Method Article

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyomiyositler, endoredupulite (karyokinez ve sitokinez olmadan devam eden DNA sentezi turları) ve asitokinetik mitoz (karyokinez ancak sitokinez yok) gibi hücre döngüsünün varyasyonlarına eğilimlidir. Bu tür atipik hücre döngüsü varyasyonları, hücre bölünmesinden ziyade poliploid ve çok çekirdekli hücrelerle sonuçlanır. Bu nedenle, kardiyak döngü ve rejenerasyonu belirlemek için kardiyomiyosit çekirdeklerini, hücre başına düşen çekirdek sayısını ve hücre döngüsü durumlarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. Bu, özellikle timidin analogları Ki-67, PCNA veya pHH3 gibi hücre döngüsü aktivitesini tanımlamak için nükleer belirteçlerin kullanımı için geçerlidir. Burada, kardiyomiyositleri ve nükleerliklerini tanımak ve hücre döngüsü aktivitelerini belirlemek için yöntemler sunuyoruz. Yayınlanmış iki transgenik sistem kullanıyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fare hattı ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fare hattı. Bir araya getirildiğinde, bu iki sistem kardiyak rejenerasyon ve plastisite çalışmasını kolaylaştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kardiyomiyosit çekirdekleri ve hücre döngüsü durumu doğru tespiti kalp kası ciro ve yenilenme belirlenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu hücre siklusunu tanımlamak için bu tür pHH3, Ki-67, ya da Timidin analogları gibi, nükleer belirteçleri, kullanımı için de geçerlidir. Erişkin memeli kardiyomiyositlerinin proliferatif kapasitesi 1, bir çoğalma tahlilinde sonucu önemli bir fark olabilir bir kardiyomyosit çekirdeğin proliferasyon belirteci için pozitif bir çekirdeğin bir sahte kimlik, çok küçük olduğu için. Ayrıca, kardiyomiyositlerde poliploid ve çok çekirdekli hücrelerde yerine hücre bölünmesi sonucu bu endoreduplication ve acytokinetic m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hayvanları da içeren bu protokol Tüm işlemler Bonn Üniversitesi etik standartlara uygun olarak ve bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Yönerge'de 2010 Avrupa Parlamentosu / 63 / EU gelen kurallarına uyulması.

Doğum Sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Faaliyet Vitro Görselleştirme 1.

  1. Doğum Sonrası kardiyomiyosit ayrışma
    1. Ön deney preparatlar
      1. Kültür ortamı (IMDM,% 1 Penisilin / Streptomisin,% 1 temel olmayan amino asitler,% 0.1 β-merkaptoetanol) hazırlanması; ortam 1:% 2 FCS ekleyin; Orta 2:% 20 FCS ekleyin.
      2. Ceket 96 çukurlu bir kültür çanağı (yarı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro doğum sonrası kardiyomiyositlerinin çift transgenik Myh6-H2B-AÇS / CAG-eGFP-anillin farelerin kardiyomiyositlerinin hücre döngüsü aktivitesi üzerine siRNA'lar / miRNA'ların etkilerini analiz etmek için doğum sonrası 3. günde (P3) üzerine izole edildi ve transfekte hücre döngüsü aktivitesi indükleyici miR199 5, siRNA p27'yi ve siRNA Fzr1. Negatif kontrol (Şekil 1A) ile karşılaştırıldığında, miR199- (Şekil 1 b) ve .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kardiyomiyositlerde hücre döngüsünü tekrar girin ve yaralanma sonrası ve doku homeostazında sırasında bölmek mümkün olmadığı üzerinde bir tartışma vardır. Kardiyomiyositlerinin temel ciro değerleri% 1 1 ve% 80 7 aralığında verilmiştir. % 40 - 7 da kardiyak lezyon sonrası, hücre döngüsü aktivitesinin indüksiyonu ve yeni kardiyomiyositlerde üretimi 0.0083,% 8 ve 25 arasında değerler ile, sınır bölgesinde bildirilmiştir. Bu uyum.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardımları için S. Grünberg (Bonn, Almanya) ve P. Freitag'a (Bonn, Almanya) teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri kabıSarstedt 821472
100 & m hücreli süzgeçBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Bütandion monoksit (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ enjeksiyon kanülü, StericanBraun, Melsungen4657519
20 gauge iğneBecton Dickinson GmbH301300
24 kuyulu plakalarBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Metil-bütanCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
%37 formaldehit çözeltisiAppliChem GmbH A0936,1000
3 muslukB. Braun Medical Inc.16494C
50 mL şırıngaB. Braun Medical Inc.8728810F
% 70 etanolOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor konjuge ikincil antikorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alfa-aktinin EA-53, Fare IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC4901
Hücre Kültürü Mikroplakası, 96 Kuyu, Yarım AlanGreiner bio-one675986
Kollajenaz BRoche11088815001
konfokal mikroskop Eclipse Ti-ENikon
kriyostat CM 3050SLeica
eşek serumuJackson İmmüno Araştırma, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu SalinSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
fetal buzağı serumuPromoCell, Heidelberg
Formaldehit çözeltisi (%4)PanReac AppliChemA3697
Domuz derisinden elde edilen jelatin, Tip ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
cam lamellerVWR631-0146
GlikozSigma-AldrichG7021
Heidelberger uzatma tüpüIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond mikroskop slaytlarıMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
İnsülin şırıngasıBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s DeğiştirildiDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Lazer Tarama Mikroskobu Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Fare IgG Cy5 (eşek)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
mikrosantrifüj tüpüSarstedt72690
Mini çalkalayıcıVWR12620-940
mirVana miRNA taklitçisi, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biyopsi KalıbıSakura Finetek/ VWR4565
M-slayt 8 kuyulu ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negatif kontrol (şifreli RNA)Ambion / Thermo Fischer ScientificAM4611
Yenidoğan Kalp Ayrışma KitiMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elemanları AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Esansiyel olmayan amino asitler, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, İndirgenmiş Serum OrtamıGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penisilin/StreptomisinGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
DABCO®, solma önleyiciSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780 ile polivinil alkol montaj ortamı
numune kaplarıVitlab80731
Serolojik pipetGreiner607180
yazılımı NIS ElemanlarıNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek OCT BileşikSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 iyodür (642/661)Moleküler problar/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TripsinSigma-AldrichT1426
Buğday tohumu aglütininin (WGA) Floresein etiketliVektör LaboratuvarlarıVEC-FL-1021-5
α-aktinin antikoruSigma-AldrichA7811
β-MerkaptoetanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiomyocyte NucleiCell Cycle ActivityH2B mCherry TransgenicEGFP Analin SignalsConfocal Video MicroscopyHeart Tissue DigestionNuclearity DeterminationEndoreduplication DetectionMitosis VisualizationCardiac Regeneration

Related Articles