Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu İn Vitro Oosit Olgunlaştırma

Summary

Anne gen ürünlerinin işlenmesi için kullanılan zebra balığı oositlerin in vitro olgunlaşması için optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur.

Abstract

Hayvan embriyonik gelişimin erken safhalarında sırasında gerçekleşecek Hücresel olayların gelişmekte oosit içine yatırılır maternal gen ürünleri tarafından tahrik edilmektedir. Bu etkinlikler, genellikle yumurta içinde döllenme yani; önceden kısa bir süre sonra hareket anne ürünler dayandıklarından, döllenmiş yumurtanın içine reaktiflerin enjeksiyonunu içeren ekspresyon ve fonksiyonel indirgenmesi için standart yaklaşımlar tipik olarak etkisizdir. Bunun yerine, bu tür kullanımlar, önce ya da anne ürünlerin birikmesi sırasında, oogenezis sırasında gerçekleştirilmelidir. Bu makalede, erişkin için hayatta embriyo elde ayrıntılı olarak olgunlaşmamış zebrabalıkları oositlerin in vitro olgunlaşması ve bunların daha sonraki in vitro döllenme için bir protokol açıklamaktadır. Bu yöntem, bu tür fenotipik kurtarma ürünleri ve etiketli yapı görselleştirme ifadesi olarak Oogenezinde maternal ürünleri, fonksiyonel manipülasyonuna izin hem de birters-genetik maddeler ile gen işlevinin azaltılmasını s.

Introduction

Hayvan gelişimi esnasında, yumurtanın içine ana yatakları gen ürünleri (örneğin, RNA, protein ve diğer biyomoleküllerin); bu ürünler derhal döllenme ^{1, 2} Aşağıdaki erken hücresel süreçleri için önemlidir. Döllenmiş yumurta ³ içine reaktiflerin enjeksiyonu için bir standart yaklaşım kullanıldığında anne ürünleri ifade ve işleminin işleme tipik olarak etkisizdir. En RNA ve proteinler oogenez sırasında oositin tarafından üretilen, yani önceden yüklenmiş anne ürünler zaten olgun yumurta mevcut olmasıdır. MOs mRNA, döllenme esnasında yumurta içinde halihazırda mevcut değildir, önceden mevcut hedef protein için bu tür önceden mevcut ürünler, örneğin Morfolino antisens oligo (MOS) gen hedefleme ajanları, fonksiyonel devirme karşı dayanıklıdır. Ayrıca birçok erken embriyonik süreçler döllenme influen edilemeyecek kadar kısa bir süre sonra gerçekleşmesiRNA, embriyojenez ilk olayları etkileme yeterince hızlı üretilmiş olmayabilir olarak, döllenmiş yumurtanın içine enjekte RNA'dan türetilen protein ürünleri ced. Aynı nedenle, erken embriyo etkin rol oynayan sırasında görüntüleme zamanında üretilmiş olmayabilir döllenmiş yumurtanın içine bir mRNA enjeksiyon yoluyla ifade edilen protein füzyonlarını etiketli. Yumurta aktivasyonundan önce ekstrüde olgun oosit içine enjeksiyon mümkündür ancak benzer teknik konuları kapsamaktadır: bu olgun yumurta zaten anne protein ile önceden yüklenmiş ve bunlar yumurta sonrasına kadar (yani eksojen transkript proteini üretmek için) translasyonel olarak aktif olmazlar aktivasyonu. Bu nedenlerle, embriyojenezin ilk safhalarında hareket anne gen ürünlerinin işleme tipik olarak olgunlaşma oosit oogenezisin sırasında gerçekleştirilebilir gerekmektedir.

Solüsyonu ° olgunlaşması için izin nitro olgunlaşma yöntemleri, bu engellerin üstesinden bir yaklaşım olarak,ytes evre IV yumurta oluşumuna, zebra balığı kurulmuştur. Erken yöntemler in vitro olgunlaşma olarak izin verilir, ancak ortaya çıkan olgun yumurta döllenme ⁴ yetkili değildi. Daha sonra in vitro olgunlaşması ^{7, 8} sonra güvenilir in vitro fertilizasyon (IVF) için izin verilen balık türleri ^{5, 6} bulunan ovaryan sıvının alkalin pH, taklit pH 9.0'a nötr kültür koşulları manipülasyonu. Gerçekten de, in vitro -matured oositler ^{3, 8} verimli olan yetişkinliğe hayatta ve embriyo verebilir. Bu geliştirilmiş yöntem olup, ayrıca mat olarak yıkmak fonksiyonel aracılı MO anne genlerin fonksiyonel manipülasyon ekzojen sentezlenmesiyle zebra balığı oogenez sırasında etiketli proteinlerin ekspresyonunu ve ihtiva etmek üzere adapte edilmişuring evre IV oositler ³ (Şekil 1).

Balığı oogenez olgun oosit ⁹ (Oogenezinde çeşitli aşamalarına hızlı bir kılavuz için Tablo 1 'e bakınız) oluşumuna yol açan karakteristik bir dizi aşamadan sergiler. Kısaca, oosit gelişimi evre I oositler tarafından başlatılır ve mayoz profaz I diploten aşamasında tutuklandı. Oositler, (aynı zamanda evre II sırasında başlatılan kortikal granüller olarak da bilinir) kortikal alveollerin oluşumu (aşamaları IA ve IB sırasında başlatılan) aktif transkripsiyon yoluyla büyüme ve vitellogenez (evre III sırasında başlatılan) tabi tutulur. Oosit büyüme ı devam ettiğinde mayoz, oosit çekirdeğinin sökme sonuçlanan torbacığı (GV) olarak ifade evre IV sırasında tamamlanır. Daha sonra, mayoz metafaz II tekrar tutuklandı. Evre IV sırasında, oosit gelişimi ve mayoz arrest tamamlanması olgun evre V, örneğin yol açar⁹ g. Foliküler membran uzaklaştırılması yumurtalık ¹⁰ lümenine oositin açığa çıkmasıyla ve döllenme ve uygun yumurta aktivasyonu için gereklidir. Yumurta doğal çiftleşme sırasında anneden kalıptan edildikten sonra, aktif hale gelir. Zebrabalıkları olarak, suya maruz kalma bağımsız sperm ¹¹ varlığı nedeniyle, tam yumurta aktivasyon için yeterlidir.

İn vitro koşullarda nedeniyle şu anda birikimine büyüklüklerine (690-730 um), asimetrik bir pozisyonda geniş bir GV varlığında ve tamamen opak bir görünüm tarafından kabul edilebilir IV erken aşamada oositlerin olgunlaşması için izin tam demonte GV protein işleme ¹² (Şekil 2C) sarısı nedeniyle saydam bir görünüm ile karakterize edilen, olgun evre V yumurta sarısı -to proteinleri (Şekil 2B). Bu yaklaşımda, bütün yumurtalık devamgelişimin farklı aşamalarında Aining oosit kadınlarda kaldırılır. Oositler 17α-20β-dihidroksi-4 pregnen-3-on (DHP), etkili bir olgunlaşma indükleyici hormon ⁸ gelişmelerine izin verilmiştir. Bu süre boyunca, olgunlaşan oosit ekspresyon enjeksiyon (örneğin kapatılmış, in vitro -transcribed mRNA) ya da ters genetik maddeler (örneğin, ay) manipüle edilebilir. foliküler tabaka kendiliğinden olgunlaşma döneminin sonuna doğru dökmez, bu nedenle elle kaldırılmalıdır. Defolliculation sonra, in vitro fertilizasyon (embriyonik (E3) bir ortam içinde mevcut olan), su ¹³ yumurta maruziyeti ve sperm çözelti içinden yumurta aktivasyonunu tetiklenmesi ile elde edilir. Elde edilen zigotlar embriyo gelişimini geçmesi ve (anne gen işlevini değiştirmek için tedavilerin yeteneğinin değerlendirilmesi için ve görselleştirme ve etiketli anne ürünlerin analizi için izin Şekil 3).

Protocol

ilgili ulusal ve / veya yerel hayvan koruma organları tarafından tanımlanan tüm zebra balığı iyi bir hayvan uygulama ile tam uyum içinde ele alınmıştır ve tüm hayvan çalışmaları, uygun komite (Wisconsin-Madison güvence numarası A3368-01 Üniversitesi) tarafından onaylandı. Hayvanlar 26.5 ° C'de standart koşullar altında muhafaza edilmiştir.

Kadınların 1. Ön seçim

Not: Oositler yetişkin kadın tipik olarak aşamasından I ila V, gelişim aşamalarında bir aralığı kapsar (Şekil 2). Yeni gelişen oositler kohort ^{3, 14} olarak göründükleri gibi başarılı bir doğal çiftleşme yoluyla önceden var olan oositlerin dişileri Purging, oosit evreleme senkronizasyonunu arttırır. 8 gün sonra tasfiye içinde, en oositler in vitro olgunlaşması başlatılması için en uygun olan erken evre IV içindedir. Bu senkronizasyon oosit tha verim artarT deney idare edilmesini kolaylaştıran, in vitro olgunlaşması tam süreç boyunca gidebilir. Eşleştirilmiş çiftleşmesinden ve balık suyu bileşimi (burada balık kadar ayarlanması için önceki açıklamaları ¹³ bakınız, okyanus tuzu 14 g ters-osmoz suyu 1,000 L başına NaHCO ₃ 150 g, pH 6.5-8.5 (tercih edilen aralığı: 6.8 -7.5) ve 180-360 uS iletkenlik). Marka ve diğ. Ek tarifleri için ^13.

1. Sekiz ila on gün In vitro kültür manipülasyon öncesi, bir çiftleşme tankına istenilen türün bir adet erkek ve tek kadın balık aktarmak için bir balık ağı kullanır. Çifti birden setleri. çiftleşme tankı gecede bunları bırakın. Onları akşam sırasında ve ertesi gün öğleden yoluyla çiftleşmeye izin verin.
2. Çiftleşme sırasında yumurta verim ve ayrı tanka yerleştirin dişileri ayrı bir balık ağını kullanın. Bir gıda karışımı ile günde iki kez bu kadın Yem containituzlu su karidesi ve balık yemi pulların yaklaşık eşit miktarda ng. Gıda miktarı besleme süresi yaklaşık 20 dakika, ama fazla sağlamak için yeterli olmalıdır.

Olgunlaşma Orta 2. Hazırlık

NOT: dişi oosit çıkarılması 1 saat içinde in vitro olgunlaşması deney gününde olgunlaşma ortamının hazırlanması (bölüm 3).

1. steril koşullar altında 50 ml konik tüp, L-glutamin, pH 7.0 ile Leibovitz L-15 ortamına 20 mL ekleyin. 10 N NaOH ile pH 9.0'a getirmek.
2. 2 ayrı ayrı 50 ml konik tüplere Leibovitz L-15 ortamına, pH 9.0, 9 mL ekleyin. Etiket 1 tüp "+ DHP" ve diğer "-DHP."
3. + DHP bir tüp içinde, 17α-20β-dihidroksi-4 pregnen-3-on, 10 uL (DHP), dH ₂ O 490 uL, ve% 10 büyükbaş hayvan serum albümini, 500 uL (BSA) ilave edin.
4. -DHP bir tüp içinde, 10 mg / ml gentamisin, 400, 100 mcL81; dH ₂ O, L ve% 10 BSA, 500 uL.

3. OOSİT Diseksiyon ve İn Vitro Kültür Başlatma

NOT: In vitro kültür deneyi doğal çiftleşme yoluyla yumurta serbest 8-10 gün sonra önceden seçilmiş dişilerle gerçekleştirilir. Aynı gün yapılan olgunlaşma ortamı kullanın (bakınız bölüm 2). Diseksiyon muhtemelen doğal çiftleşme yoluyla meydana gelen süreçleri taklit (balık tesisinde önceden ayarlanmış yapay ışıkla laboratuarda belirlenen) balık gündüz döngüsü ¹³ sonuna yakın başlamış ise oositler uygun olgunlaşır. Bu balık, standart ışık döngüsüne sahip bir tesise ev sahipliği eğer protokolde en adımlar akşam yapılması gerekir ima (örneğin bir 8:00 ila 10 pm ışık süresi ile bir tesiste 6 pm adım 3.2 başlayarak), diğer çalışma zaman periyotları, uygun bir şekilde zaman kaydırmalı ışık döngüsü olası olmakla birlikte.

1. 1 M Tris, pH 9.0 ile pH 7.0'a ayarlanmış olan dH ₂ O bir% 0.2 tricaine stok çözelti hazırlayın, ve 4 ° C 'de bu çözüm tutun. Bu vaktinden hazırlanabilir.
2. imkan günlük ışık çevriminin sonundan önce deney 0-4 saat başlatın. 250 mL'lik bir beher içine, balık 80 mL su ile, 0.2% tricaine stok çözeltisi, pH 7.0, 20 mL ilave edilir ve karıştırılır.
3. tricaine çözümüne önceden seçilmiş kadın aktarın ve aşırı maruz onları euthanize. solungaç hareketi kesildikten sonra 15 dakika boyunca tricaine çözeltide dişileri bırakın.
4. Bir kaşık kullanarak, tricaine çözeltisinden ötenazi balık toplamak ve balık suda kısaca durulayın. fazla suyu emmesi için kağıt havlu üzerine balık yerleştirin.
5. pektoral yüzgeç düzeyinde ötenazi balık başını kesmek için temiz bir jilet kullanın. kesme makasları kullanılarak, anal bölgeye ön ucundan uzanan, balık ventral tarafında uzunlamasına bir kesi yapmak.
6. Olay ışığı ile bir mikroskop altında bir petri balık yerleştirin. diseksiyon forseps bir çift kullanılarak, 4 mL Leibovitz L-15 ortamı + DHP ihtiva eden bir 35 x 10 mm kültür çanağı için yumurtalık kısımları aktarın.
   NOT: Gelişmekte oosit ihtiva Yumurtalıklar, iç vücut boşluğunda opak ve clumpy yapılar gibi görünecektir.
7. diseksiyon forseps kullanarak, yavaşça foliküler kitlelerden oosit ayırmak. Sıralama erken evre IV oosit (Şekil 2B; yakın maksimum ebat GV arıza öncesi ve koyu, opak sitoplazma ve oosit içinde asimetrik bir şekilde yer kolaylıkla anlaşılacaktır GV ile karakterize edilir). Önceki aşamada (Şekil 2A) ve (DHP tedavi öncesi yumurtalıklarda Şekil 2C'de, bu ancak mevcut benzer) saydam, olgun evre V yumurtaları oosit atın.
   NOT: Oositler erken evre IV, olgun, sahne V oocyt sonuçlanır erken aşamada olgunlaşması için seçilirlerin vitro kültür koşullarında (Şekil 2C ve D) sonra es ^3. Evre IV oositler aktif ürünler üretmek olduğundan, bu aşamada işleme RNA enjeksiyon yoluyla ya da kişiye MOS ile gen fonksiyonunun indirgenmesi için ekzojen ürünlerin sentezlenmesi için izin verir.
8. 4 ml Leibovitz L-15 ortamı + DHP içeren ikinci bir 35 x 10 mm plastik kültür tabağına, erken evre IV oosit aktarmak için bir cam Pasteur pipeti kullanarak. + DHP çözeltisi içeren çanak -DHP ortamı az miktarda aktarın.

4. Yumurta Mikroenjeksiyonlar

Not: in vitro olgunlaşması ile yapılan İzole evre IV oosit fonksiyonel manipülasyon ya da etiketli protein ekspresyonu için reajanlann eklenmesi mikro enjekte edilebilir. MRNA ve MOS (bölüm 4) gibi reaktifler, bir mikro-enjeksiyon, tipik olarak, oositler in vitro Matu geçiren zaman gerçekleştirilir+ DHP ortamda katyon önce defolliculation için. Arzu edildiği takdirde, oosit olgunlaşması önce işler gerçekleştirmeden için daha fazla zaman izin vermek için, enjeksiyonlar da en az 2 saat boyunca, önceden olgunlaşmasına, -DHP ortamında gerçekleştirilebilir. Bunlar sonradan + DHP ortamına aktarılabilir.

1. Standart bir sentezleme kiti kullanılarak mRNA'lar hazırlayın. 50-500 ug / uL nihai konsantrasyonda, enjeksiyon için 100-500 pg / ml stok olarak -80 ° C'de tutun RNA dereceli su (200 ug / uL tavsiye edilir). imalatçının talimatlarına göre, su içinde bir 4 ng / uL konsantrasyonunda MOS hazırlayın. 2 ng nihai konsantrasyonlarda bunları enjekte / uL (ya da deneysel olarak belirlenmiştir).
   Not: enjeksiyon, tipik olarak (5. bölümde nota bakınız) defolliculation önce + DHP ortamında gerçekleştirilir.
2. mRNA enjekte ise, enjeksiyondan hemen önce, 0.1 M KCl bir nihai solüsyon elde etmek için RNA, dereceli ters osmoz su ve 0.2 M KCI ile mRNA seyreltin.
3. MOS enjekte ise, enjeksiyondan hemen önce, 0.1 M KCl bir nihai solüsyon elde etmek için ters ozmoz su ve 0.2 M KCI ile istenen konsantrasyona MOS seyreltin.
4. El ile ince forseps ile oosit tutun ve bir çekilmiş kılcal cam pipet ile yapılmış bir iğne kullanılarak, vahşi tip evre IV oositlerine yaklaşık 1 nL enjekte edilir.
   1. Daha önce zebra balığı erken embriyolar ¹⁵ içine standart enjeksiyon için protokoller de tarif edildiği gibi, ısıtılmış cam kılcal boruları çekme enjekte edilecek çözelti yükleme ve forseps ile iğne ucu kırılması ile cam iğneler hazırlayın.
      NOT: İğne kademeli bir şev ziyade ani bir tane sahip olması yararlı olur; Bu iğne ucu içinde mola yeri açısından daha fazla esneklik sağlar ve aynı zamanda enjekte embriyo zarar vermemek için yardımcı olur. Aynı iğne ve embriyo enjeksiyon için solüsyon kullanarak, önceden belirlenerek enjekte edilen hacim ayarlamaİstenen hacmi üretmek mikroenjektör basınç ayarları. Bu ayarlar belirlenebilir sahte-enjeksiyon, daha önce tarif edildiği gibi ^15, bir mikroskop kademesi kalibrasyon sürgünün (0.01 mm) ve enjekte edilen çözelti bolus istenen çapı elde etmek için mikroenjektör ayarlarını mineral yağ damla halinde.

5. Oosit Olgunlaştırma ve Defolliculation

NOT: oosit olgunlaşması sırasında, oosit başarılı kültür koşullarının değerlendirilmesi için izin veren giderek saydam hale gelecektir.

1. 26.5 ° C ve + DHP ortamda oosit oositler bozulmamış kalmasını sağlamak için periyodik olarak (her 30 dakika), kontrol ve kademeli olarak saydam hale gelerek doğru olgunlaşmasını geçiren (bakınız Şekil 2C) (uygun olduğunda, enjekte edildiğinde ve) ve olgunlaşmamış inkübe devam .
   1. Pasteur pipeti ile herhangi lysing oosit çıkarın ve atınBir laboratuar atık behere ortamın kalitesini korumak için. Oosit liziz miktarına bağlı olarak, berrak bir çözelti sağlamak için taze + DHP ortamının yaklaşık yarım hacme sahip bir kültür ortamının değiştirin.
   2. Oosit büyük bir kısmı saydam hale gelir ve artık belirgin bir GV sahiptir (DHP tedavisinde yaklaşık olarak 2 saat, D ile karşılaştırıldığında bakınız Şekil 2C) kadar in vitro olgunlaşması devam izin verin. geçen ışık optikli bir mikroskop altında bunları gör.
2. Her bir olgun oosit, en dış foliküler membran çıkarın. oosit ve membran arasındaki artan boşluk ile bir bölgede foliküler zarında gözyaşı yapmak için ekstra ince forseps kullanın. membranın bir kısmının kalkmasına ve soyulmuş parçası basılı tutarak membran üzerinden oosit döndürün.
   Not: Temel koryonik membran, bu işlem sırasında yumurta ile yakın ilişki içinde kalır tipik olarak; Yumurta eylemi sonrasıivation, embriyon için koruyucu bir tabaka oluşturmak için genişler.
3. (Tipik olarak en az 20 uL yaklaşık 5-10 olgun oosit transferi) orta bir minimal hacimde sonra soyuldular oosit transfer kültür (+ DHP) aracı maddesi, bir kaç damla bir petri kabı ve gübreleme ile devam edin.

In vitro kültürlü OOSİT 6. Fertilizasyon

NOT: buz üzerinde sperm çözeltisi, yaklaşık 2 saat için gücünü korur, aşağıda hazırlanan.

1. Daha önce ^{16, 17} tarif edilen şekilde, Hanks çözeltisi, 500 uL beş erkeklerden kullanılarak testisler defolliculation için oosit olgunlaştırma aşamasının sonunda ve önceden yakın sperm çözeltisi hazırlayın.
2. + DHP kültür ortamında defollikulize Oositlere sperm çözeltisi 10-50 uL ekleyin. 10 s bekleyin.
3. Bir pipet kullanarak, Oositlere embriyonik (E3) orta birkaç damla ekleyin. pl 1 dk bekleyin ve selE3 orta ile yedi.
   Not: 5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM _CaCl2, 0.33 mM MgSO ₄ ve% 1-5 Metilen Mavisi ^13: aşağıdaki gibi E3 orta bileşimi.
4. Tekrar döllenmiş embriyolar daha çok sayıda elde etmek için 5.3, 6.2 ve 6.3 adım.
5. döllenmiş embriyo geliştirmek için izin verin. Daha önce döllenme ¹⁷ ve ¹⁸ evreleme için açıklandığı şekilde, başarılı döllenme sağlamak için bölünme aşamalarında ilerlemeyi gözlemlemek için iletilen ışık optikli bir diseksiyon mikroskobu kullanın.

Results

Yukarıda anlatılan prosedür, başarılı ise, embriyolar hem de sonrası fertilizasyon (HPF), 24 saat olduğu gibi, basmakalıp erken embriyo klivaj paterni ¹⁸ görünümünü teyit etmek için bölünme aşamalarında gözlemlenebilir belirlemek için uygun gelişim teyit etmek için temel vücut planının. Bu prosedür, oosit gelişimi esnasında, mRNA ve mos gibi reaktifler enjeksiyonu yoluyla fonksiyonel çalışmalar için anne ürün müdahale edilebilmesini sağlar.

Fonksiyonel çalışmalar için anne ürünlerin manipülasyonu:

Yabani tip ve mutasyona uğramış ürünleri için mRNA kodlaması mayoz ve erken evrelerinde anne gen fonksiyonunun manipülasyon etkisini test etmek için in vitro olgunlaşması oosit içine enjekte edilebilir. Örneğin, vahşi tip embriyolar wi enjekte edilebilirld tip mRNA ürün aşırı ifadesinin etkisini test etmek için, veya mutant RNA ile bu işlemlerde olası hakim (örneğin, fonksiyon--kazanmak ve antimorphic) etkilerini test etmek için. Oogenezisin evre IV kültür koşulları başlatmak sadece oositler (olgun evre V oositlerine Şekil 2B geliştirmek, ancak in vitro kültür içinde Oositler, enjekte edilen mRNA'dan GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi, oosit gelişimi boyunca eksojen mRNA'dan proteini üretebilecek olan -2D) aynı zamanda, Nair vd.: ^3. Enjekte mRNA yoluyla vahşi tip ürününün ifadesi de ayrıca pozisyonel klonlama ^{3, 24} boyunca gen kimliği teyit etmek için ana-etki mutasyonlar kurtarılması için aracı olduğunu. Bu durumda, yabani tip mRNA vahşi tip ürünler, mutant fenotipi kurtarma olup olmadığını test etmek için, homozigoz mutant dişilerin oositlerin içerisine enjekte edilir. Bu genetik kurtarma gösterilmiş olup <AurB mRNA enjekte güçlü> Şekil 3A-3C, karşılık gelen gen, hücre adanın (cei) (Şekil 3A-3C) bir mutasyon fenotipik etkilerini kurtarmak için gösterilmiştir. Bir kontrol grubu embriyolar, karşılık gelen mutant fenotipi ³ göstermek için gelişmeye bırakıldı. Mutant RNA da Mutasyona uğratılmış ürün, vahşi tip ürünün neden olduğu edilene kurtarma derecesini karşılaştırarak kısmi fonksiyonunu muhafaza olmadığını test etmek için, mutant oosit içine enjekte edilebilir.

Gelişmekte olan oositlerin enjekte mRNA'dan Protein ifadesi, çok az veya hiç gecikme ile meydana gelir gibi görünmektedir. Güçlü GFP bağımsız oosit ³ gelişim aşamasında, karşılık gelen mRNA enjekte 2 saat içinde gözlenir (Şekil 2B-2B;. Ayrıca Nair ve diğerleri ^3). Böyle mCherry gibi ürünler:Sas6 ve Birc5b (Alacalı) GFP döllenmeden sonra ve birinci embriyonik hücre döngüsü ^{3, 25} boyunca hemen gözlenebilir. Oogenez sırasında mRNA enjeksiyonu, aynı zamanda hücre ada / aurB ^3, sonuçsuz döngü / lrmp ²⁴ maternal ürünler durumunda gösterildiği gibi, ne olursa olsun, kaynaşık etiketli yarımının, hemen sonra gübreleme fonksiyonel proteini üretimine yol açan ve alacalı / bir5b ^25. Tercüme engelleme / dhx16 ³ imkansız misyon olduğu gibi, nafile döngü / Lrmp ³ ve embriyogenez ileriki aşamalarında gösterilen MOs da hemen döllenmeden sonra bir etkiye sahiptir. olgunlaşan oositlerinde enjekte edildiğinde Bağlayıcı-bloke MOS, evre IV oositlerde olası nedeniyle zaten mevcut olgun anne transkript, anne fonksiyonu üzerinde bir etkisi olmayabilir ^3.

morphants oluşması:

önceden tanımlanan mutasyonu olan bir gene tekabül eden bir MO kullanırken, morphant fenotip fenotipe taklit etmesi beklenmektedir. Morphants MO kontrol enjekte yapılmamış embriyolar ve bir standart ile enjekte edilen karşılaştırılır. Karşılık gelen mutasyon mutant fenotipi nafile döngü (Şekil 3D-F) taklit eden oositlere Lrmp MO enjeksiyonu ile gösterildiği gibi, bir çeviri-bloke morfolino enjeksiyonu başarıyla bilinen mutant fenotipi ³ fenokopya olabilir. MOS spesifikliği (daha önce yorumlanan) embriyolara MOS ^{19, 20} enjekte kullanılan aynı yaklaşımlarla tespit edilebilir.

floresan etiketli füzyon proteinlerinin ekspresyonu:

Şekil 3G mRNA floresan protein (örneğin GFP ve mCherry) erimiş ilgi duyulan gen ürünleri kodlayan, aynı zamanda, vahşi tip ya da erken bir embriyonun içindeki karşılık gelen ürünler görselleştirmek üzere mutant oosit (yani, bir hücre içi lokalizasyonu modelini yansıtan ya da enjekte edilebilir ve 3 H). Benzer füzyonlar kodlayan ama mutant alleli içeren mRNA'lar Benzer mutasyon, herhangi bir potansiyel hücre içi lokalizasyonu etkileyip etkilemediğini test etmek üzere ifade edilebilir.

Şekil 1: İn Vitro Oosit Matürasyon. İn vitro oosit olgunlaşmasında yer alan çeşitli aşamalarım gösteren şematik diyagramı. Yetişkin dişiler için önceden seçilmiş olan yumurtlama çoktan olgunlaşmış ve pro zorunda yumurta onları temizlemek için, prosedüre 8 gün önceYeni oosit gelişimi zerre. Yumurtalıklar, gelişmekte olan oositleri içeren, kadınlarda çıkarılır ve in vitro olarak, oosit matürasyonunu teşvik hormon DHP içeren bir ortama transfer edilir. kadın ve hemen önce ya da oosit olgunlaşması sırasında çıkarıldıktan sonra, oositler maternal faktörlerin fonksiyonel manipülasyonu için RNA ürünleri ve diğer reaktifler ile enjekte edilebilir. Olgun oositler el sonra soyuldular ve döllenmiş, embriyo elde etmek için, bir sperm çözeltisi ile in vitro olarak fertilize edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

İn vitro Oosit Matürasyon ve enjekte mRNA'dan Ürünlerin İfadesi: Şekil 2. (A) yumurtalık gözlenen aşamaları I-III, oositleredişiler 4 gün sonrası temizleme (dpp). (B), kadınlarda 8 DPP yumurtalıklar gözlenen, evre IV oositlere. germinal vesicle (GV, ok başı) açıkça görülmektedir ve eksantrik bir konumda bulunmaktadır. Evre III oosit (A) 'da kolayca anlaşılacaktır GV sergiler, ancak oosit ortalanmış miktarda bulunmaktadır. (B) 'de Evre IV oositler olgun oosit (C) ile karşılaştırıldığında maksimal yakın olan bir boyuta sahiptir. (C ve D) mRNA transkripsiyonu, in vitro (Cı, görünür ışık bölgesindeki, aşama V (oosit olgunlaşması) (B) 'deki gibi, evre IV başlatılır ve GFP-kodlama olgunlaşma sırasında enjekte in vitro olgunlaşması koşullarında 2 saat sonra oositler yalnızca D, görünür ışık ve GFP floresan) arasında kaplaması. GV da evre IV oositler daha az opak evre V oosit, artık belirgindir. Enjekte edilen oositler, GFP proteini (D) ifade etmektedir. Olgun evre IV oositlerin Defolliculation des olanprotokol bölümünde açıklanan şekilde. Ölçü bar = 300 um. Tüm paneller Nair ve arkadaşları ^3'ten, izniyle, yeniden üretildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3: İn Vitro Oosit olgunlaştırma ile Manipülasyon ve Maternal ürünlerin görselleştirilmesi. (A - C) evre IV cei / aurB oositlerine vahşi tip aurB mRNA enjeksiyon yoluyla hücresel ada / aurora B bir mutasyonun neden olduğu ana-etki fenotipin kurtarma. membranlar (yeşil) vurgulamak için, anti-B-katenin antikorları ile görselleştirilmiştir 65 mpf sabit blastodiscs hayvan Gösterim gösteren birleştirilmiş görüntü, bir anti-α-tubulin antikor (mikrotübül belirtmek içinkırmızı), ve DAPI DNA (mavi) belirlemek için. Normal karık olgunlaşma gösterge vahşi tip embriyolar (A) β-katenin birikimi. (B) bir enjeksiyon yapılmamış cei / aurB evre IV oositten bir cei / aurB embriyo β-katenin birikmez kısmi temel oluklar gösterir. Yabani tip aurB mRNA çizilerde sağlam β-katenin birikimini gösteren enjekte edilen bir cei / aurB oosit (C) bir kurtarıldı cei / aurB embriyosu. (D - F) morfolino evre IV oosit içine Lrmp enjeksiyonu ile nafile döngü / lrmp bir mutasyonun neden olduğu ana-etkisi Fenokopisi. Anti-γ-tubulin antikor ile görselleştirilmiştir 70 mpf sabit blastodiscs, hayvan görüntülerini gösteren birleştirilmiş görüntü DNA (mavi) belirlemek için sentrozom (kırmızı) ve DAPI gösterir. Yabani tip embriyolar, γ-tubulin, centrosomal malzeme için bir marker ile her çekirdek ortakları (D). (Anne etki FUE mutantlarında E), pronükleer füzyon füzyonla birleştirilmemiş ana ön-çekirdek ve mayoz II polar gövdesine karşılık gelen DNA etiket iki ya da üç yamaları ile sonuçlanır başarısız olur. Lrmp morphants maternal Lrmp fonksiyonu inhibe edilir burada, çekirdekler Benzer ek olarak, γ-tubulin ile ilişkilendirmek için başarısız, bölmek için başarısız olarak (F). Erken embriyo anne üretilen ürünün (G ve H) Görselleştirme. eksojen mRNA'dan Sass6 mCherry proteini IV oosit Sentriyoller lokalize aşamasında enjekte edildi. sentrozom (yeşil) vurgulamak için, anti-γ-tubulin antikor ile görselleştirilmiştir 40 mpf sabit blastodiscs hayvan incelemeler, MCherry floresan gösteren birleştirilmiş görüntü Sass6 (kırmızı) için, ve DAPI DNA (mavi) belirlemek için. (G) Sass6 mCherry protein çekirdeği (oklar) komşu yerlerde sentrozom markör γ-tübülin etiketli odakları lokalize ifade edilir. (H ve ark Nair, izni ile yeniden üretilmiştir ^3. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Oogenez Aşamaları	Oosit çapı (um)	Anahtar dönüm (ler)
1A - Prefollicle	7-20	aktif transkripsiyon başlatma, çekirdekçik birikimi
1B - Folikül	20-140	kromozomların Dekondenzasyon
II - Kortikal alveol	140-340	Kortikal alveoller üretim
III - vitellogenez	340-690	sarısı ön-madde proteini ve lipid birikimi ooplazma sergiler koyulaşması
Erken IV - Oosit olgunlaştırma	690 730 (alt aralık)	torbacığı asimetrik yerleşimi
Erken IV - Oosit olgunlaştırma	690 730 (üst aralık)	Germinal vezikül metafaz II, tutuklama kaybolur
V - olgun oosit	~ 750	Ooplazma sergiler / sarısı saydam hale

Tablo 1: Zebra içinde Oosit Geliştirme Merkezibalık.

Discussion

Yukarıdaki protokol böylece erken zebra balığı embriyo maternal gen ürünlerinin çalışması için izin Fertilizasyondan önce gen ürünlerinin işlenmesi için olan. Daha önce yapılan çalışmalar vitro ^4'te oosit olgunlaşması mümkün olmuştur; Bu protokol, oositler ⁸ olgunlaşmış in vitro daha sonra döllenmesi amacıyla izin vermek için modifiye edilmiştir. Bu da, embriyonun erken dönemine ^3'te anne tarafından miras kalan ürünlerin fonksiyonel manipülasyon ve görselleştirme için reaktifler enjeksiyonuna olanak tanır. Bu yöntemle elde edilen embriyolar yaşayabilir olabilir ve bereketli yetişkin olmayı yaşayabilir. Sağlıklı, bereketli yetişkin (yayınlanmamış gözlemler) haline yaklaşık yarısı bu aşamada en yüzme kesesi enflasyonu ile değerlendirilen ön deneylerde, bu prosedürün türetilmiş döllenmiş embriyo yaklaşık yarısı, geliştirme 5. gününde yaşayabilir idi.

vardırkritik adımlar protokolde dikkate almak. uygun bir aşamada Oositler dişi son şeklindeki olup olmadığını zenginleştirilebilir olgunlaşmasını (erken evre IV) başlatır, ancak önce 8 DPP için. Son zamanlarda çiftleşmemiş olması balık kullanma olgunlaşma uğramayacağını yumurta ¹⁴ yozlaşan neden olabilir. Az 8 gün içinde çiftleşen dişiler evre III veya daha az yumurta çoğunluğu sağlayarak ve böylece, yumurta in vitro düzgün olgun olmayacaktır. 8 gün önce şeklindeki kadınlarda Yumurtalıkların erken evre IV oosit optimal fraksiyonu olacaktır. Bunlar opaklık ve dış merkezli bir konumda (Şekil 2B) GV mevcudiyeti ile fark edilebilir. Oosit, bir mikroskop altında kademeli bir mikrometre slayta yerleştirildi ve standart hazırlama kılavuzlar (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında ile Oosit aşaması belirlenmesi de, boyut ölçümü ile destekli olabilir. Ancak, erken evre IV oositlerin yakın maksimal boyutu olgun kıyasla sahip(göreli şeffaflık ve GV eksikliği tarafından tanınan; Şekil 2C) oositleri, genel olarak doğrudan oosit boyutu ölçüm ihtiyacını ortadan kaldırır, yukarıda tarif edildiği gibi ve kolay bir şekilde, kabul edilmektedir.

In vitro olgunlaşması dişi oosit donör ortama alıştırılır kaldığı gün ışığı döngüsü sonuna birkaç saat içinde başlaması gerekir. Oositler ışık döngüsünün sabah döneminde kültürlendirilmiş, kötü fertilizasyon oranlarında yansıyan, düzgün olgun olmayacaktır. In vitro oosit olgunlaştırma yöntemi sirkadiyen bağımlılık sebebi anlaşılacaktır ancak büyük olasılıkla oogenez ²¹ sırasında devir daim gen ekspresyonunu içeren, in vivo yumurta olgunlaşması altta yatan sirkadiyen sapmaları gösterir değildir. Uygun oosit evreleme rağmen, in vitro olgunlaşması başarılı geçmesi için başarısız oositler için yaygın bir nedeni, DHP süresi olmasıdır. DHP hormonu genellikle bir yıl sonra sona eriyor ve etkisini sigortaive olgunlaşma, işçi toplu kullanımda 9 ay içinde değiştirilmelidir.

yöntemin amacı anne ürünlerin fonksiyonel manipülasyon olduğunda oositlerin enjeksiyon başka önemli bir adımdır. Bu prosedür, 0-30 MPF'e döllenmiş yumurta standart enjeksiyonlar için farklılık gereksinimleri vardır. Oosit enjeksiyon önemli bir faktör, örneğin Leibovitz L-15 ortamına ^{22, 23} olduğu gibi, erken yumurta aktivasyonuna yol açmayan koşullar altında enjekte gerçekleştirmek için ihtiyaç vardır. onlar yumurtalıkların gömülü olduğundan, olgunlaşan oositlerin da enjeksiyon bazı özel zorluklarla. Protokol Yukarıdaki ilk yumurtalık oosit ayrışan ve daha sonra enjekte ederken her bir forseps ile ayrı ayrı oosit ayrışmış tutma göstermektedir. Bu teknik, minimum tutma ile uygun bir aşamada ön ayırma oosit iyi çalıştı ve olanak sağlamaktadır. Alternatif yöntemler de kullanılabilir, örneğini) standart enjeksiyon halinde yerleştirilmesi oositler agaroz, in vitro bir matürasyon ortamında muhafaza ederken bu alternatif yöntemde çukur destek enjeksiyonu sırasında, oosit dikey duvarlarının (oositler enjeksiyon plakalara transfer gereken ¹⁵⁾ ve ii oluklara: olarak ) oositler, oositler, her iki için enjeksiyondan sonra ayrışmış gerekmektedir Bu yaklaşımda enjekte oosit ile temas (önlemek için enjeksiyon sırasında forseps ile tutulabilir yumurtalık kütle, bağlı DHP kalmasını kolaylaştıracak kalması ve defolliculation izin vermek için izin kendisi IVF için gerekli). Bu aşamada koryonik membranı tamamen ⁹ gelişmiş değildir, çünkü bu özel sorun olmasına rağmen, evre IV oositleri kolaylıkla bir enjeksiyon iğnesi ile muhtemelen nüfuz edilebilir.

Mevcut olgunlaşma protokolünün bir sınırlama in vitro olgunlaşması koşullarında uygun oosit gelişimi teşvik bu yanioosit olgunlaştırma aşaması IV daha erken aşamalarda başlatıldığında oluşturulamaz. Oositler bunlar (340 ila-690-mikron aralığına karşılık gelen vitellogenez) evre III sırasında ortaya 520 um bir çapa, ulaştıklarında olgunlaşmasını geçerek DHP yanıt hakim olmak ^9. Bununla birlikte, döllenme ³ yetkili olmayan oositlerde evre III oosit sonuç kültürü. Ürünü sadece in vitro kültür aşaması IV (Şekil 2B) başlatılır, olgun, evre V oosit (Şekil 2C ve D) dönüşebilir oosit. Bu evre III vitellogenez ve oosit gelişimi ⁹ için gerekli olmasından ile ilişkili olabilir. Bu nedenle, bu yazıda, in vitro oosit olgunlaştırma işlemi sadece IV oosit (B) ve en erken aşamalarında oosit (etaplı bir tablanın bir başlangıç popülasyonu ile kullanılmalıdır - III; Figür E 2A). Aynı nedenle, bu prosedür aşaması IV ya da daha az ifade edilen genlerin sınırlıdır. Ürünler daha önce ifade edilen genlerin işlevsel manipülasyonu yerine genetik yöntemlerde (aşağıya bakınız) dayanmak zorunda olabilir. In vitro kültür olgunlaşma yöntemlerine İyileştirmeler gelecekte bu nedenle in vitro olgunlaşma yaklaşımın gücünü genişleterek, daha erken aşamalarda oosit Kulturlemenin başlatılması için izin verebilir.

Yöntemin bir başka sınırlama gübreleme dahil sonraki aşamalar için gerekli olduğunu defolliculation şu anda, prosedürde hız sınırlayıcı bir adımdır olup. foliküler membran Gelişen oositi çevreleyen şeffaf bir katman, ve kaldırma sıkıcı olabilir. Bu zar tam kaldırılmazsa, yumurta tam etkinleştirilmiş ve döllenmiş olmaz. Bu genişletmek için koryon yetmezliği ve düzensiz yerleştirilmiş, karık benzeri st gelişimi ile belirgin yapılırdöllenmemiş embriyoların ¹¹ karakteristik sı (pseudocleavages). Xenopus kullanılan kolajenaz gibi enzimatik defolliculation yöntemleri, denenmiştir. Ancak, bizim elimizde, bu teknik başarılı olmamıştır, ve bu yüzden manuel defolliculation güveniyor. Manuel defolliculation emek yoğun ve zaman alıcı olduğundan, in vitro oosit olgunlaşması sonra döllenmiş yumurtaların büyük gruplar elde etmek zordur. Nedeniyle manuel defolliculation dayattığı zamansal sınırlama, şu anda 5-10 yumurta küçük gruplar halinde, bir seferde birkaç defolike, olgun yumurtaları döller. Bu prosedür ile enzimatik defolliculation dahil edilmesi olası önemli ölçüde verim ve genel kullanım kolaylığını arttırır.

In vitro -matured fertilizasyonu sonra üretilen embriyolar canlı yetişkinler olmakta, ancak biz IVF sonrası, embriyoların bir kısmı bunu unutmayın Normalde ya zamanında bölmek değil. Biz şu anda, yayılma bu yöntemle elde edilen embriyolar gelişme daha sağlam desen neden olabilir, in vitro oosit olgunlaşma mermi içerir hatları için seçiyoruz.

Prosedür mutasyonlar ^{24, 25,} bir dizi için açık kurtarma veya protein lokalizasyonu görselleştirme için izin verdi. Enjekte mRNA tarafından ifade edilen ürünler değişik sonuçlar ²⁶ yol açabilir, fakat bazı genler için, ürün ekspresyonunun düzenlenmesi, çok önemli olabilir. Tüm kontroller (örneğin, sadece nötr proteinleri kodlayan bu tür kontrol mos gibi bir etki gösterdi henüz tahmin edilmektedir deneyde kullanılanlara benzer özelliklere sahip reaktifler veya RNA'lar ile enjekte edilen embriyolar, bu tür dikkatli olmak da önemlidir GFP gibi), altta yatan değişkenlik uygunsuz sonuçlara neden olabileceğinden.

nt "> döllenme ve ardından in vitro yönetimini içeren bir yaklaşım, etkili bir şekilde ürünleri azaltmayabilir döllenmiş yumurtanın içine RNA, MOS veya proteini enjekte standart yöntem zaten yumurta biriken anne biriken ürün, durumunda özellikle faydalıdır. örneğin CRISPR yer mutant oluşumu gibi diğer son zamanlarda geliştirilen yöntemler, aynı zamanda, maternal olarak ifade edilen genlerin ²⁶ mutant koşulları oluşturmada etkilidir. Bununla birlikte, bu yöntem, çeşitli balık nesillerin gelişimini gerektirir., in vitro oosit olgunlaştırma tekniği hızlı fonksiyonel müdahaleye imkan verir kurtarma ve anne-etki mutasyonların fenokopisi, hem de erken embriyo RNA ve protein ekspresyonu dahil olmak üzere, maternal olarak ifade edilen genlerin, fonksiyonu çalışma.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebra balığı çiftleşme kutuları	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl< sub>2	Sigma	C7902
MgSO2-7H2O	Sigma	63138
NaHCO2	Sigma	S5761
Trikain	Batı Kimyasal	Trikain-D (MS 222)	FDA onaylı (ANADA 200-226)
Tris tabanı	Sigma	77-86-1,	1 M Tris pH 9.0 hazırlamak için
HCl	Sigma	920-1	hazırlamak için 1 M Tris pH 9.0
Balık ağı (ince ağ) (4 - 5 inç)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	ThatFishThatPlace'de mevcut
Plastik kaşık			çoğu standart mağazada mevcuttur
Diseksiyon makası	Güzel Bilim Araçları	14091-09
Diseksiyon forseps	Dumont	SS	Güzel Bilim Araçlarından temin edilebilir
Diseksiyon stereoskopu (iletilen ışık kaynağı ile)	Nikon	SMZ645	veya eşdeğeri
Yansıtıcı ışık kaynağı (LED kollar)	Fostec	KL1600 LED	veya eşdeğeri
Petri plakaları 10 cm çapında			herhangi bir yapıcı
Eppendorf tüpleri 1,5 mL			herhangi bir yapıcı
Buz kovası			herhangi bir yapımcı
Dar spatula	Fisher	14-374
Depresyon cam plaka	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	Fisher Scientific'ten temin edilebilir
Kağıt havlular			herhangi bir yapımcı
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	Fisher Scientific Timer'dan temin edilebilir
kronometre			herhangi bir yapımcı
Yıkama şişesi	Thermo Scientific	24020500	Fisher Scientific
beherers, 250 mL (2)	Corning Inc.'den temin edilebilir.	1000250	Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 orta boy	Thermofisher	11415064
NaOH	PH'lama için	Sigma	221465
BSA	Sigma	A2058
17alph-20beta-dihidroksi-4-pregnen-3-on (DHP)	Sigma	P6285
gentamisin	Sigma	G1272
Enjeksiyon Aparatı	Eppendorf	FemtoJet	veya enjeksiyon
iğneleri için eşdeğer Kılcal Boru	FHC	30-30-1	veya eşdeğeri, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm iç çap elyaflı, 100 mm
İğne çektirme	Sutter Aletleri	Model P-87	herhangi bir yapıcı
Mikropipetör (1 - 20 & mikro; L serisi) uçları			herhangi bir yapıcı
Mikropipetör (20 - 200 & mikro; L serisi) uçları			herhangi bir yapıcı
Mikropipetör (100 - 1000 & mikro; L aralığı) uçlu			herhangi bir yapıcı
Konik tüpler 15 mL			herhangi bir yapıcı
Konik tüpler 50 mL			herhangi bir yapıcı
plastik pipet 10 mL ampullü			herhangi bir yapıcı
plastik pipet 20 mL ampullü			herhangi bir yapıcı
Mikroskop aşaması Kalibrasyon Slaytı 0,01 mm	AmScope	MR095	veya
Balık suyu için eşdeğer Reaktifler:
Anında Okyanus Tuzu	Drs. Foster & Demirci	CD-116528
Sodyum bikarbonat (hücre kültürü test edilmiştir)	Sigma	S5761-1KG
E3 ortamı için Reaktifler:
NaCl	Sigma	S5886-1KG
KCl	Sigma	P5405-500G
CaCl < alt>2 < / alt >, dihidrat	Sigma	C7902-500G
MgSO4< / sub>, heptahidrat	Sigma	63138-250G
Metilen Mavi	Sigma	M9140-25G
Balık Yemi:
Dondurulmuş salamura	Salamura Karides Doğrudan	FBSFKG50
Tetramin Gevreği	Drs. Foster & Demirci	16623