Yöntem makalesi

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

DOI:

10.3791/55199

⸱

10 Mart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verimli tarama (HTS) halen biyokimyasal reaksiyonları veya hücresel süreçleri modüle edebilen bileşiklerin kimyasal tanımlanması için dayanak noktası. biyoteknolojiler ilerlemesi ve küçük moleküllerin yüksek öteleme potansiyeli ile ilaç keşfi yenilikçi yaklaşımların bir dizi HTS kullanımında dirilen ilgi açıklıyor, gelişmiştir. onkoloji alan şu anda transplantasyon ilişkili komplikasyonlar ya da otoimmün hastalıkları hedefleyen yeni immünmodülatör bileşikler belirlenmesi için yapılan hiçbir büyük bir atılım ile ilaç taraması için en aktif araştırma alanıdır. Burada, nitro sıçangil floresans esasına dayalı bir lemfosit deneyinde yeni kolayca yeni bağışıklık bileşimlerin belirlenmesi için uyarlanmış sunuyoruz. Bu deney, Nur77 promotör T veya B-hücresi reseptör uyarılması üzerine GFP ekspresyonu sağlayan transgenik bir fare, elde edilen T veya B hücreleri kullanır. GFP yoğunluğu yansıtırhedef hücre aktivasyonu / transkripsiyon aktivitesi, bizim deney hücre / biyolojik yanıt verilen bileşik (ler) etkilerini incelemek için yeni bir araç tanımlar. Örneğin, bir birincil tarama bağışıklık aktivitelerini gösteren 160 potansiyel hit tanımlanmasına yol açan bir "hedef hipotezi" yokluğunda 4.398 bileşikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu durumda, bu deneyde kullanılması, in vitro / in vivo doğrulama çalışmaları daha da önce geniş kimyasal kütüphanelerin keşfetmek ilaç keşfi programları için de uygundur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verimli tarama (HTS) yaygın yeni tedavi moleküllerin tanımlanması için ya da yeni tıbbi endikasyonlarda FDA onaylı ilaçların yeniden konumlandırılması için kabul edilen kanıtlanmış bir stratejidir. 1. Şu ana kadar elde edilen HTS başarısı, daha önce keşfedilen ilaçların bolluk ile ölçülebilir. Örneğin, bir tirosin kinaz inhibitörü, Lapatinib, göğüs kanseri, sitagliptin tedavisinde kullanılan; dipeptidil peptidaz-4 (DPP-4) inhibitörü, bir anti-hiperglisemik ilaç olarak kullanılır ve kronik miyeloid lösemi tedavisi için, oral Bcr-Abl tirozin kinaz önleyici dasatinib başlangıçta tarafından keşfedilen onaylanmış ilaçlar uzun bir liste birkaç örneği temsil eder HTS. İlaç endüstrisinin verimliliği son zamanlarda yeni kimyasal yapılar keşfi eksikliğinden muzdarip olmasına rağmen 2, başarılı ilaç keşfi olasılığı klinik öncesi Candida sayısında bir artış ile geliştirilebilirdüzenleyici biyolojik / biyokimyasal özelliklerini gösteren tes. Buna göre, fenotipik tarama için uyarlanmış yeni HTS tahlillerin gelişimi yeni ilaç hit keşfi için önemli farmakolojik araçlar sağlamak için potansiyel sunabilir. 3, 4, 5, 6 Ayrıca, HTS şimdi nedeniyle özel tasarlanmış esnek robot tesisler, roman okuma-out teknolojileri ve kapsamlı minyatür dahil son yıllarda önemli teknolojik dönüşümlere daha hızlı bir tempoda yapılabilir. Fenotipik tarama (aka ileri farmakoloji) kullanımında artan ilgi katkıda faktörler arasında 2, 7 fonksiyonel etkileri ziyade moleküler hedeflerin (hedef tabanlı tarama / biyokimyasal reaksiyonların) ile ilgili basitleştirilmiş indirgemeci varsayımlara odaklanarak daha muhtemel olduğunu algı sho için w klinik etkinliği. Böylece, fenotipik tarama yeni potansiyel tedavi bileşikler ve şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların moleküler yollar ortaya çıkarmak için umut vaat ediyor. 2

Düzgün bir şekilde, belirli bir moleküler hedef ya da hücre fonksiyonu için inhibitörler ya da aktivatörler belirlemek için, son derece hassas ve güvenilir bir analiz niyetli lan ve yanlış pozitif arasında ayrım yapmak için gereklidir. Peki, iyi bir tahlil yapar? Belirli bir testin önce kalite (Z faktörü yansıtıldığı) sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmelidir. 8 İkinci olarak, hedeflenen etki veya ekranın hedefi açıkça belirlenmelidir. spesifik ligand-reseptör değerlendirmek için tasarlanmış bir tahlil karşı Örneğin, fonksiyonel hücre bazlı yaklaşımlar reseptör taranması için önemli avantajlar sunabilir. Bunun nedeni ikinci yaklaşım agonist ve antagonist ligandlar ayırt edemez olmasıdır.P = "xref" tersine> 9, hücre bazlı bir yaklaşım, reseptör fonksiyonu, biyolojik bir fenotip ile değerlendirilebilir daha etkili olması muhtemeldir (çoğalması, hücre döngüsünün durması, apoptoz ve / veya farklılaşma). Bununla birlikte, belli bir hücre içi hedef ihlal olarak biyokimyasal denemelerde, fenotipik testlere göre önemli avantajlar sağlayabilir belirtmek gerekir. Daha sonra eylem ilaç moleküler mekanizmasına ilişkin soruşturmalar basitleştirilmesi sırasında bir iyi optimize biyokimyasal tahlil genellikle fenotipik tarama daha az veri dağılım olacaktır. Bununla birlikte, hedef bazlı veya biyokimyasal deneylerin büyük dezavantajı, bir biyolojik sistem (orijinal biyokimyasal deneyde incelenmiştir özgüllük kaybı) test edildiğinde, spesifik olmayan hedeflerini etkileyen yanlış pozitif isabet oranı çoğaltabilen şanstır. 10 negatif ve pozitif isabet arasında köklü bir kesme noktası yanlış pozitiflerin sayısını en aza rağmen benn primer tarama gibi sağlam hücreler, tüm doku veya bütün hayvan gibi yerli hücresel ortamı taklit bir fizyolojik ilgili sisteminin kullanılması tahlil tasarımı sarkacın çekirdek kalır. Bu nedenle, fenotipik tarama bileşiğin etkinliğinin ya da etki mekanizmasına önceden bilgi sahibi olmadan tanımlanmış ilaç hedefleri ile hastalıklar için arzu / biyolojik fenotipik etkileri ile baş keşif sağlar. 11

ticari olarak satılan fare modeli ve kimyasal bileşiklerin bir kümelenmiş alt ailesi: Burada çalışma iki önemli bileşenleri dayalı optimize edilmiş ve tekrarlanabilir fenotipik tarama geliştirme ve test ilgilidir. Hayvan modeli ile ilgili olarak, deney yeşil flüoresan protein (GFP) sentezleme th tarafından tahrik edilen, bir fare suşu (Nur77 GFP) bir kaset içeren bir bakteriyel suni kromozom barındıran türetilen lenfositlerin kullanımına dayanıre Nur77 promoteri. 12, bu uyarım damgasını Nur77 T-hücre reseptörü (TCR) veya B-hücresi reseptörü (BCR) uyarımını takiben up-regüle hemen erken gen olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Tarama yöntemi kendisi de 12, bir yaklaşım büyük kimyasal kütüphane (> 10 5 bileşikler) değerlendirmek için gerekli olan zamanı en aza indirirken, önemsiz analoglarının tarama kaçınarak yardım etmek için kullanıldı. Bunu yapmak için, bir sanal eleme araçlarını kullanarak ilaç kimyacılar tarafından seçilmiş kimyasal bir bileşik veritabanı referans olarak bilinen aktif tohum yapıları kullanan topolojik içindeki bileşiklerin belirlenmesi için kullanılabilir edildi. Bu yaklaşım bize 136.000 üzerinde kimyasal varlıkların genel bir kütüphane temsil 4.398 bileşiklerin taranması için izin verdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan protokolleri Université de Montréal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Fareler Hayati işaretler, servikal dislokasyon gözlenene kadar, CO 2 aşamalı inhalasyonu ile ötenazi yapıldı. Prosedür hayvanlar insani bir şekilde ötenazi ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi önerileri doğrultusunda emin olmak için bir sertifikalı kişi tarafından yürütülmüştür.

Splenocyte Orta ve Akış sitometri Buffer 1. Hazırlık

  1. % 70 etanol-temizlenir biyolojik kaputun altındaki tüm adımları uygulayın.
  2. önceden ısıtılmış Roswell Park Memorial Enstitüsü 70 mL (RPMI) steril bir tüp içinde (piyasada mevcut ve filtre 500 ml hacim steril şişelerde verilir) ve yer 1640 1x ortamı çıkarın. kaldırıldı orta protokolünde daha sonra kullanılacaktır.
  3. 50 mi ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 5 ml penisilin / streptomisin, 5, RPMI kalan 430 ml 1.640 1x EkmL Hepes, 5 mi temel olmayan amino asitler, 5 ml sodyum piruvat, ve süzüldü 0.05 ml (1 M) 2-merkaptoetanol.
    NOT: Isı şok hücreleri önlemek için 37 ºC ayarlanmış bir su banyosu kullanılarak Pre-sıcak splenosit ortamı. Bu hücresel apoptoz indüksiyonu önlemek için önemlidir.
  4. Akış sitometri tampon hazırlanması 98 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile FBS 2 ml ilave edilir ve kullanıma kadar (tercihen içinde üç gün) frigorifik tutmak.

Nur77 GFP fare dalak gelen Splenocyte Hücre Süspansiyon 2. Nesil

  1. Bir septically 6-8 haftalık dişi Nur77 GFP fare dalak izole eder.
    1. Bunu başarmak için, steril kaputun altında çalışırlar. % 70 etanol kurban fare kürk, makas ve forseps bekletin.
    2. Onun sağ tarafında fare Lay sol üst kadranda cilt ve kasları kesti. gözle görülür daha sonra dalak bulun onu kesip kesi alanını kontrol edin. dalak tutmakhazır olana kadar buz üzerinde splenosit ortamında bir sonraki adımı gerçekleştirmek için.
  2. Önceden ısıtılmış splenosit ortam 5 ml ihtiva eden bir 10 cm2 hücre kültürü Petri kabındaki dalak (ler) yerleştirin.
  3. çözüm bulanık olana kadar steril bir şırınga pistonu kullanarak dalak püre. Bir dalak kollajen matriks prosedürü sonuna kadar kalmalıdır.
  4. splenosit ortamında geniş ezme ardından, hücre süspansiyonu toplamak ve filtre-out herhangi bir enkaz veya pıhtı 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden geçirin.
  5. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. yüzen sıvısı atıldıktan sonra, in-house üretilen veya ticari kırmızı kan hücresi lizis tamponu 2-3 mL hücre pelet yeniden askıya. Aşağıdaki pipet (2-3 kez) 20-30 s için süspansiyon dinlendirin.
  6. g ve x 500, 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj 5 ml PBS ya da seçim uygun bir tampon ekleme.
  7. kırmızı renkte olmalıdır (Süpernatantı kırmızı b lize içerir olarakLood hücreleri) ve yeniden askıya splenosit ortamının 2 ml hücre pelletini.
  8. hemasitometre kullanarak, canlı ve ölü (nekrotik) hücreleri ayırt tripan mavisi ile boyanmış hücrelerin sayısını.

Splenocyte Celi Süspansiyon 3. T-hücresi izolasyon

  1. x g 500 ° C'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. 10 x 10 6 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için, serum içermeyen RPMI ortamında hücreleri (adım 1.3 50 mi) yeniden askıya.
  2. 5 ml polistiren tüp hücreleri transferi ve arıtma basamağının sonunda kenara saflık değerlendirmesi / karşılaştırma için dalak 100 uL alikot olarak ayarlayın.
  3. T hücresi izolasyon antikor kokteyli (50 uL / ​​mL) ile 50 ul / ml hücre süspansiyonuna normal sıçan serumu ekleyin.
  4. hücre süspansiyonu karıştırın ve 10 dakika bekletin. Bu adım, antikor kokteyli tüm istenmeyen hücreler bağlamak sağlar.
  5. streptavidin hızlı küreleri ekleyin (mıknatıs2.5 dakika için IC boncuklar), daha sonra, serum içermeyen ortam kullanılarak, 2.5 mL hacmi getir.
  6. 3 dakika için bir hücre izolasyon mıknatıs tüp yerleştirin.
  7. mıknatıs tutan ve tek bir hareketle çözüm dökerek yeni bir polistiren tüp içine T hücresi süspansiyonu aktarın.
    NOT: İzole süspansiyon saflaştırılmış T hücrelerini içerir. Tüm istenmeyen hücreler manyetik streptavidin boncuk bağlı tüp tarafında yapılır.
  8. Tripan mavisi ve hemasitometre kullanarak izole edilmiş T hücreleri saymak.
    NOT: Bu adımda izole edilmiş T hücrelerinin saflığı önce ve akış sitometrisi ile, T hücresi izolasyon sonra CD3 + etkinlikleri yüzde analizi ile (isteğe bağlı) kontrol edilebilir. 13
    1. Kısaca, santrifüj 500 x g'de splenosit hücre süspansiyonu 1 mi. Süpernatantı atın ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda akım sitometri tampon hücreleri askıya.
    2. Floresan etiketli anti-Mous ekleme1: 100 arasında bir konsantrasyonda e CD3 antikoru. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. bir kez yıkayın, santrifüj ve akış-sitometri ile analiz için akım sitometri tamponu (400 uL) içinde yeniden askıya.

Splenocyte Hücre Süspansiyon 4. B-hücresi İzolasyon

  1. T hücreleri (3.1-3.8 adım), fakat bir B-hücresi izolasyon kiti kullanılarak için anlatılan ile aynı protokol takip edin. Saflık değerlendirmesi için, bunun yerine CD3 antikoru CD 19 antikoru kullanımı. 13
    1. (Isteğe bağlı) saflık değerlendirmesi için, CD3 antikoru yerine CD 19 antikoru kullanımı. 500 x g splenosit hücre süspansiyonu santrifüj 1 ml. Süpernatantı atın ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda akım sitometri tampon hücreleri askıya.
    2. Ekleme flüoresan 1 bir konsantrasyonda anti-fare CD 19 antikoru etiketlenmiş: 100 ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. bir kez yıkayın, santrifüj ve akış sitometri tamponu (400 uL) fo yeniden askıyaakış sitometri ile r analizi.

5. T-hücresi aktivasyonu ve GFP ifade indüksiyon

  1. / Oyuk 2.5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda yuvarlak dipli 96 oyuklu bir plakaya, süspansiyon içinde, T hücrelerinin tohumu.
  2. 2 ng / ml ve CD3 / CD28 manyetik boncuk (25 uL / 10 6 hücre) rekombinant interlökin (IL) -7 ekleyin. aktif olmayan T hücrelerinin temsil sonraki ölçümler için bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere boncuklar ile muamele edilmemiş T hücrelerinin bir kısmı tutun.
  3. Oniki saat sonra, yavaşça her hücre süspansiyonu pipetle de yukarı ve aşağı bir kordon hücresi kompleks / agrega kırmak için 96 oyuklu plaka T hücreleri hasat edilir. 5 ml polistiren tüp içine tüm kuyulardan süspansiyon toplayın.
  4. T ve B hücrelerinin saflaştırılması için daha önce kullanılan aynı hücre izolasyon mıknatıs içindeki süspansiyonu içeren Tüp, ve 5 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
  5. T hücre süspansiyonu int aktarınmıknatıs tutan ve tek bir hareketle çözüm dökerek oa yeni polistiren tüp.
  6. 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri Santrifüj. Yeniden askıya 2 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonu elde etmek için, taze splenosit ortam içinde hücreler.
  7. olmayan aktive edilmiş T hücreleri ile karşılaştırıldığında 12 ile 24 saat sonra uyarımları (kalite kontrolü için opsiyonel) akış sitometrisi ile GFP yoğunluğunu değerlendirmek. 12
    NOT: GFP floresan Nur77 GFP T hücrelerine içsel ve TCR başarılı etkinleştirilmesi üzerine kendini gösteriyor. 12
  8. mikroskopi ile canlılığı ve aktivasyonu (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, 0.2 ng / ml 'lik bir konsantrasyonda, 30 dakika Hoechst analizden önce aktive hücreleri leke. bir kapak sürgüsü veya bir düz-tabanlı siyah yüzlü 384 oyuklu plaka iyi hücre süspansiyonu yeterli hacim ekleyin ve canlı hücreleri değerlendirmek için floresan mikroskobu altında incelenmişlerdir. Ölü hücreler nükleer tutmazboyama. 14

6. B hücresi aktivasyonu ve GFP ifade indüksiyon

  1. Bir T-25 kültür şişelerinde kullanılarak, 1 x 10 6 hücre / mL B hücre proliferasyonu yeniden askıya.
  2. 200 ng / ml bir konsantrasyonda 10 ul / ml anti-fare IgG / IgM (H + L) ve yeniden birleştirici CD40L ekleyin. (Aktif olmayan B hücreleri temsil eden), daha sonra ölçümler için bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere muamele edilmemiş B hücrelerinin bir kısmını muhafaza edin.
  3. aktif olmayan B hücreleri ile karşılaştırıldığında, 12 veya 24 saat sonra stimülasyon akış-sitometrisi ile GFP yoğunluğunu değerlendirmek.
    NOT: GFP floresan Nur77 GFP B hücrelerine içsel ve BCR başarılı etkinleştirilmesi üzerine kendini gösteriyor. 12
  4. mikroskopi ile canlılığı ve aktivasyonu (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, 0.2 mg / ml bir konsantrasyonda Hoechst 30 dakika, analizden önce aktive hücreleri leke. hücre süspansiyonu yeterli hacmi ekleyinflöresanlı bir mikroskop altında bir kapak sürgü veya düz tabanlı siyah yüzlü 384 oyuklu plaka iyi ve incelemek canlı hücreleri değerlendirmek. Ölü hücreler nükleer boyanma tutmaz. 14

Küçük moleküllerin 7. yüksek veri akışı tarama

  1. 2 x 10 6 hücre / aktive edilmiş T ve B hücrelerinin ml (manyetik boncuk veya antikorlar / CD40L) ya da aktif olmayan gruplar bir hücre süspansiyonu hazırlanır.
  2. Levha 75,000 hücre / kuyu bir 384-oyuklu plaka (40 uL hacmi). Düz dipli siyah-taraflı 384-plaka veya Hoechst leke kullanarak floresan mikroskobu (önceki HTS isteğe bağlı kalite kontrol adımı) tarafından canlılığı ve aktivasyon değerlendirmesi için bir mikroskop kapak slayt kullanın (adım 5.8 ve detaylar için 6.4 bakınız). 14
  3. Elle ya da otomatik bir sistem kullanarak, her oyuğa (% 0.5 DMSO içinde çözülmüş) tercih edilen ilaçlar ekleyin.
  4. (Aktif) pozitif ve negatif (dışı Acti araç (DMSO) ilaveçıkartılmış) kontrol kuyuları. % 0.5'lik bir maksimum DMSO konsantrasyonu ayarlayın.
  5. 24 saat (ya da kuluçka tercih saat) 37 ° C 'de ve% 5 CO2 için inkübe edin.
  6. (. 1: 3,333; örneğin, 50 uL bir toplam hacmi üretmek için 384-delikli plakalardaki hücreler 10 mcL) tarama gününde, Hoechst 33342 boyası seyreltilir. 0.2 ug / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için Hoechst çözeltisinin eklenmesiyle GFP analizden önce 30 dakika leke.
  7. Yavaşça iyi her bir homojen dağılımını elde etmek için yukarı ve aşağı hücreleri pipetle.
    Not: Bu adım, hücrelerin ters akış yönüne iyi bir tarafında birikme eğilimi gibi bir otomatik sistem kullanılarak ilaçlar (aşama 7.3) tevzi durumunda önemlidir.
  8. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 45 xg'de plakaları dönerler.
  9. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca geri kalanına plakaları bırakın.
  10. Otomatik konfokal içeriği yüksek scre kullanarak, plaka (lar) okuma-çıkışları gerçekleştirinakşamlar (HCS) sistemi. 15 makineye plaka yükleyin. 40X veya daha yüksek büyütmede hedef olarak belirlemiştir. Hoechst (UV lamba) ve GFP için kamera # 1 (lazer 488) için kamera 4. kullanın. kuyu başına 6-10 alanları okumak için makineyi ayarlamak. 488 nm (GFP okumak için) ve UV ışık (Hoechst okumak için) sahada başına iki ardışık okuma yapmak için makineyi ayarlayın. 40X veya daha yüksek büyütmede hedef olarak belirlemiştir.
    NOT: Sistem herhangi bir ayarlama gerektirmez bilgisayarlı mikroskop olduğunu. odak mesafesi, gelen ışığın yoğunluğu ve maruziyet süresi makine tarafından otomatik olarak tüm kurulum bulunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTS analizi tasarımı

Burada floresan tahlil tasarlarken iki önemli faktör dikkate alınmıştır. İlk olarak, T veya B hücre aktivasyonu bir hastalık (örneğin graft-versus-host hastalığı) temsil eder fizyolojik bir durumun çoğaltmak için gereken. İkinci olarak, hücre aktivasyonunun değerlendirilmesi duyarlı ve nicel bir yöntem kullanılarak yapılmalıdır. bu ihtiyaçlara karşılık olarak floresan günümüzde HTS okuma-çıkışları iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli okuma-out yöntemleri hassas ve güvenilir HTS testlerin geliştirilmesi için istismar edilmiştir. Bu kolorimetrik, Işıklı veya floresan yöntemleri içerir. Kolorimetrik yöntemler kurulumu kolay olmakla birlikte, bu müdahale ya da hücre, test edilen bölebilir kimyasal birden eklenen gerektirir. Farmakolojik etkisi, belirli bir uç değerlendirilir olarak 23 ek olarak, biyolojik bir yanıt dinamik değerlendirilmesine imkan yoktur. otomatik HTS kullanılırsa Ayrıca, bu yöntem, pahalı bir robotik ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Université de Montréal tarafından sağlanan Merck Frosst Start-up fonları tarafından desteklenmiştir. Biz onların tartışma, yorum ve yorumlarından İmmünoloji ve Kanser Araştırma Enstitüsü Yüksek verim platformundan Dr Jean Duchaine ve Dominic Salois teşekkür etmek istiyorum. Moutih Rafei bir Fonds de la Recherche en Santé du Québec Genç 1 Ödülü sahibidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nur77GFP farelerJackson LaboratuvarıFare türü No. 016617Hayvan tesisimizde bir ev içi koloni kuruldu 
96 kuyulu U kültür plakası, sterilVWR International10062-902kullanılarak T hücresi aktivasyonu
; m hücreli süzgeç, sterilCorning Inc.352350Splenosit hücre süspansiyonu
üretimi 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpler, sterilCorning Inc.352058Splenosit hücre süspansiyonu
üretimi 50 ml polipropilen konik tabanlı tüpler, sterilVWR International89039-656 Splenosit hücre süspansiyonunun oluşturulması
10 ml iğnesiz şırınga, sterilBecton, Dickinson and Company305482Dalağı ezmek için
T-25 kültür şişesiGreiner Bio-One690 175Aktivasyon sırasında B hücrelerini inküdabet etmek
için 5 ml hücre kültürü kabı, sterilGreiner Bio-One627 160Dalağı ezmek için
Penisilin- Streptomisin (10.000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL   Splenosit ortamının bileşeni
Sodyum bikarbonat ve L-glutaminWISENT Inc.350-002-CL Splenosit ortamının bileşeni
MEM esansiyel olmayan amino asitlerWISENT Inc.321-010 EL Splenosit ortamının bileşeni
HEPES serbest asit 1 MWISENT Inc.330-050-EL Splenosit ortamının bileşeni
Sodyum piruvat çözeltisi (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Splenosit ortamının bileşeni
Fetal Sığır Serumu (FBS) WISENT A.Ş.080-910 Splenosit ortamının bileşeni ve akış-sitometri tamponu
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)WISENT Inc.311-010-CLAkış-sitometri tamponunun bileşeni
2-Merkaptoetanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023Splenosit ortamının bileşeni
T-Hücreleri izolasyon kitiKök Hücre Teknolojileri19851T hücrelerini izole etmek için
B-Hücreleri izolasyon kitiKök Hücre Teknolojileri19854B hücrelerini izole etmek için
Fare T-Aktivatörü CD3/CD28 süperparamanyetik boncuklarThermo Fisher Scientific11452DT hücrelerini aktive etmek için 
Hücre izolasyon mıknatısıKök Hücre Teknolojileri18000T hücrelerini izole etmek ve manyetik boncukları çıkarmak için 
AffiniPure F(ab')2 Fragman Keçi Anti-Fare IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068B hücrelerini uyarmak için
Rekombinant Murin IL-7Peprotech217-17 Aktivasyon sırasında T hücresinin hayatta kalmasını desteklemek için
Rekombinant CD40LR& D Systems8230-CL/CFB hücrelerini uyarmak için
Anti-fare CD3 antikoruBD Pharmingen561799Akış sitometrisi için T hücrelerini boyamak için
Anti-fare CD19 antikoruBD Pharmingen553786Akış sitometrisi için B hücrelerini boyamak için
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A3184224 saat inkübasyondan sonra hücreleri yeniden askıya almak için
Opera Phoenix Yüksek İçerikli Tarama SistemiPerkinElmer, Inc.HH14000000GFP/Hoechst sinyalini analiz etmek için
Manyetik boncuklar 70 ve mikro ile RPMI 1600, ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735(2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fluorescence based Lymphocyte AssayHigh throughput ScreeningT Cell IsolationB Cell IsolationNur77 GFP MouseMagnetic Bead SeparationGFP Expression AnalysisSmall Molecule ScreeningImmunomodulatory Compound IdentificationCell Culture Incubation

İlgili makaleler