Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Özet

T-lenfosit mitogenezine blastojenik transformasyon eşlik eder, bunun üzerine hücre hacmi hücre bölünmesinden önce genişler. Burada, hücre çaplarını ölçme yeteneğine sahip otomatik bir hücre sayacı kullanarak T lenfositlerinde blastogenezi ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Yanıt Lenfosit çoğalma antijenik veya mitojenik uyarımı test immünomodülatör (yani, bağışıklık veya immünostimulan) kimyasal bileşikler ve biyolojik için yararlı bir kolaylıkla ölçülebilir bir olgudur. Mitogenez sırasında erken adımlardan biri bölünmeden önce hücre hacmi artar, bunun üzerine hücre büyümesi veya blastogenic dönüşüm vardır. T-lenfosit uyarma ilk birkaç saat içinde, genellikle tespit edilebilir. Burada, otomatik bir hücre sayacı fare dalak ve insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izole edilen T lenfositlerinde blastojenezini ölçmek için hızlı bir yöntem tarif eder. Çoğunlukla çeşitli yaygın olarak kullanılan çoğalma deneyleri zahmetli ve sadece bir popülasyon içindeki genel nüfus etkisi ziyade bireysel hücresel etkilerini yansıtmaktadır. Buna karşılık, sunulan otomatik hücre sayıcı deneyi olabilir hücre çapları, hızlı, doğrudan ve hassas ölçümler sağlarÇeşitli mitojenler ve in vitro bağışıklık düzenleyici ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

Giriş

T lenfositleri memelilerde adaptif bağışıklık sorumlu birincil hücrelerdir. Antijen-sunan hücrelerin yüzeyi üzerinde MHC molekülleri tarafından sunulan spesifik antigenik peptidlerin yanıt bilinmektedir. Bir ortak kökenli T-hücresi reseptörü (TCR) aktivasyonu üzerine, hücre bir işlem blastogenic dönüşümü veya blastojenezini olarak adlandırılan olarak büyütülür. Uyaran ¹ uygulandıktan sonra bu süreç ilk ~ 6 saat içinde saptanabilir. Blastogenezis sırasında, bireysel T hücrelerinin hacimleri 2- artırmak ^2-6 4 kat. Lenfositler klonal genişleme olarak adlandırılan bir süreç prolifere olmaya başlar, amaç olan mümkün olan antijene özgü TCR-taşıyan hücrelerin birçok klonlar elde etmektir. Projen hücreler daha sonra sitotoksik (CD8 ⁺⁾ veya yardımcı (CD4 ⁺⁾ efektör T lenfositleri içine farklılaşarak kendi immünolojik fonksiyonu gösterirler. Böylece, insan veya fare kanında naif T lenfositlerin hücre G ₀ (dinlenme) aşamasında olandöngüsü ve destek minimal metabolik aktivite. Antijenler ya da mitojen maruz kalma üzerine, T hücreleri, transkripsiyonu ve protein sentezi ^7-10 bir birlikte uyarım ile, hücre döngüsü yeniden girin. Bu forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve protein kinaz C (PKC) ve Ca ⁺² bağımlı sinyal yollarının ¹ aktivasyonu yoluyla lemfositleri stimüle iyonomisin mitojenler. PMA / ionomisin ile T hücrelerinin aktivasyonu, TCR sinyal adımları atlar.

In vitro proliferasyonunu deneyler yaygın lenfosit fonksiyonunu ve uyarılara tepkiyi değerlendirmek amacıyla kullanılır. Çoğalma okumaları genellikle bir ila üç gün T-hücre uyarımı başladıktan sonra alınan ve hücrelerin yüzlerce ya da binlerce toplu durumunu yansıtır. Çeşitli mitojenler ve in vitro bağışıklık ilaç gücü, sadece bu bileşiklerin mevcudiyetinde çoğalma oranları ölçülerek değerlendirilebilir. Bu A nın birssays ve sınırlamaları aşağıda tartışılmıştır.

Doğrudan hücre sayısı sayımı için, prosedür operatör hatalarının olasılığı yüksek olan, zaman tüketen.

DNA sentezi için, 3H-timidin dahil tahlili olduğu DNA sentezini ölçer, ancak önemli bir sınırlama olarak radyotoksisitesi olup. Bir radyoaktif olmayan bir alternatif BrdU, ancak hücre büyümesi için doğrusal bir yanıt aralığı sınırlıdır ve antikor tedavi prosedürü ^11,12 adım sayısını arttıran, gereklidir.

metabolik aktivite, tetrazolyum tuzlarının (MTT, MTS, XTT ve WST-1) ve resazurin için boya bazlı kolorimetrik analizler hücre popülasyonlarının bölünmesi genel metabolik durumunu rapor. Bununla birlikte, MTT, böylece ölçüm hataları içeren, ek bir yıkama adımları gerektiren, kültür ortamı içinde çözünebilir değildir; XTT verimli azaltmak için ek bileşenler gerekir; MTS-, WST-1 ve resazurin tabanlı ölçümler etkiler vardırKültür ortamı pH ve bileşenleri serum albümin ya da ^13-16 fenol kırmızısı ile ed. Bu deneyler, canlı hücre gerçek sayısını ölçmek değil kombine enzim aktivitelerini tahmin yok. Bu nedenle, proliferasyon oranı doğru çünkü hücre sayısı ve boya azalma ^12,17 arasında doğrusal olmayan korelasyon metabolik deneyleri ile belirlenir olmayabilir.

ATP konsantrasyonunun ölçülmesi için, ATP T-hücresi aktivasyonu ile uyarılan artışları çoğalması ile ilişkilidir. Bununla birlikte, hücre içi ATP yükselmesi T hücre aktivasyonunun ilk adımlardan biridir; birçok adım arkasında gerçek çoğalması ^17,18 olduğunu.

Boya seyreltme deneyi için, CFSE floresan boya ile kovalent hücre içi proteinlere bağlanarak hücreleri boyar. boya hücre bölünmeleri sayısını izleyebilirsiniz floresan yoğunluğunda bir çoğalma bağımlı azalma gösterir. Bunlardan Ancak, kovalent protein etiketleme, işlevleriproteinler tehlikeye girebilir. Boya, yüksek konsantrasyonlarda hücrelere toksiktir. düşük boya konsantrasyonları, ancak, başlangıç ​​floresans yoğunluğu izlenebilen hücre bölünmesini azaltılması, azaltılır. Buna ek olarak, CFSE ile işaretlendikten sonra, bu deneyde ^19,20 dinamik aralığını sınırlandıran ilk 24 ila 48 saatlik bir süre boyunca, ilk floresan bir proliferasyon bağımsız ~% 50 kaybı vardır.

Bu tahlillerin çoğu hücrenin çok sayıda ortak durumunu yansıtır ve floresan boyalar ile hücrelerin tedavi gerektirir. bu kimyasal maddeler veya antikorlarla boyama ile analiz kaldırılmadığı sürece nekrotik ve apoptotik hücreler de, bu ölçümler katkıda bulunuyor olabilir.

, Lenfosit blastojenezi optik mikroskopi gibi yöntemler, çeşitli ile değerlendirildi ve ^4,21,22 akış sitometrisi edilebilir. Burada, bir ile T-hücresi ölçü için hızlı bir yöntem tarifn saklanır ve daha sonraki bir zamanda yeniden analiz edilebilir gerçek zamanlı hücre görüntüleri toplar hücre sayacı, otomatik. Tripan mavi renk çıkarılması ile belirlenen boyutu ölçümlerine ek olarak, bu cihaz, hassas hücre sayıları ve yaşayabilir hücrelerin yüzdesini içerir. Bu protokolde kullanılan cihaz piyasada mevcuttur ve üretici üç farklı enstrümanlar ve çeşitli konsantrasyon ve canlılık kontrolleri kullanarak aracın hassasiyetini test ettik. Bu çalışmaların sonuçları, genel olarak% 6'dan varyans katsayısı gösterdi. Protokolde belirtildiği gibi, cihaz, 6 um ve 8 mikron çapında polistiren boncuklar ile düzenli olarak kalibre edilir. Hücre çapına göre dinlenme T hücreleri ve T lenfoblastlarda ayırt etmek için bir hücre sayacı kullanmanın avantajları kullanım kolaylığı ve analiz otomatik doğasıdır. Yazılım her hücrenin etrafında bir daire çizerek ve hücre çapı hesaplama yeteneğine sahiptir. Buna ek olarak, imyaş hücrelerin belirlenmesi ve doğru onları etrafında bir daire çizerek enstrüman doğruluğunu kontrol edebilirsiniz operatör, görülebilir. Sınırlamalar bağlamında, alet enkaz ve hücreler arasında ayrım başına olabilir; nedenle, işlenmekte olan operatör her görüntüyü görüntüler önemlidir. analiz için kullanılabilir alanların sayısını azaltacaktır hava kabarcıkları, dahil etmek için bir potansiyel var; Düzenli yıkama bakım yapılır ancak, bu nadirdir.

Bu çalışmada, dalak T lenfositlerin grupları Genişleme ve 12-48 saat boyunca PMA artan konsantrasyonlarda ile uyarıldı. 2 ng / ml neden sağlam blastogenic yanıtta önemli proliferasyon gibi düşük PMA konsantrasyonları. Bu tür bağışıklık bastırıcı siklosporin A (CsA), FK506 (takrolimus), ve rapamisin (sirolimus) yanı sıra, iyon kanalı bloke edicileri tramvay 34 ve FTY720 gibi çeşitli ilaçların etkileri ölçümleri (fingolimod), blastogenezis üzerinde çoğalması bildirilen etkileri ile iyi bir uyum gösterdi. anti-CD3 ve anti-CD28 antikoru ile kaplanmış bir manyetik boncuklar ile PMA / iyonomisin ve murin T-hücresi uyarımı için insan PBMC blastogenic tepkisi de ölçülmüştür.

hücre ölçüm deneyi blastojenezini ve aynı zamanda, ancak ayrı ayrı çoğalma hızı (hücre yoğunluğu) her iki quantifies bu etkilerin kombinasyonu bak yukarıda belirtilen yöntemlerden farklı olarak. Sunulan protokol mitojenik ve immüno-modülatör ajanların kuvvetini değerlendirmek için hızlı ve sağlam bir teknik sağlamaktadır.

Protokol

Tüm deneyler Wright Eyalet Üniversitesi Lab Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde yürütülmektedir.

Not: İnsan PBMC Ficoll yoğunluk farklı santrifüjü Yöntem ⁵ ile izole edilir.

1. Dalak Hasat

1. Ev yetişkin türe özgü yiyecek, su ve yatak gereksinimleri ile standart laboratuvar koşullarında dişi ICR fareleri.
   NOT: Hayvanlar 2,9 aylık ortalama yaşı ve ötenazi anda 30.4 g ortalama ağırlığı vardı.
2. izolasyon (DOI) tarihinde, ayrı ayrı bulunan diğer conspecific hayvanlar olmadan hayvanlar euthanize. Fare minimal stres sağlamak için tüm çabayı. Ölümü sağlamak için ikincil servikal dislokasyon ile CO ₂ kullanarak euthanize.
   1. CO ₂ odacık ve sta içine transfer kafes içinde hala hayvan yerleştirin/ Dk 5 L gaz akışını rt. Bu akış hızı dakikada ortalama tavsiye% 10-30 oksijen değiştirir.
   2. Hayvan bilinçsiz sonra, / dk 15 L CO ₂ akış hızını artırır. nefes kesilmesi için hayvan kontrol ve ek 2 dakika boyunca oda içinde bırakın.
   3. ölümü sağlamak için oyalama gücü ile servikal dislokasyon uygulayın.
3. Ölüm, 10 dakika içinde, aseptik teknikle hayvandan dalak hasat edilir.
   1. kullanmak için fırın önce bir otoklavda dalağın çıkarılması için makas ve forseps iki set sterilize edin. % 70 etanol uygulayarak diseksiyon yüzeyini sterilize edin.
   2. Fare karın% 70 etanol uygulayın. makas ve forseps bir set kullanarak, daha sonra ayrı çekin ve periton ortaya çıkarmak için cildi geri soyma, karnın sol kanattan gelen kürk ve deri bir kesim yapmak. maruz sonra, periton açmadan önce% 4 klorheksidin çözümü uygulayın.
   3. sci ikinci seti kullanarakssors ve forseps, merkezi karın boyunca 2- 3 cm kesim yapmak. Periton açın ve visseral ekleri ve aşırı yağ uzak keserek dalak çıkarın. Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde dalak yerleştirin.

Ham splenositlerin 2. Hazırlık

NOT: aseptik teknik kullanılarak bir laminer akış biyogüvenlik kabini altındaki tüm adımları uygulayın.

1. Yüzey, eritrositleri lizise uğratmak için 10 cm'lik bir kültür kabı içinde 5 dakika için deiyonize steril _H2O, 10 ml hasat dalak bekletin.
   NOT: dalak izolasyon sırasında hasar gördü bu adım atlanabilir.
2. , Splenositlerin serbest taze 10 cm kültür çanak üzerinde (dalak bakan buzlu tarafı) iki steril cam slaytlar arasındaki dalak ezmek için. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, 50 lU / ml penisilin ile takviye edilmiş RPMI-1640, 10 ml ve 50 ug / ml streptomisin (a atıfta aşağıdaki karıştırıns) RPMI tamamlayın.
3. bağ dokusu ve enkaz kaldırmak için yeni bir 10 cm'lik kültür çanak içine steril bir 40 mikron naylon hücre süzgecinden hücreleri Filtre.
4. Lyse 20, pH 7.4'te 155 mM _NH4CI, 10 mM NaHCO ₃ ve 0.1 mM EDTA oluşan RBC parçalama tamponu ilave edildi ve ~ 300 mOsm / uL kalan eritrositler.
   Not: Ozmolalite donma noktası veya bir buhar basıncı osmometre ile ölçülmüştür.
   1. 10 dakika boyunca (4 ° C), 250 xg, 50 ml konik bir tüp ve santrifüj 10 cm'lik tabak hücreleri aktarın.
   2. Süpernatantı RBC lizis tamponu 20 ml ekleyin ve pipetle pelet hücreleri yeniden askıya.
   3. hafifçe çalkalanarak 10 dakika süreyle liziz tamponu içinde oda sıcaklığında inkübe edin.
   4. 250 xg (4 ° C), 10 dakika boyunca santrifüj pelet hücreleri. lizis tamponu kapalı dökün.
   5. daha tam RPMI ve santrifüj 10 ml (250 xg, 10 dakika, 4 ° C) hücreler yeniden askıya. Disksüpernatant ard.
5. tam RPMI 2 ml splenositlerin yeniden askıya naylon yün kumaş kolonuna transfer için 37 ° C'ye kadar ısıtıldı.

T lenfositlerin 3. saflaştırılması

1. Tam RPMI 5 ml ile iki kez naylon yünü sütunları yıkayın. 1 saat boyunca bir% 5 _CO2 hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Bu deney süresince nemli naylon yünü korumak için ve tam RPMI tüm naylon yünü yalıtım adımları için 37 ° C'ye kadar ısıtıldı kullanmak zorunludur.
2. Sütununa yalıtılmış splenositlerin ekleyin ve B hücreleri, fibroblastlar, ve yardımcı hücreleri naylon yünü uyması sağlamak için 1 saat boyunca inkübe edilir.
   1. sütuna splenositlerin içeren RPMI 2 ml ekleyin ve naylon yün üst ulaşılana kadar geçmektedir.
   2. naylon yünü üzerine ısıtıldı, 37 ° C'ye tam RPMI 2 ml ilave edilir ve yün yoluyla orta geçmesisıvı seviyesi üst yüzeyine ulaşıncaya kadar.
   3. tamamen naylon yünü kapsayacak şekilde kolona sıcak tam RPMI 3 ml ekleyin.
   4. 1 saat boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 hücre kültürü inkübatöründe rahatsız yüklü sütuna inkübe edin.
3. Tam RPMI 5 ml ile iki kez yıkanması hücreleri Zehir. Santrifüj ile elüt hücrelerinin ek bir yıkama yapın.
   1. tam RPMI üst 2 kez kolon doldurun ve sütununda çözelti, 50 ml'lik steril bir konik tüp içine akmasına izin verir.
      NOT: dokunarak veya naylon yün bağlı kalarak B hücrelerini, aksesuar hücreler ve fibroblastlar bağdaki sütun, darbeleme kaçının.
   2. pelet hücreleri 10 dakika boyunca (4 ° C), 250 x g hızında akış bölümünü ve spin toplayın. tam RPMI, 10 ml ile bir kez yıkanır. (250 xg, 10 dakika, 4 ° C) tekrar Pelet hücreleri ve tam RPMI 2 ml yeniden askıya.
   3. c ölçün ell yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak ve 0.5 x 10 ⁶ hücre / ml tam RPMI içinde seyreltin.
   4. Tohum 1 ya da sırasıyla 24- ya da 6-yuvalı hücre kültürü plakasının, her oyuğuna hücre 2 ml'lik eş payları, ve Kültür,% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de hücreler.
      Not: 1 mm, 1,4-ditiyotreitol (DTT), T-hücre yaşamını geliştirmek için, bu aşamada, her oyuğa ilave edilir.
   5. İsteğe bağlı: flow sitometri ile izolasyon protokolü verimliliğini onaylayın. Bu protokol, normalde ~ T ²³ lenfositleri% 80 verir.
      NOT: Naylon yün-saflaştırılmış hücreler yaklaşık olarak% 50 CD4 ⁺ ve% 23 CD8 ⁺ hücreleri içerir. Daha CD4 + ve CD8 + alt-popülasyonunu saflaştırmak için, tek bir immünomanyetik tükenme adımı Sekiz antikor ve manyetik boncuklar ²⁴ kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Seçenek olarak ise, saf CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T-hücre popülasyonları spesifik antikorlarla pozitif ya da negatif seçimle izole edilebilir.

_title "> 4. T lenfositlerin aktivasyonu ve Deneysel İlaç Pozlama

1. PMA ilave edilerek ve kalsiyum tuzu veya anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ^23,25,26 kaplanmış manyetik boncukların ionomisin izolasyon 24 saat içinde T lenfositleri etkinleştirir. Aktivasyon zaman deneysel ilaçların (örneğin, siklosporin, FK506, rapamisin, tramvay-34 ve FTY720) ekleyin.
   Not: Burada PMA konsantrasyonu 2 ila 250 ng / ml arasında değişmektedir ve ionomisin konsantrasyonu 250 nM'de tutuldu. Mümkünse hücrelerin her oyuğuna ilave birim tekrarlanabilirliği sağlamak ≥1 ul olacak şekilde, seyreltme her ilacın hazır alikotlarından hazırlanmalıdır. 1 boncuk-hücre oranı: anti-CD3 / anti-CD28 kaplı manyetik boncukları 1 ilave edilir. (Yani, kordon-hücre oranı) hücre başına tanelerin sayısının artırılması stimülasyon ^25,26 yoğunluğunu artırır. Boncuklar yıkandı ve bunların hücrelere ilave edilmeden önce tam RPMI içinde tekrar süspanse edilir. Bu numuneler Tripan Notmavi boncuk boyar.
2. Kültür otomatik hücre sayacı ile analiz etmeden önce,% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 12-72 saat boyunca hücreleri.

5. Otomatik Hücre Sayım Cihazı Veri Toplama

1. Örnek çalıştırmadan önce, hücreler yavaşça kümeleri önlemek için serolojik pipet ile karıştırılır emin olun. Bu, daha geniş yapışkanlık aktive lenfositler için özellikle önemlidir.
   1. pipetleme sonra anti-CD3 / CD28 boncukları ile aktive kültürler için, 1.5 ml ya da 2 ml santrifüj tüpüne örnek aktarmak. 1-2 dakika süreyle bir mıknatıs tüpü tutarak boncuk ayırın. analizi için hücreler ihtiva eden üst sıvıyı kullanın.
      Not: kültür ortamı içinde mevcut serum ile dinlenme hücrelerin herhangi bir ön etkinleştirme hesaba 1 saat içinde hem de dinlenme ve aktive edilmiş hücreler analiz edin. PMA 12 saat sonra / stimülasyon iyonomisin, hücre boyutunda küçük bir artış tespit oldu (Şekil 2
2. Bir örnek kabına Transferi hücre süspansiyonu 1 ml ve kılavuzundaki talimatlara uygun olarak otomatik hücre sayacı ile çalıştırın.
   Not: çalışmaların her biri için, hücre kültürü, 1 ml (2 ml) maksimum minimum kullanılmalıdır. otomatik hücre sayacı hücre süspansiyonu ile, tripan mavisi karıştırmak için bir şırınga kullanarak ve görüntülü ve yazılım ile analiz edilir bir alan üzerinde hücre tripan mavi karışım geçer. yazılım, tripan mavi boyanan hücrelerin algılar her hücrenin etrafında bir daire çizer ve çapını belirler. 100 resim her bir örnek toplanan ve hücre canlılığı ve boyutları belirlenir edilir. Burada kullanılan hücre sayacı algılama eşiği 5 um'lik bir alt sınırı yoktur.
3. Her veri transferi daha fazla analiz için bir elektronik tabloya çalıştırın.
4. Bir 1 kullanılarak düzenli olarak aygıtı kalibre6 mikron ve 8 mikron çaplı polistiren boncuklar ml örnek.
   NOT: Her seri için üretici tarafından ölçülen gerçek boncuk boyutları kullanılmalıdır değil, nominal boyut. Bu çap uzunlukları ve dinlenme beklenen çap ve aktive edilmiş T hücreleri bulunur, çünkü 6 ile 8 mikron boncuk (Şekil 1 e bakınız) uygundur.

6. Veri ve İstatistiksel Analiz

1. Uygun istatistiksel ve grafik yazılımı kullanarak verileri analiz edin.
   NOT: (: 5 mikron 70 mikron aralığında) Her çalışma için tablo her çapta hücrelerin sayısını içerir. 17 um çaplı Yukarıda sözü edilen hücreler toz parçacıklarını ve alet ile olduğu gibi canlı hücreler okunabilir küçük kabarcıklar, hariç tutmak için analiz çıkarılır.
2. eşitsiz varyans ile veri setleri için Welch t-testi kullanılarak test hipotezi gerçekleştirmek; Sonuçlar <0.001 p eğer istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmektedir. kullanılan formül oldu
   
   nerede ve Örnek araçlardır, ve Örnek varyanslar, ve ve Her veri kümesi için örnek boyutları vardır. serbestlik derecesi sayısı konservatif her bir karşılaştırma için iki örnek boyutları küçük kullanılarak tahmin edilmektedir. Çubuk grafikler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur.

7. dalak T-limfosit proliferasyon denemesinin

1. Bir MTS- veya MTT bazlı kolorimetrik plaka okuyucu proliferasyon analizi kullanılarak T hücre proliferasyonunu ölçmek.
   NOT: Tahlil üssüNADPH veya NADH tarafından olasılıkla MTS tetrazolyum bileşiği (Owen reaktifi) çözülebilir formazan ürününün indirgenmesi, d dehidrojenaz enzimleri tarafından metabolik olarak aktif hücrelerinde üretilen.
2. Bir hemasitometre ile saflaştırılmış T hücreleri saymak ve 1 x 10 ⁶ hücre / ml nihai yoğunlukta tam RPMI-1640 onları yeniden askıya.
   Not: 1 mM DTT, bu aşamada hücrelere ilave edilebilir.
3. PMA ile hücreleri aktive ve gerekirse test ilaçlar ile birlikte iyonomisin ve (adım 4'e benzer) hafifçe karıştırın.
4. Levha 100 bir 96-yuvalı hücre kültürü tedavi plakanın her bir hücre ul ve 48 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Arka plan emmesinin bir okuma elde etmek için, bir yuva içine hücreleri olmadan RPMI-1640 ortam 100 ul ekle.
5. Her bir MTS bazlı bir tepkime maddesi 20 ul ilave edin ve 4 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
6. Bir plaka okuyucusu kullanılarak 490 nm'de absorbans ölçümleri al. birbsorbance ölçümleri her bir metabolik olarak aktif hücrelerin sayısına karşılık gelir.
   NOT: Gerekirse arka plan seviyelerini çıkarın. Arka plan absorbans değerleri ışığa kültür ortamı, serum, harici pH, ve MTS reaktifi maruz kalma süresi tipine bağlıdır. MTS bazlı reaktifler ışık duyarlı ve birkaç saat ışığa maruz kalma yüksek bir arka plan absorbans değerleri ile sonuçlanabilir.

Sonuçlar

Biz PMA, bir forbol ester ve ionomisin, bir kalsiyum iyonofor ile uyarılması sırasında lenfosit blast oluşumu ile karşılaştırmak için bu tahlil kullanılmıştır. Şekil 1A dinlenme çapları ve farmakolojik aktif dalak T hücrelerinin sıklığı dağılımını göstermektedir. Yaklaşık 2 gün için PMA / ionomisin ile hücrelerin tedavisi (örneğin, referans ^4. bakınız) daha büyük çaplara doğru dağılımın ortalama önemli bir değişime yol açtı. Daha küçük çapa sahip hücrelerin sayısı buna göre azaltılmıştır. Bizim cihaz doğru çapları bildirdi tespit etmek amacıyla, 6 mikron polistiren boncuklar ile iki kalibrasyon ve 8 mikron çapları (Malzeme Tablo) uygulandı. 6 um standart ile üst üste 8 um, standart ve dinlenme T hücreleri ile üst üste, aktive edilmiş T hücrelerinden Şekil 1b ve 1c okuma. şekil1D üretici tarafından bildirilen kontrol boncuk boyutları bizim otomatik hücre sayacı ile ölçülmüş ortalama çapları karşı çizilmiştir gösterir. 6 um boyutu biraz bağlı 5 um'lik bir alt sınır olan aletin ölçüm eşiğine muhtemelen bizim ölçümlerde abartılmıştır olduğu ortaya çıktı. Ancak, hücre sayacı ölçümlerinden hesaplanan kordon çapları standart sapma, üretici tarafından verilen standart sapma ile uyum içinde idi. Bu cihaz dinlenme ve mitojen ile uyarılmış fare T-hücre boyutlarına karşılaştırma güvenilir kullanılabilir ve cihaz doğru gerçek hücre çapları ölçülebilir olduğunu, bu deneylerden sonucuna varıldı.

Daha sonra PMA konsantrasyonuna bağlı ortalama çapı artışı bağımlılığı test ilerledi ve 250 nM'lik bir sabit ionomisin konsantrasyonda PMA etkisi önemli ölçüde konsantrasyonu f yükseltilerek değişmez olduğu bulunmuşturROM 2 250 ng / ml (Şekil 2A). MTS bazlı analiz kullanılarak, 50 ila 250 ng / ml PMA T-hücresi çoğalması ölçüldü ve hücre çapı verilerine uygun herhangi bir kayda değer bir fark (Şekil 2C), bulunan. Kalsinörin inhibitörü ilaçlar siklosporin A (300 nM) ve FK506 (1 nM) hem blastojenezini (Şekil 2B) ve proliferasyon (Şekil 2C) bastırılır. İnhibisyon Ancak, her iki durumda da tam değildi. PMA / iyonomisin ilave 50 ng / ml ve 250 ng / ml PMA, sırasıyla (Şekil 2B) için çapında bir% 7.2 ve% 6.8 artış gösterdi sonra Ölçümler 12 saat uygulandı. 48 saat stimülasyonu (Şekil 2A karşılaştırmak) için olduğu gibi, bu iki konsantrasyonda boyutu artar, anlamlı bir fark yoktu.

PMA / iyonomisin stimülasyon 48 saat sonra dinlenme toplanan hücre çapı verileri ve aktive edilmiş T-hücreleri de özetlenmiştir 2 151.4 ve 1.9 x 10 ^-4 nl idi. Aktive edilmiş T hücrelerin ortalama yüzey alanı ve hacmi, sırasıyla, 300.6 um ² ve 5.9 x 10 ^-4 nl edildi. Tüm aktif hücreler için genel ortalama çapı artan, 40.92% (Tablo 1).

CsA, FK506'yı, rapamisin, FTY720 ve TRAM-34: Biz de diğer immünosupresif olduğu bildirildi kimyasal bileşikler test etti. Şekil 3'te, hücre boyutu ölçümleri, dinlenme elde edilir ve aktive edilmiş T hücrelerinin yokluğunda, bu ilaçların varlığı gösterilmiştir. Aktive edilmiş T hücreleri (NFAT) ^27,28 kalsineurin bağımlı nükleer faktör hedef CsA ve FK506, yaklaşık% 72 (Şekil 3A ve 3B) ile blastogenic tepkisini inhibe En güçlü olmuştur. İlginçtir ki,artan PMA konsantrasyonları, CsA ve FK506 gücü bu ilaçların (Şekil 2A ve 2B) yokluğunda hiçbir ek hücre çapı artış olmasına rağmen, biraz düştü. Rapamisin, rapamisin (mTOR) ^29,30 memeli hedefi inhibe eden bir bağışıklık baskılayıcı, bir orta düzeyde fakat istatistiksel olarak önemli bir etki (Şekil 3A, 3B ve 3C) vardı. FTY720 dolaşımı ³¹ içine lenfosit çıkmasını önler ve en son TRPM7 yüksek ³² lenfositleri, T ile ifade edilen iyon kanallarını inhibe ettiği bulunmuştur bir sfingosin 1-fosfat reseptörü agonistidir. FTY720 ve rapamisin Hem yaklaşık% 34 çap% 52 artış ortalama düşürülmesi blastojenezi üzerindeki benzer bir etkiye sahiptir (Şekil 3A ve 3B). Tramvay 34 kalsiyum ile aktive edilen potasyum kanalının KCa3.1 ³³ bir blokeridir. 700 nM test, TRAMVAY-34 i, fare T hücrelerinde etkisizn, yeni bir insan T-hücresi çoğalması çalışma ile uyumludur; Bunu gücü Mitojenik uyarıma ³⁴ (Şekil 3A ve 3B) doğası ve gücüne bağlı olabilir. 700 nm tramvay 34 eden yama kelepçe elektrofizyoloji deneylerinde KCa3.1 kanal bloke edilmesinde etkili olduğunu (veriler gösterilmemiştir). Bu karşılaştırma 48 saat aynı deney içinde birden çalışmalarda dinlenme ve ilaç maruz kalan hücreler arasında yapılmıştır. Rapamisin ve CsA birlikte kullanıldığında, blastogenezis (Şekil 3C) tamamen engellenmiştir.

72 saat anti-CD3 / anti-CD28 kaplı manyetik boncuklarla sıçangil T hücrelerinin aktivasyonu, CsA mevcudiyetinde (Şekil 3D) içinde% 5 düşürülmüştür ortalama çapı, bir% 27 artış üretti. (48 saat için PMA / iyonomisin aktivasyon üzerine insan tek-çekirdekli hücreleri% 33 çap olarak büyütülmüştür ve CsA mevcudiyetinde aktivasyonu% 23 yanıtta azalma

Şekil 1: fare dalak T-hücre çaplarının Frekans dağılımları. (A) Siyah sütunlar istirahat gösterir ve kırmızı sütunlar PMA / iyonomisin aktive (48 saat) hücreler gösterir. 8 um parçacık boyutu kalibrasyon standardı üzerine yerleştirilen aktif dalak T hücrelerinin (B) dağılımı. (C) 6 mikron kalibrasyon standardının üzerine bindirilmiş T hücrelerinin dinlenme dağılımları. hücre ve boncuk sayıda kutular içinde gösterilmiştir. Hücre sayacı ile ölçülür (D) medyan çapı üretici tarafından bildirilen tane çapı karşı çizilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

= "1"> sayfa içinde
Şekil 2: PMA konsantrasyona bağlı kemirgen T-hücresi aktivasyonunun bağımlılığı. (A) T-hücrelerinin sabit konsantrasyonda ionomisin (250 nM) ile muamele edilmemiş ya da 2, 50 ile muamele edilmiş ve 250 ng / ml PMA ya ortalama çapları. Istirahat (B) hücre ölçüm ölçümleri ve yokluğunda harekete geçirilmiş (2, 50, 250 ng / ml PMA) T hücreleri ve 300 nM CsA ya da 1 nM FK506 varlığı. 250 nM yokluğunda ionomisin ve 300 nm CsA varlığı ile (C) 'MTS proliferasyon 50 ila 250 ng deney / ml PMA. Anlamlı farklılıklar (p <0.001) yıldız ile gösterilir. n denemenin toplam sayısıdır. Veriler 3 farelerden izole edilmiş hücrelere vardır. (D) dinlenme hücre çapları ve aktive T hücreleri (250 ng / PMA ve 250 nM iyonomisin mi) ve yokluğunda, 300 nM CsA mevcudiyetinde aktivasyonundan sonra 12 saat süredir. Güncelle / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: CsA Etkileri, FK506, FTY720, rapamisin ve hücre boyutuna TRAM-34. (A ve C) ve yokluğunda ilaçların mevcudiyetinde istirahat ve PMA / İyonomisin ile aktive fare T hücrelerin ortalama çapları. Konsantrasyonları kutusunda gösterilir. A (b) Veri dinlenme T-hücresi çapı üzerinden yüzde artış olarak ifade edilir. Lenfosit aktivasyonu 250 ng / mL PMA ve 250 nM ionomisin ile gerçekleştirildi ve ölçümler 48 saat sonra alınmıştır. (D) istirahat ve anti-CD3 hücre sayacı ölçümleri / CD28 ile aktive edilen T-hücreleri, ve yokluğunda, 300 nM CsA mevcudiyetinde aktivasyonundan sonra 72 saat.rge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: mitojen stimülasyon üzerine insan PBMC'lerinde Blastoj enez. (A) Siyah sütunlar istirahat gösterir ve kırmızı sütunlar aktif PBMC'ler göstermektedir. (B) dinlenme ortalama çapları ve yokluğunda aktive PBMC'ler ve 300 nM CsA varlığı. Hücreler 250 ng / ml PMA ve 250 nM ionomisin ile aktive edildi ve ölçümler aktivasyon 48 saat sonra alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

column1	dayanma	aktive	CsA 100 nM	CsA 200 nM
Ortalama Çap	6.94 mikron	9.78 mikron	8.19 mikron	7.92 mikron
Çap Ortalama Artış		40.92%	17.88%	14.09%
Ortalama Yüzey Alanı	151,37 μm²	300,61 μm²	210,56 μm²	197,22 μm²
Yüzölçümü Ortalama Artış		98,59%	39.00%	30.16%

Tablo 1: ortalama hücre çapı ve yüzey alanı da göreli bir artış Özeti. Ölçümler 250 ng / ml PMA ve 250 nM ionomisin ile aktivasyondan sonra 48 saat sonra ifa edilmiştir.

Tartışma

Burada, otomatik bir hücre sayacı kullanılarak T-hücresi blastogenic dönüşüm hızlı tespiti ve ölçülmesi için bir teknik açıklanmaktadır. Bizim koşulları (250 ng / ml PMA ve iyonomisin uyarım 250 nm) altında, hücre yüzey alanı, iki kat ve aktivasyon 48 saat sonra ses üç kat artmıştır. MTT analizi, hücre hacmi (Şekil 2D) dinlenme göre sadece 1.25-kat artmıştır aktivasyonunun ilk 12 saat boyunca püskürtme tespit etmek için yeterli bir duyarlıdır. Anti-CD3 ve anti-CD28 antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak T-hücresi aktivasyonunun bir fazla fizyolojik olarak uygun bir mekanizma hacminde ortalama 2.3 katlık bir artışa (aktivasyon 72 saat sonra, Şekil 3B) ile anlamlı blastogenic yanıt üretti. İnsan mononükleer hücreler 48 saat (Şekil 4), PMA sonra hacim bir 2.6-kat değişimi / stimülasyon iyonomisin gösterdi. ICR fare dalak T hücresi ortalama çapı ve hacim olarak belirlendiSırasıyla 6.9 mm ve 1.9 x 10 ^-4 nl. İnsan PBMC (bir sağlıklı donörden) 7.7 um arasında bir ortalama çapa ve 2.7 x 10 ^-4 NL ortalama hacmi. Bu protokol kullanılarak, aynı zamanda, T hücrelerini aktive etmek için yetenekleri açısından PMA artan konsantrasyonlarda test edilmiştir. Bu, tek hücreli benzer sonuçlar elde PMA konsantrasyonlarında gerçekleştirilen proliferasyon deneyleri ile tutarlı olmuştur.

Hücre çoğalmasını etkilediği bildirilmiştir çeşitli bileşikler test edilmiştir: FTY720 ^31,32; imünosupresanlar siklosporin A, FK506 ve rapamisin ^27,28; ve TRAM-34, kalsiyum-aktive KCa3.1 kanalları ^33,35 bir engelleyici. Bu test edilen konsantrasyonlarda, blastojenezi en güçlü inhibitörler CsA ve FK 506 idi tespit etmiştir. Rapamisin blastogenezis daha küçük ancak istatistiksel olarak anlamlı baskılayıcı etkisi vardı. Tramvay 34, diğer taraftan, blastojenezi etkilemedi.

CsA hem blastojenezini ve p bastırılmışroliferation, fakat tamamen değil (Şekil 2B ve 2C), bu otomatik hücre sayacı ölçümü gösteren T-hücresi proliferasyonu, ilaç verimi ile iyi bir ilişki olduğunu. Birlikte CsA rapamisinin varlığında, blastogenezis kombinasyon halinde NFAT- ve mTOR aracılı yolaklar tam PMA / ionomisin (Şekil 3C) ile mitojenik uyarılması üzerine, T-hücresi büyümesi için hesap düşündüren, tamamen engellenmiştir.

Bazı proliferasyon tahlillerinin dinamik aralık (bakınız Şekil 2) ile sınırlıdır. Böyle biz kullandık biri (Şekil 2C), apoptotik ve nekrotik hücreler katkıları içeren bir sinyal rapor olarak Çoğalma deneyleri. Ölçümler canlı hücrelere sadece ilgilendirmeyen gibi otomatik çap değişikliği ölçümleri, bu sınırlama yoktur. Hücre canlılığı, sağlıklı, canlı hücrelerden tripan mavi rengin çıkarılması ile değerlendirilir. boyut ölçümlerde, ileri kullanarakçiftli hücre ayrımcılık flow sitometri ışık saçılım ²² sorunlu olabilir. Otomatik hücre sayacı ölçümlerde, herhangi bir çift popülasyon (Şekil 1) bulunmuştur. Ayrıca, ölçme 100 ve 200 nM siklosporin (Tablo 1) ve mitojenik stimülasyon 12 saat (Şekil 2B) olan blastojenezi tespit etkileri arasında ayrım yapmak yeterli hassas oldu.

Bu yeni deney örneklerinin küçük sayıları için özellikle yararlıdır. En fazla 15 numuneleri 1 saat ölçülebilir. Ancak, deney hafifletilebilir çoğu kendi sınırlamaları vardır. etkili hücre çapı küçük (<1 mikron) fark çözebilirsiniz olsa da, biz kullanılan makine modeli 5 mikron düşük bir algılama eşiği vardır. etkin daha küçük çaplara sahip tüm hücreleri hariç çünkü bu sınır, çok küçük hücre boyutlarına abartılmış neden olabilir. Ancak, cep sayaç yeni modeller algılama thresh varBu sorunu hafifletmek gerekir ~ 2 mikron yaş. Çok fazla çöp örneğinde ise, gösterge olanağına haliyle, canlı hücreler davranır. Ayrıca, hava kabarcıkları bazen akış hücresi içine almak ve makine tarafından yakalanan hücre görüntüleri bozulmalarına neden olabilir. distorsiyon canlılığı belirlenmesini etkiler görünmüyor, ancak ölçülen çaplar etkileyebilir. Nedenle, her deneme veri analizi için kabul edilmeden önce tüm görüntüleri hava kabarcıkları için deneyci tarafından kontrol edilmesi tavsiye edilir. Yazılım sadece hücrelerin etrafında daireler beri, küresel olmayan hücrelerin çapları küresel olmayan hücreler için tahlil daha az uygun hale uzun eksenine doğru eğik olabilir.

Bu deney, bir kaç saatlik süre boyunca proliferasyon deneyleri ile karşılaştırıldığında, numune başına yaklaşık 4 dakika sürmüştür, hızlıdır. Veri toplama cihazı ile gelen yazılımı kullanma da oldukça basittir. yazılım sp ölçüm verileri verebilirsinizAnaliz için readsheet. nüfus, ölçme karşı Son olarak, tek hücreli bir olduğu; blastogenezis ve çoğalması hem ölçülür; ve aynı anda canlı ve ölü hücreleri birbirinden ayırır. Bir bağışıklık tepkisi etme kabiliyetleri için çeşitli fare suşlarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Tahlil, aynı zamanda, insan vericilerden (Şekil 4) alınan T-hücrelerinde blastojenezi ölçümü için başarılı bir şekilde kullanılabilir ve ayrıca diğer hücre tiplerinde de kullanılabilir.

Hücre hacmi artar metabolizma düzenlenmesine katkıda bilinmektedir: Hücre şişmesi hepatositlerde ^36,37 glutamin kaynaklı glikojen sentezini ve lipogenezi uyarır. Kemotaktik ajanlar ^38-40 şişme% 10-15 neden olurken Nötrofiller, 35-60% göç ilişkili hacim artar görüntüler. Geçerli tahlil potansiyel bu süreçleri incelemek için kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RPM-1640 / nbsp;	Lonza	BW12-702F
40 & mu; M Naylon Hücreli Süzgeçler	Thermo Fisher Scientific	22363547
naylon yün elyaf kolonlar	Polysciences, Inc.	21759-1
50 ml Konik Tüpler	Laboratuvar Deposu	TLD431697
6 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar	USA Scientific	CC7682-7506
96 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar	Thermo Fisher Scientific	130188
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100
CellTiter 96 AQueous Tek Çözeltili Hücre Proliferasyon Testi	Promega	G3582	MTS bazlı tahlil
Siklosporin A	Sigma-Aldrich	30024
FK506	Cayman Kimya Şirketi	104987-11-3
Rapamisin	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-3504
TRAM-34	Sigma-Aldrich	T6700
FTY720	Sigma-Aldrich	SML0700
Dynabeads Fare T-Aktivatör CD3 / CD28	Gibco	11456D
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Acros Organik
İyonomisin kalsiyum tuzu	Sigma-Aldrich	I0634
Penisilin-Streptomisin	MP Biyomedikal	ICN1670049	100x hisse senedi
Dulbecco' s fosfat tamponlu salin (DPBS)	HyClone	SH30378.02	10x stok
1,4-ditiyotreitol (DTT)	Research Products International	12/3/3483	indirgeyici ajan
8 & mikro; M Mikro Partikül Boyutu Standardı	Sigma-Aldrich	84192-5ML-F	Gerçek  8.02 &mikro; M
6 ve mikro; M Mikro Partikül Boyutu Standardı	Sigma-Aldrich	89756-5ML-F	Gerçek 6.084 ve mikro; m
1.5 - 2 ml tüp V & için tek manyetik ayırma standı	P Bilimsel A.Ş.
Hücre kültürü inkübatörü	Forma Scientific	3110
Synergy H1 hibrit okuyucu	Bio Tek	BTH1M
Vi-CELL hücre canlılık analizörü	Beckman Coulter	731050