizlere imkan vermek geliştirilmiştir. geleceği muhtemelen farklı araştırma alanlarda karmaşık sinyal yollarının ve interactomes açıklanması için izin vermek için bu deneyde otomasyon ve yüksek verimli yaklaşımları yer alır.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Biz yazının redaksiyon için teknik destek için Dualsystems Biotech AG ve Julia Strobl gelen Laimburg Araştırma Merkezi ve Mirelle Borges Dias Schnetzer Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl Margot Raffeiner ve Florian Senoner teşekkür ederiz. Bu çalışma APPL2.0 projesinin bir parçası olarak gerçekleştirildi ve kısmen Bozen / Bolzano, İtalya Özerk İli ve Güney Tirol Apple Konsorsiyumu tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Setiltrimetilamonyum bromür (CTAB)DNA hazırlığı içinaplikitA6284
Trishidroksimetilaminometan (Tris)Ortam ve tampon içinA2264Applichem
Ortam ve tampon içinSodyum klorür (NaCl)ApplichemA2942
Etilendiamintetraasetik asit Disodyum tuzu (NaEDTA)aplicanA2937
DNA hazırlığı içinN-Lauroylsarcosin sodyum tuzuApplichemA7402
amonyum asetat ve nbsp;DNA hazırlığı içinSigma-Aldrich (Fluka)9688
hazırlığı için2-merkaptoetanolApplichemA1108
hazırlığı içinİzopropanol (2-Propanol)ApplichemA3928
DNASigma-Aldrich (Fluka)51976DNA hazırlığı
için RNAse Applichem A2760Kloroform: DNA hazırlama için İzoamil 24: 1ApplichemA1935
Düzeltme Polimeraz (örn. iProof)PCR içinBio-Rad203433
EcoRIThermo ScientificER0271klonlama için
SalIThermo ScientificER0641Klonlama için
Sütun Tabanlı DNA Saflaştırma Kiti (örn. QIAquick)Klonlama içinQiagen28104
Kanamisin SülfatUygulaması içinA1493mikrobiyolojik seçim için
3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT)Sigma-AldrichA8056kendi kendine aktivasyon testi için
L-Arginin Monohidroklorür ve nbsp;Maya kültürü içinApplichemA3680
L-İzolösin Maya kültürü içinApplichemA3642
L-lizin Monohidrat Maya kültürü içinApplichemA3448
L-Metionin Maya kültürü içinApplichemA3897
L-Fenilalanin & nbsp;Maya kültürü içinApplichemA3464
L-Treonin Maya kültürü içinApplichemA3946
L-Tirozin Maya kültürü içinApplichemA3401
L-UrracileMaya kültürü içinApplichemA0667
L-Valin Maya kültürü içinApplichemA3406
L-Adenin Hemisülfat Tuzu Maya kültürü 0.22ApplichemA1596
; m Gözenek FiltresiSteril filtrasyon içinSartorius16541
L-Histidin MonohidroklorürMaya kültürü içinApplichemA3719
L-Lösin Maya kültürü içinApplichemA3496
L-Triptofan Maya kültürü içinApplichemA3410
Maya Azot Bazı Maya kültürü içinSigma-Aldrich51483
D-Glikoz Monohidrat Maya kültürü içinApplichemA1349
Maya ve bakteri kültürü içinAgarFisher ScientificBP2641-1
Maya kültürü içinPeptonApplichemA2208
Polietilen Glikol 4000 (PEG)Maya dönüşümü içinApplichemA1249
Lityum Asetat Dihidrat (LiOAc)ApplichemA3478
Somon Sperm DNA'sı Maya dönüşümü içinApplichemA2159
Lex-A etiketine karşı antikor (örn. Anti-LexA DNA bağlanma bölgesi)Western blotMillipore06-719
Plazmid Miniprep kiti (örn. GenElute Plazmid Miniprep Kiti)Maya ve bakterilerden plazmit saflaştırması içinSigma-AldrichPLN350
Asitle Yıkanmış Cam BoncuklarSigma-AldrichMayadan plazmid saflaştırması içinG8772
Mikrobiyolojik seçim içinAmpisilin Sodyum TuzuUygulamasıA0839
Maya kültürü içinMaya ÖzüUygulamasıA1552
Vakum yoğunlaştırıcı santrifüj (örn. Yoğunlaştırıcı 5301)DNA hazırlama içinEppendorfZ368245 (Sigma)
Yem vektörü (örn. pLexA-N)Y2HDualsystemsP01004
Av vektörü (örn. pGAD-HA)Y2HDualsystemsP01004
Av vektörünü kontrol edin (örn pLexA-p53)Y2H içinDualsystemsP01004
Kontrol yem vektörü (örn. pACT-largeT)Y2H
için Dualsystems P01004Elektroyetkin E. coli (örn. MegaX DH10B T1R Electrocomp Hücreleri)Klonlama içininvitrojenC640003
Maya raportör suşu (NMY51: MATahis3 & Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, örn. NMY51)Y2HDualsystemsP01004
Plastik parafin filmi (örn Mayave bakteri kültürü içinSigma-AldrichP7793-1EA
Gaz geçirgen kapatıcı (örn. BREATHseal)Greiner676 051kültürü için
PCR Döngüleyici (örn. T100 Termal Döngüleyici)PCRBio-Rad
(örn. CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi)Kantitatif PCRMikrosantrifüjBio-Rad
1855195 (örn Santrifüj 5417 R)Eppendorf5417 Rgenel laboratuvar ekipmanları
Santrifüj (örn. Santrifüj 5804 R)Eppendorf5804 Rgenel laboratuvar ekipmanları
Nükleaz içermeyen su (DNAse-free, RNAse-free, Proteaz-free)5PCRve DNA çalışmaları için2500010
hazırlama içinScalpellSwann-Morton0301
Steril filtre (0.22 & mikro; m; Polietersülfon)VWR-International514-0073 (Avrupa Katalog numarası)maya ve bakteri kültürü için
Petri kapları & Oslash; 90 mm Greiner Bio-One633180maya ve bakteri kültürü için
Petri kapları & Oslash; 150 mm Maya kültürü içinGreiner Bio-One639161
Fotometre (örn. Biyofotometre)kültürü içinEppendorf550507804
Fotometre KüvetleriMaya kültürü içinMarka759015
Su Banyosu (örn. Su Banyosu Memmert WB7)Maya dönüşümü içinMemmertWB7
Western Blot EkipmanlarıProtein tespiti içinBio-Radçeşitli
dNTP'lerShaker
(Erlenmeyer) Şişeleri (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) ve nefes alabilen pamuk tıkaçları (örn. Duran Erlenmeyer dar boyunlu şişeler)Sigma AldrichZ232793 Z232858,ve bakteri kültürü için
(örn. GFL 3031)GFLMaya ve bakteri kültürü için3031
İnkübatörBağlayıcıKB 53 (E3.1)maya ve bakteri kültürü için
Buz Yapıcı (örn. Buz Yapıcı IF 825)OmniwashIF 825genel laboratuvar ekipmanı
0,2 mL, 1,5 mL ve 2,0 mL Reaksiyon Şişeleri (Polipropilen)Eppendorf0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)Genel Laboratuvar Ekipmanları
Pipetler ve tek kullanımlık pipet Uçları (farklı hacim: 10 - 1.000 &mikro; L)Eppendorfçeşitligenel laboratuvar ekipmanları
YayıcıSigma-AldrichSPR-L-S01ve bakteri kültürü için
Vorteks çalkalayıcı (örn MS 3 Minishaker)IKA3617000genel laboratuvar ekipmanları
T4-LigaseThermo FisherEL0011klonlama için
Buzdolabı (4 > C) (örn. Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr81.767.580.4genel laboratuvar ekipmanı
Dondurucu (-20 derece; C) (örn. Liebherr Comfort Professional G5216)LiebherrG5216genel laboratuvar ekipmanı
Dereceli Silindir (örn. Marka)Sigma AldrichZ327352; Z327417; Z327441   Genel Laboratuvar Ekipmanları
Serolojik Pipetler (örn. Fisherbrand)ve bakteri kültürü içinThermo FisherS55701
Mekanik Pipetleyici (örn. Pipetboy acu 2)Integra-Biosciences155000genel laboratuvar ekipmanları
Elektroporasyon için Küvetler (1 mm)dönüşümü
için Moleküler Biyo Ürünler 5510-11Elektroporatör (örn. Eporator)Bakteri dönüşümü içinEppendorf4309000019
Jel ve Blot görüntüleme sistemi (örn. ChemiDoc MP Sistemi)Bio-Rad1708280genel laboratuvar ekipmanları
Konik santrifüj tüpleri (Polipropilen) (50 mL)VWR-International 525-0403 (Avrupa Katalog numarası)genel laboratuvar ekipmanları
Konik santrifüj tüpleri (Polipropilen) (13 mL)BD Falcon352096genel laboratuvar ekipmanları
Dithiothreitol (DTT; 1 M)Thermo ScientificP2325ligasyon için
adenozin trifosfat (ATP, örn. ATP Çözeltisi (10 mM))Ambion AM8110G (Thermo Scientific tarafından dağıtılan)ligasyon için
histidin, lösin, triptofan ve adenin içermeyen bırakma karışımı (DO, örn. Maya Sentetik Bırakma Ortamı Takviyeleri)Sigma-AldrichY2021 Sigma Maya kültürü için (hazır karışım)
A2264Ortam ve tampon için DNA DNA hazırlığı için Etanol , , , , ve mikro için : , , , Maya dönüşümü için için için için için maya kantitatif PCR Döngüleyici için 1861096 için Prime DNA Maya klonlamak için 5Prime 2201210 maya Z232866 maya Maya Bakteri

Kaynaklar

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22(2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835(2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423(2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fitoplazma Efekt rProtein protein Etkile imiDNA Safla t rmaEfekt r Gen AmplifikasyonuYem Vekt r KlonlamaMaya TransformasyonuSelektif EkimKoloni PasajPlazmit Safla t rma

İlgili makaleler