Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve In Situ Proximity ligasyon Testi

Özet

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Özet

Protein-protein etkileşimleri binlerce hücresel süreçte yer alır ve farklı mekansal bağlamda gerçekleşir. Geleneksel olarak, ko-immünopresipitasyon, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için popüler bir tekniktir. Sonraki Western blot analizi, ko-immünopresipite proteinleri görselleştirmek için en yaygın yöntemdir. Son zamanlarda, yakınlık ligasyon testi, protein-protein etkileşimlerini yerinde görselleştirmek için güçlü bir araç haline gelmiştir ve bu yöntemle protein-protein etkileşimlerini ölçme imkanı sağlar. Konvansiyonel immünositokimyaya benzer şekilde, yakınlık ligasyonu test tekniği de antijenlere primer antikorların erişilebilirliğine dayanır, ancak bunun aksine, yakınlık ligasyon testi, yuvarlanan daire PCR'yi içeren benzersiz bir teknikle protein-protein etkileşimlerini tespit ederken, konvansiyonel immünositokimya sadece proteinlerin birlikte lokalizasyonunu gösterir.

Nükleer faktör 90 (NF90) ve RNA bağlayıcı motif protein 3 (RBM3) daha önce etkileşen ortaklar olarak gösterilmiştir. Ağırlıklı olarak çekirdekte lokalize olurlar, ancak aynı zamanda sitoplazmaya göç ederler ve sitoplazmik bölmedeki sinyal yollarını düzenlerler. Burada, hem çekirdekte hem de sitoplazmada NF90-RBM3 etkileşimini ko-immünopresipitasyon ve yakınlık ligasyon testi ile karşılaştırdık. Ek olarak, bu iki tekniğin protein-protein etkileşimlerinin mekansal dağılım ve protein-protein etkileşimlerinin özellikleri açısından görselleştirilmesindeki avantajlarını ve sınırlamalarını tartıştık.

Giriş

Nükleer faktör 90 (NF90) interlökin-2 sonrası transkripsiyonu ve miRNA biogenez ^1-3 düzenlenmesi viral enfeksiyona yanıt, yönetmelik dahil olmak üzere sayısız fonksiyonları ile çok izoformu proteindir. RBM3 bir RNA bağlayıcı protein, çeviri ve miRNA biyogenezine katılan ve hipotermi ve hipoksi ^4-6 dahil olmak üzere çeşitli stres tarafından uyarılan edilebilir. Son zamanlarda, bir protein kompleksi ⁷ NF90 ve RBM3 bulundu. NF90 ve RBM3 etkileşimi katlanmamış bir protein tepki ⁷ protein kinaz RNA gibi endoplazmik retikulum kinaz (PERK) aktivitesini modüle etmek için gereklidir. NF90 ve RBM3 Hem çekirdekte ama sitoplazma içine küçük bir NF90 oranı ve RBM3 mekik ağırlıklı olarak bulunduğu ve PERK aktiviteyi düzenleyen, özel fonksiyonlar için birbirlerine orada örneğin bağlama vardır. Nedenle, yeni gösterebilir, hücre içi bölmeye NF90-RBM3 etkileşimleri dağılımını görselleştirmek için önemlidirİlgili bölmeye onların çeşitli rolleri.

Yıllar önce, maya iki hibrid (Y2H) iki protein ⁸ arasındaki etkileşimi saptamak için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, erimiş proteinleri yapay bir yapı için, yanlış pozitif sonuçlar, bu yöntemin uygulanmasını sınırlamıştır. Uzun bir süre, ko-immünopresipitasyon özellikle endojen koşullarda ^9, protein-protein etkileşimleri analiz etmek ana tekniktir. Süper hassasiyet ve kesinlik arzu edildiğinde kütle spektrometresi kullanılır ise birlikte imüno-çökeltilmiştir protein kompleksi analiz etmek için, Batı benek, en uygun bir tekniktir. Son yıllarda, proksimite ligasyonu deney yerinde ^10,11 hem hücre ve dokularda protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için yeni bir yöntem olarak geliştirilmiştir.

Burada, NF9 yakalayan en popüler ko-immünopresipitasyon yöntemi ve nispeten yeni yakınlık ligasyonu tahlil yöntemi karşılaştırıldısub-hücresel fraksiyonlarında, 0 RBM3 etkileşimi. Biz de avantajları ve her iki tekniğin sınırlamaları tartışılmıştır.

Protokol

1. ko-immünopresipitasyon

1. Tohum bir 6-yuvalı plaka içindeki oyuk başına 2 x 10 ⁵ hücre HEK293 hücreleri 2 mi,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ilave 100 U / ml penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda .
2. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat boyunca hücrelerin büyütün.
3. soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez hücreleri yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri.
4. ticari nükleer ve sitoplazmik çıkarma reaktifler kullanılarak nükleer ve sitoplazmik kesirler hazırlayın. bazı değişikliklerle üreticinin talimatı uygulayın.
   1. Bir ko-immünopresipitasyon deneyi (bir 6-yuvalı plaka 3 kuyu ile yaklaşık olarak% 90 oranında konfluent) 3 x 10 ⁶ hücre kullanın. en yüksek hızda 15 saniye için 300 ul soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi (CER I) ve vorteks ekleyin.
   2. Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. İnkübasyon, vorte sırasında5 s her 10 dakika için, x.
   3. 5 saniye boyunca 16,5 ul soğuk sitoplazmik ekstraksiyon çözeltisi II (CER II), girdap ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
   4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,000 x g'de 5 saniye ve santrifüj vorteksleyin.
   5. Yeni bir ön-soğutulmuş tüp içine süpernatant (sitoplazmik ekstresi) aktarın ve kullanılıncaya kadar buz üzerinde tutmak.
   6. Her zaman yukarı pipetleme ve beş kat aşağı 1 ml soğuk PBS ile çözülmez topakları (içeren çekirdekleri) üç kez yıkayın. yıkamadan sonra PBS kaldırmak.
   7. 15 saniye süre ile 150 ul soğuk çekirdek ekstraksiyon çözeltisi (EŞ), girdap ekleyin ve buz üzerinde 1 saat inkübe edilir. İnkübasyon sırasında, 15 saniye ve pipet 200 ul ucu ile 10 kez, her 10 dakika boyunca vorteks.
   8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de 15 saniye vorteksleyin ve santrifüjlenir.
   9. Yeni bir ön-soğutulmuş tüp içine süpernatant (nukleer extract) transfer kullanana kadar buz üzerinde tutmak.
5. Her girdi olarak nükleer ve sitoplazmik özler hacminin% 10 çıkar.
6. bir1 ml'lik bir son hacme kadar geri kalan özler, soğuk PBS dd. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin.
   Not: Protein G-konjuge manyetik boncuklar kullanıldığında Ön temizleme gerekli değildir. Arka plan yüksek, ancak, 40 ul protein G-konjuge manyetik boncuk (% 50 bulamaç) ve, bir döndürücü üzerinde 30 dakika boyunca 4 ° C'de bu aşama lizat seyreltilmiş 1 ml inkübe edilerek ön temizleme yapar. Manyetik raf ile boncuklar ayrı süpernatant (önceden temizlenmiş lizat). boncuk atın.
7. Protein G-konjuge manyetik boncuklar ile çift primer antikor için, 4 ug tavşan poliklonal anti-RBM3 antikoru veya tavşan IgG (negatif kontrol), 200 ul PBS artı Tween 20 tamponu ile Protein G-konjuge manyetik boncuk (% 50 çamurlu) ul 40 inkübe (PBST,% 0.02 Tween 20) ile, bir döndürücü üzerinde 40 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT).
8. Ayrı bir manyetik raf ile boncuk ve süpernatant antikor birleştiğinde, ve supernatant atın. 200 ul PBST (% 0.02) ile bir kez boncuk yıkayın.
9. 1 eklemi tanelere lizatları (ya da gerektiğinde, önceden temizlenmiş lizatları halinde) ile seyreltildi ve gece boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
10. Ertesi gün, bir manyetik raf boncuk ve süpernatant ayırın ve supernatant atın. 20 rpm sabit bir hızla, bir döndürücüde 4 ° C de, her bir tüp için 0.5 mi PBST (% 0.02) ile 3 x 10 dakika yıkanır.
11. 40 ul numune tamponu (1 x ticari numune tamponu ve 50 mM 1,4-ditiyotreitol (DTT)) eklenerek boncuk proteinleri Zehir. 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtın. Yeni 1.5 ml tüp aşağı Spin ve taşıyıcı sıvılar.
12. 10 dakika boyunca 70 ° C'de ve ısı (1 x ticari numune tamponu ve 50 mM DTT nihai konsantrasyon) numune tampon maddesi girdi lizatları seyreltilir. Bir prekast% 4-12 bis-Tris jel son adımdaki yük giriş ve immunoprecipitated proteinler. Her çukurun yükleme hacmi 20 ul aşmamalıdır. 35 dakika boyunca buz üzerinde 1 x ticari çalışan tamponu içinde elektroforez gerçekleştirin.
    NOT: Yük nükleer ve sitoplazmik özühücrelerin aynı başlangıç ​​miktarını yansıtır 2 (v / v), 1 bir oranda s.
13. 4 ° C'de 2 saat süre ile 30 V 1x ticari transfer tampon maddesi içinde PVDF membrana transfer proteinleri.
14. % 5 blok membran bir karıştırıcıda 40 dakika boyunca oda sıcaklığında PBST süt (% 0.1 Tween 20) yağsız.
15. gece boyunca 4 ° C'de PBST (% 0.1): Primer antikor ile membran (1000 de 1 seyreltilmiş) inkübe edin.
16. bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında PBST (% 0.1) ile 3 x 10 dakika yıkanır.
17. 1 saat boyunca oda sıcaklığında PBST (% 0.1): (5.000 iki 1'de seyreltilmiş) yaban turpu peroksidaz (HRP) ile membran inkübe anti-fare ya da anti-tavşan sekonder antikor ile konjüge edilmiş.
18. bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında PBST (% 0.1) ile 3 x 10 dakika yıkanır.
19. ^Cm2 zar başına 0.2 mi zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma (ECL) substrat karışımı kullanarak, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. kırmızı ışık hariç itibaren bu adımdan tüm ışık kaçının.
20. Sıvı atın ve bir film kaseti içinde bir X-ışını filmine maruz kalmaktadır. Bir otomatik film pr kullanarak filmi geliştirmekocessing makinesi.

2. İmmünositokimya ve Proximity ligasyon Testi

1. Tohum 0.4 ml DMEM içinde bir 8 bölmeli poli-D-lizin kaplı slayt bölme başına 1,5 x 10 ⁴ hücre HEK293 hücreleri,% 10 FBS ve 100 U / ml Pen-Strep ile takviye edilmiştir.
2. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat boyunca hücrelerin büyütün.
3. Aspire ortamı ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile hücrelerin tespit.
4. Aspire PFA ve odasının başına 0.5 ml PBS ile yıkama 3 x 10 dk.
5. Permeabilize ve 1 saat oda sıcaklığında PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve% 5 normal keçi serumu (NGS) blok hücreleri.
6. gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 5 NGS primer antikorlar ile inkübe edin. Fare monoklonal anti-NF90 antikoru ve tavşan poliklonal anti-RBM3 antikoru 1 seyreltin: PBS içinde 100 çift boyama. Negatif kontrol için, bağımsız bir şekilde, iki birincil antikor ya da ihmal ve üçüncü kontrol antikorları sayın.
   NOT: Ticari engelleme ve seyreltilmesi reaktifleri kullanmayın.
7. bölme başına 0.5 ml PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır.
8. Immünsitokimya veya yakınlık ligasyon tahlil protokolleri tabi
   1. İmmünositokimya
      1. 1 ile inkübe: 500 seyreltilmiş, yeşil fluoresan boya-bağlı anti-fare ve kırmızı fluoresan boya-bağlı anti-tavşan sekonder antikor, oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. itibaren bu aşamada ışık kaçının.
      2. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde 5000: 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) ile karşıt çekirdekler 1 seyreltilmiştir.
      3. bölme başına 0.5 ml PBS ile 3 x 10 dakika yıkanır.
      4. cam slayt ve kuru gelen odaları çıkarın. slayt başına orta montaj, 250 mikronun ile monte edin.
   2. Yakınlık ligasyon tahlili
      1. yakınlık ligasyonu tahlil probları hazırlayın. Karıştır ve th lige farklı oligonükleotidler ile bağlı iki proksimite ligasyonu deney probları (anti-fare ve anti-tavşan sekonder antikor seyreltikBir 8 bölmeli slayt ^(cm2 başına yaklaşık 40 ul 320 ul toplam hacimde PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 5 ile% 5 NGS): iki ligasyon çözeltisi içinde oligonükleotit), her iki 1 kaba ilaveli . 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      2. cam slayt odaları çıkarın ve sulandırılmış probları ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir inkübatörde inkübe edin.
      3. ligasyon çözeltisi hazırlayın. 8 ligaz ul karıştırın 64 ul 5 x ligasyonu stok ve 248 ul H ₂ O
      4. slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tampon A 2 x 5 dakika yıkayın (takımla birlikte verilmektedir).
      5. Ligasyon çözeltisi ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de nemli bir inkübatörde inkübe.
      6. amplifikasyon çözüm hazırlayın. Itibaren bu aşamada ışık kaçının 4 ul polimeraz, 64 ul 5x büyütme stok ve 252 ul H ₂ O karıştırın.
      7. slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tamponu A'da 2 x 2 dk yıkama
      8. amp eklelification çözeltisi ve 100 dakika için 37 ° C 'de karanlık bir nem inkübatöründe inkübe edin.
      9. slayt sıvıyı dokunun ve 1x Yıkama Tamponu B 2 x 10 dakika yıkayın (takımla birlikte verilmektedir). 0.01x Yıkama Tamponu B'de 1 dakika yıkayın
      10. slayt kurutun ve slayt başına (DAPI ile) ticari bir montaj orta 250 ul monte edin.
9. 10X mercek lens ve 20X objektif lens kullanarak bir mikroskop altında floresan sinyalleri inceleyin. CCD kamera ile görüntüler elde.

Sonuçlar

Şekil 1, NF90 ve RBM3 hem çekirdek proteinleridir ve sadece küçük bir fraksiyonu sitoplazmada mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle, RBM3 için pozitif boyandı üç farklı bant vardır. sadece 20 kDa altında küçük RBM3 doğru boyutunu yansıtır (RBM3 tahmin molekül ağırlığı 17 kDa olan). iki bant kökeni araştırılması devam etmektedir. yem protein olarak RBM3 ile ko-immünopresipitasyon deneyleri NF90-RBM3 etkileşimleri çekirdek ve sitoplazmada bir azınlık ağırlıklı mevc...

Tartışma

Her iki yöntem için çeşitli faydalar yanı sıra eksiklikler vardır. nispeten yeni bir teknik olarak, yakınlık ligasyon tahlili açık bir avantajı, tek hücre düzeyinde yerine heterojen bir hücre yığın protein-protein etkileşimlerini aydınlatmak için fizibilite olup. Yüksek büyüklükte ve (konfokal mikroskop ile) çözünürlükte Görüntüler tek floresan noktalar sayarak ölçümü için olanak sağlamaktadır. Buna karşılık, Western Blot ile ko-immünopresipitasyon tekniğinin geleneksel kombinasyonu sadece uygun bir yükleme kon...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartalı' s Orta (DMEM)	Sigma	D6429	Yüksek glikoz 4,500 mg / L
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10270106
Penisilin-Streptomisin (PenStrep)	BioConcept	4-01F00-H
NE-PER Nükleer ve Sitoplazmik Ekstraksiyon Reaktifleri	Thermo Fisher Scientific	78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Carl Roth	6908.3
Dynabeads Protein G	Novex, Thermo Fisher Scientific	10003D
DRBP76 (NF90 / NF110) antikoru	BD Transdüksiyon Laboratuvarları	612154	WB için 1: 1.000 ve ICC / PLA için 1: 100
kullanır RBM3 antikoru	ProteinTech	14363-1-AP	WB için 1: 1.000 ve ICC / PLA için 1: 100 kullanır
Lamin A / C antikoru	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	#2032	WB için 1:1,000 kullanın
anti-GAPDH antikoru	Abcam	ab8245	WB için 1: 1.000 kullanır;
normal tavşan IgG	Santa Cruz	sc-2027
anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı ikincil antikor	Hücre Sinyal Teknolojisi	# 7074	WB için 1: 5.000 kullanın;
anti-fare HRP ikincil antikoru	Carl Roth	4759.1	WB için 1: 5.000 kullanın.
Berraklık Western ECL Kurutma Yüzeyi	Bio-Rad	#1705060
NuPAGE Novex %4-12 Bis-Tris Jel	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE MES SDS Çalıştırma Tamponu (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0002
NuPAGE Aktarım Tamponu (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membran	GE Healthcare Yaşam Bilimleri	10600021
Poli-D-Lizin 8 Kuyu Kültür Slaytı	Corning BioCoat	354632
Paraformaldehit (PFA)	Sigma	P6148
Normal keçi serumu (NGS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	PCN5000
Keçi anti-fare IgG (H + L Antikoru), Alexa Fluor 488 eşlenik	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Keçi anti-tavşan IgG (H + L Antikoru), Alexa Fluor 568 eşlenik	Thermo Fisher Scientific	A-11011
4 & prime ;, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)	Sigma	D9542
Duolink PLA  prob Anti-tavşan EKSİ Sigma		DUO92005
Duolink Algılama Reaktifleri Kırmızı	Sigma	DUO92008
Duolink Yıkama Tamponları Floresan	Sigma	DUO82049
DAPI Sigma ile Duolink Montaj Ortamı		DUO82040
Mowiol 4-88	Sigma	81381
Mikroskop	Olympus	AX-70
CCD kamera	SPOT	Insight 2MP Firewire
X-ray filmi	Fujifilm	Super RX
Film işleme makinesi	Fujifilm	FPM-100A