Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Özet

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Özet

Büyük memeli pancreata gelen perfüzyon tabanlı adacık izolasyon protokolleri iyi bilinmektedir. Bu tür protokoller kolayca nedeniyle hazır kollajenaz enjeksiyonu ve sonraki doku perfüzyon için izin veren pankreas kanalının büyüklüğü birçok laboratuvarlarda yapılır. perfüzyon kolayca küçük pancreata başarılabilir değil çünkü aksine, küçük pancreata adacık izolasyonu, yenidoğan farelerin olduğu gibi, zordur. Burada görsel yardımı ile yeni doğan farelerin adacıklar önemli sayıda kurtarır ayrıntılı basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taze parçalara Bütün pankreastan mikrosantrifüj tüpleri içinde, 37 ° C 'de Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözülmüş 0.5 mg / ml kollajenaz IV ile sindirildi. Tüpler doku dağılmasına yardımcı olması için düzenli olarak aday bulundu. doku en fazla 1 mm civarında küçük kümelere dağıtılmıştır zaman lizatları% 10 cenin sığır serumu (FBS) kültür ortamı ile dört kez yıkanmıştır. Adacık kümeler,tanınabilir asiner dokuların yoksun, daha sonra stereoskopla diseksiyon altında elde edilebilir. Yeni doğan fare pankreas başına büyük boyutlu adacıklar 80 küçük - Bu yöntem 20 kurtarır. Bu adacık insülin sekresyonu, gen ekspresyonu ve kültür dahil olmak üzere en akla alt deneyleri için uygundur. insülin salgılanması tahlilinin bir örneği, yalıtım işlemi doğrulamak için sunulmuştur. genetik altyapı ve sindirim derecesi verimi belirleyen en büyük faktörlerdir. Endokrin-ekzokrin izolasyon yardımcıları gibi yüksek aktiviteli taze hazırlanmış kolagenaz çözeltisi tercih edilir. Yıkama tüm çözümler ve fetal sığır serumu katyonların mevcudiyeti [Kalsiyum (Ca2 ⁺⁾ ve magnezyum (Mg ^{+ 2)]} / çekme ortamı, uygun bir bütünlük adacık iyi bir verim için gerekli değildir. iyi kontrast ve büyütme ile bir diseksiyon kapsamı da yardımcı olacaktır.

Giriş

Saf pankreas adacıklarının izole edilmesi, beta hücrelerinin glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunun (GSIS) tahlili ve kadavra donörlerinden adacık nakli için gereklidir ^1-3. Adacık hücreleri ^{4, 5'te} endokrin gen ekspresyonunun oluşturulması da gereklidir. Bu amaçla, pankreas adacıklarının büyük pankreatadan izole edilmesine izin vermek için ayrıntılı protokoller oluşturulmuştur (⁶ ve buradaki referanslar). Bu yöntemler, asinarı adacık dokularından ayırmak için enzimatik perfüzyona, gradyan ayırma ve elle toplama ile birleştirilir. Bu nedenle, büyük pankreastan adacık izolasyonu çoğu laboratuvarda kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Öte yandan, perfüze edilemeyecek kadar küçük olan pankreatadan adacıkların izolasyonuna izin vermek için ayrıntılı bir adım adım protokol mevcut değildir.

Neonatal adacıkların gen ekspresyonunu ve fonksiyonunu incelemek önemlidir. Yenidoğan adacıkları insülin salgılama ve proliferasyon kabiliyeti açısından erişkinlerden farklı özelliklere sahiptir ^{7, 8}. Bununla birlikte, yeni doğan pankreasın küçük boyutu nedeniyle adacıkları yeni doğan hayvanlardan, özellikle farelerden izole etmek zordur. Boyut, pankreas kanalından kollajenaz enjekte edildiğinde olağan perfüzyon sürecini önler. Gerçekten de, birkaç makale, enzim veya enzim destekli olmayan izolasyon prosedürleri ^{7, 9, 10} ile bu hatlar boyunca çalışmalar sunmuştur. Bununla birlikte, görsel yardımla adacık izolasyon sürecinin ayrıntılı açıklaması ^{7, 9'dan} yoksundur ve bu da çoğu araştırmacının benzer çalışmaları gerçekleştirmesini zorlaştırır.

Yenidoğan farelerden yüksek kaliteli adacıklar veren birkaç farklı koşulu araştırdık. Burada, araştırmacıların adacık izolasyon sürecindeki temel detayları öğrenmelerine yardımcı olması beklenen bir protokol sunuyoruz. Bu protokol iki haftalık olana kadar fare pankreaslarına uygulanabilir, daha sonra rutin adacık izolasyonu için perfüzyon yapılabilir. Adacıklar doğrudan insülin sekresyonu ve gen ekspresyonu tahlilleri için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan kullanım protokolü M belirtilen prosedürleri takip / Gu için Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış / 181 11. CD1 veya CBA / BL6 fareler ticari satıcılardan satın alınan ve neonatal fareler elde etmek için Vanderbilt hayvan tesisinde geçti bulundu.

Farelerin 1. Hazırlık, Stok Çözümleri ve Ekipmanları

1. Fare çapraz için: fare çapraz kurmak ve deneysel planlama yardımcı olmak için takmayı tarihleri ​​kaydedin. CD1 fareler genellikle çiftleşme gün sonra 19 civarında doğurur. Kullanım CD1 veya CBA / BL6 sırasıyla CD1 veya CBA / BL6 yenidoğan elde geçer. İki çizgi arasındaki ara-CD1 kadın ve CBA / BL6 erkek kullanmaktadır.
2. kollajenaz stokunun için: yüksek hassasiyetli terazi ile 200 mg kollajenaz Tip IV tartın. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. Ca 40 mi HBSS içinde çözündürülür ^{2 +} / Mg2 ⁺ (sırasıyla 1.26 ve 0.5 mM), 5 mg / ml stok çözelti yapmak için.
   1. için kollajenaz izinhafifçe çalkalanarak ~ 30 dakika boyunca çözülür. Kısım ve en az bir yıl boyunca açık kalır stok olarak -20 ° C'de, donmuş çözelti tutun.
3. diseksiyon ve adacık toplama için cımbız, makas ve P20 ipuçları birkaç çift sterilize etmek otoklavlayın.
4. 1 M glükoz stoğu için: 50 ml santrifüj tüpüne 9 g glukoz ağırlık glukoz eritmek için 50 ml RPMI 1640 ortamı eklenir. kullanılana kadar 4 ° C tutun, ama en fazla 6 aydır.

2. Çalışma Çözümleri

NOT: adacık izolasyonu gün, aşağıdaki reaktifler hazırlayın.

1. kollajenaz tip IV çalışma çözümü için: çözülme ve buz üzerinde kollajenaz stok sulandırmak. Her 1.7 ml mikrofüj tüpe 0.15 ml stok koyun. Ca ²⁺ / Mg ²⁺ ile 1.35 ml HBSS ekleyin. tüpü 5 kez ters çevirin. 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın.
   1. bir mikrosantrifüj içinde 3 dakika yüksek hızda dönerler. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. kullanılıncaya kadar buz üzerinde bırakın. çözünmez enkaz ile tüp atın.
2. desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı için 500 ml RPMI 1640 ortamı içine 2.5 mL 1 M glükoz, FBS 50 ml ısı ve 5 mL 100X Pen-Strep suyunu ekleyin. kullanılana kadar buz üzerinde bırakın.

3. Pankreas İzolasyon ve Sindirim

1. onaylanmış protokollere göre dekapitasyon izofluran ile yenidoğan, euthanize.
2. karnı yukarı bakacak şekilde fareyi yatırın. Sterilizasyon% 70 etanol ile püskürtülür.
3. Cımbız ile karın cildi yukarı kaldırın ve göğüs kafesine genital bölgede, bir makas ile orta hat boyunca uzunlamasına deri ve kas katmanları kesti. Bu, tüm iç organlarını açığa karın boşluğuna açılır.
4. cımbız ile 100 cm çanak tüm iç organları aktarın. Mide ve dalak ve duodenum ¹¹ yapışan bir ventral kısmına yapışan bir sırt bölümü ile dağınık-organdır pankreas, bulun.
5. organları batırmak için çanak içine HBSS ekleyin. çözümde, pankreas dokuları artık duodenum, mide, dalak veya sarılmak. Çünkü onun tipik beyaz renkli bir diseksiyon kapsamında kolayca tanınabilir. HBSS ile yeni bir 60 mm çanak uzak çevresindeki doku ve transfer pankreas dokuları soymak için bir cımbız kullanın.
6. Herhangi boyutları arasında 5 mm'den küçük parçalar halinde bir makas ile her pankreas kesin. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer edin. En fazla beş pankreata (P7 daha genç) bir tüp içinde sindirilebilir. P8-P16 fareler için, pankreas başına bir tüp kullanın.
7. Her bir tüpe 1 mL kolajenaz çalışma çözeltisi (her bir P1-P7 pankreas 0.2 mL, her P8-P16 pankreasta 0.5 mL kullanın.) - 0.5 ekleyin. en fazla 15 dakika süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde tüpü terk. tüpü iki kez her dakika çevirin.
8. ~ 5 dakika sonra, pankreas dokusu sindirim durumunu izlemek için tüp dokunun. pankreatik çoğu kadar sindirim işlemine devamDoku çapı <2 mm kadar parçalanmış hücre kümeleri, görünür. lizat, normal asiner hücre autolysis nedeniyle bulanık görünecektir.

4. Lizat Yıkama

1. Bir mikrosantrifüj 10 saniye süreyle 500 xg'de lizat dönerler. Bir P1,000 Pipetman süpernatant tabakası çıkarın. süpernatant bulanık ama hücre kümeleri yoksun görünmelidir. hızlı nedeniyle bazı yapışkan DNA varlığı altındaki doku parçaları uzak aspire olabilir, aspirasyon kullanmayın.
2. 1 ml RPMI 1640 tam ortam ekleyin. parçalanmış lizat tekrar süspansiyon tüp hafifçe dokunun. yukarı ters çevirin ve 10 kez aşağı. Adımı tekrarlayın 4.1.
3. Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha ya da süpernatant berrak görünene kadar. 1 ml tam RPMI 1640 medya içinde yıkanmış pankreas parçaları yeniden askıya.

5. Adacık İzolasyonu

NOT: pancreata küçük sayılar için, doğrudan el toplama aşağıdaki gibi (5.1) adacık isol için kullanılabilirtirme. Pankreatanın büyük sayılar için (> 6), 5.2 özetlenen yöntemi tercih edilir.

1. Doğrudan el toplama:
   1. 60 mm çanak adım 4.3 lizat aktarın. 5 ml tam RPMI 1640 ortam ekleyin. bir mikroskop altında getirin.
   2. mikroskop parlak alan aydınlatma ayarlayın. ışık yoğunluğunu maksimum güç ~% 50 olarak ayarlayın. Bu durumda, adacıklar asiner hücreler koyu düzensiz şekilli kümeler ise (Şekil 1A) gibi hafif pembe kümeleri görünür. ~ 50X (objektif gücünü ve göz parçayı birleştirerek) bir büyütme görselleştirme adacıklar en iyi yolu ve toplamak için aynı anda pipetlemeyin ucu açıklığı sunmak için tavsiye edilir.
   3. asiner kümeleri kaçınarak bir P20 pipet ile adacıklar toplayın. Dağıtın RPMI tam medya (Şekil 1B) ile yeni bir 60 mm çanak kesirler adacıklar zenginleştirilmiş.
   4. iki kez daha el toplama işlemi tekrarlayın. Yeni bir 60 saf adacıklar bırakın4 mL tam RPMI medya (Şekil 1C) mm çanak.
2. Gradyanlı santrifüjleme:
   1. 1.077 g / ml yoğunluğunda 2 mL polisükroz ve sodyum Diatrizoate ile önceden yüklenmiş bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayın. kullanılana kadar buz üzerinde tüp bırakın.
   2. Pasteur pipeti ile polisükroz ve sodyum diatrizoate çözeltisinin üst üzerine adım 4.3 süspansiyon aktarın. Alt tabaka Rahatsız etmeyin. kadar yeni doğmuş 10 ya da 2 pankreata P17 dokular her 15 ml tüp içine yüklenebilir.
   3. 4 ° C'de 15 dakika için bir döner rotor içinde ~ 600 x g'de tüp dönerler. Fren-off ayarları kullanın.
   4. Santrifüj işleminden sonra, yeni bir 15 ml tüp içine medya ve interfaz katmanları (İdeal çalışma koşulları altında, adacıklar santrifüj sonra polisükroz ve kültür ortamı arasındaki interfaz yer alacak unutmayın) aktarın. 10 ml medya ekle yavaşça ama iyice karıştırın.
   5. adacık zenginleştirilmiş kısmını aşağı Spin5 dakika boyunca 300 x g'de. Yıkama ortamı çıkarın. tam RPMI medya ile yıkayın bir kez daha tekrarlayın. Çoğunlukla adacıklar ve oluklar (Şekil 1D) içeren 4 mL medya, pelet tekrar.
   6. bölüm 5.1'de belirtildiği gibi adacıklar elle seçin.

İzole adacıklardaki 6. GSIS Tahliller

1. 37 ° C, doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat boyunca tam RPMI ortamı içinde aşama 5.1.4 adacıklar inkübe edin.
2. bir mikroskop altında RPMI kaldırmak için bir pipet kullanın. Plaka ^3-2,8 mM glukoz ihtiva eden 3 mL KRB solüsyonu eklenir. adacıklar yıkamak için 10 kez girdap. KRB çözümlerini çıkarın.
   1. bir kez yıkama işlemi tekrarlayın. bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C de 3 ml KRB çözeltisi ile adacıklar inkübe edin.
3. 12 oyuklu plakanın her oyuğuna kısım 1 ml KRB. Bir inkübatör içerisinde 37 ° C'ye kadar KRB stokları ve plaka önceden ısıtın.
4. 6.2 gibi önceden ısıtılmış KRB ile iki kez adacıklar yıkayın. Transfer önceden ısıtılmış levhaların her çukuruna 10 adacıklar. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin.
5. 45 dakika sonra, süpernatan 50 ul geri. Bu temel şeker altında salgılanan insülin çözeltisi içerir.
6. 32 uL 500 mM glikoz eklenmektedir. solüsyonu karıştırmak için plaka 20 kez döndürülür. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. plaka kez 5 kez her 5 dk girdap.
7. 45 dakika sonra, 50 uL süpernatant çıkarın. Bu yüksek glukoz altında salgılanan insülin olduğunu.
8. 1.5 ml tüp tüm adacıklar aktarın. 30 dakika boyunca -20 ° C'de dondurun. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında çözülme. donma ve çözülme işlemi tekrarlayın.
9. 20 mM HCI ile 0.5 mL% 70 etanol ekleme. gece bekletin. Bu adacıkların sol insülin olduğunu.
10. Insülin seviyelerini analiz etmek için geleneksel bir ELISA kullanarak, daha önce ³ açıklandığı.

Sonuçlar

Her bir küçük fare pankreastan 80 adacıklar - optimum koşullar altında, sunulan yöntem 20 verim alınabilir. Bu sayı, farelerin genetik arka plan, yaşına ve adacıklar boyutu geri alınacak. Yaygın olarak kullanılan arasında, CD1 dışarı yetiştirilmiş ve C57BL / 6J safkan fareler CD1 ve C57BL / 6 veya ticari B6CBAF1 arasındaki melezler daha küçük boyutta daha az adacıklar üretmek / J fareleri yok. Genellikle toplama direkt elden nedeniyle ekzokrin dokularda (Şekil 1A-C) ile ...

Tartışma

Burada, alışılmış perfüzyon için çok küçük pankreatasmdan adacığı izolasyonu adım adım protokolü sağlar. Vb beta hücresi saflaştırma, gen ekspresyon analizi, doku adacığı beta hücresi olgunlaşması, çoğalması, hücre stres yanıtları, hücrenin hayatta kalması, metabolizma ve fonksiyonel GSIS bakım, tüm doku adacığı temelli çalışmalar hazır adacıklar elde etmesi beklenmektedir. Bu bilgimiz, neonatal fareden adacık izolasyonunu gerçekleştirmek için yeni araştırmacılar kılavuzları ilk detaylı görsel protokolünün en i...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kollajenaz Tip IV	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C5138
Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>	Mediatech / Cellgro, Manassas, VA	ile	1x HBSS MT21020CV Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> elde edilirse, CaCl2< / sub> ve MgSO4< / sub> eklenebilir. Sırasıyla 1.26 ve 0.5 mM.
RPMI 1640 glikozsuz	Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA	11879-020	Sonraki adacık kullanımına müdahale etmemek için glikozun belirli seviyelere eklenmesi gerekir.
Glikoz	Sigma Aldrich, St Louis, MO	G-7021 ve nbsp;
polisakroz ve sodyum diatrizoat çözeltisi	Sigma Aldrich, St Louis, MO	Histopaque-10771
Stereoskop	Carl-Zeiss, Oberkochen, Almanya	Stemi2000
Stereoskop	Leica, Wetzlar, Almanya	Leica M165
Mikrosantrifüj	Eppendorf, Hauppauge, NY	Santrifüj 5417C
Santrifüj	Eppendorf, Hauppauge, NY	Santrifüj 5810R
15 mL santrifüj tüpleri	VWR, Radnor, PA	89039-666
50 mL santrifüj tüpleri	VWR, Radnor, PA	89039-658
Hassas denge	VWR, Radnor, PA	VWR-225AC
Mikrofüj tüpleri	VWR, Radnor, PA	87003-294
Pipetman P1000	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123602
Pipetman P20	Fisher Scientific,  Waltham, MA	F123600
100 x 15 mm çanak	VWR, Radnor, PA	25384-088
60 x 15 mm çanak	VWR, Radnor, PA	25384-168
12 kuyulu plakalar	VWR, Radnor, PA	665-180
Makas	İnce Bilimsel Aletler, Foster City, CA	14080-11
Cımbız	İnce Bilimsel Aletler, Foster City, CA	5708-5
CD1 fareleri	Charles River Laboratuvarları, Wilminton, MA	CD-1
C57BL/6J	Jackson laboratuvarı, Farmington, CT	C57BL/6J
B6CBAF1/J	Jackson laboratuvarı, Farmington, CT	B6CBAF1/J