Tek memeli hücrelerini sıralamak ve her hücrede ilgilenilen 96'ya kadar hedef genin ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mutlak transkript sayılarının tahminini sağlamak için dahili qPCR standartlarının kullanılmasını içerir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil
Bu makalede
Özet
Özet
Toplu hücre popülasyonlarından elde edilen gen ekspresyon ölçümleri, bu popülasyonlar içindeki tek tek hücrelerin önemli transkriptomik varyasyonunu gizleyebilir. Tek hücreli gen ekspresyonu ölçümleri, gen ekspresyonundaki gürültünün rolünü değerlendirmeye, gen çiftlerinin ekspresyonundaki korelasyonları tanımlamaya ve bir uyarana farklı tepki veren hücre alt popülasyonlarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Burada, doku kültüründe büyüyen bir popülasyondan izole edilen tek memeli hücrelerinde 96'ya kadar genin ekspresyonunu ölçmek için bir prosedür açıklıyoruz. Hücreler, floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) ile lizis tamponuna sıralanır ve ilgilenilen mRNA türleri ters kopyalanır ve amplifiye edilir. Gen ekspresyonu daha sonra, bir seferde 96 numuneye kadar 96'ya kadar qPCR testi gerçekleştiren bir mikroakışkan gerçek zamanlı PCR makinesi kullanılarak ölçülür. Ayrıca, her bir transkriptin mutlak sayısının tahmin edilmesini sağlamak için PCR amplikon standartlarının oluşturulmasını ve kullanılmasını da açıklıyoruz. Tek hücrelerde gen ekspresyonunu ölçmenin diğer yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, RNA-Seq'ten daha düşük bir maliyetle RNA FISH'ten daha farklı transkriptlerin nicelleştirilmesine izin verir.
Giriş
Nüfusu tek tek hücrelerin tek tip bir fizyolojik uyarıcı, 1, 2, 3, 4 çok farklı tepkiler gösterebilirler. Bir popülasyonda hücrelerin genetik varyasyonu bu tepkilerin çeşitli mekanizmalardan biri olmakla birlikte, daha hücre klonal popülasyonunda, yanıtların çeşitliliğini artırmak olmayan çeşitli genetik faktörler de vardır. Örneğin, tek tek proteinlerin ve diğer önemli sinyal molekülleri seviyeleri, aşağı doğru gen sentezleme profillerinin değişimine yol açan, bir hücre tarafından hücre bazında değişebilir. Buna ek ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Ön Hazırlık
- kimin ifadesi ölçülecek ilgi 96 genlerine kadar seçin.
Not: Bu genlerin en az bir tür ACTB ya GAPDH gibi, "ev bakıcısı geni", bir olmalıdır Bu deneyde kullanılan koşullar altında nispeten yüksek ve sabit bir seviyede eksprese edildiği bilinmektedir. Bu gen, pozitif kriteri kuyu (aşama 8.1) ve çoğaltılan örnekleri (aşama 10.1) belirlemek için kullanılır.
Not: Bu örnek deney için, bilinen fonksiyonlar 11, 14 ve bir ev bakıcısı kontrol seçilir gibi GAPDH çeşitli p53, doğrudan hedeflerin yanı sıra ile karakterize edilir. hedef genlerin ve bu çalışmada kullanılan astar dizil....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol genel bir bakış hücre tedavisi, FACS ile tek hücrelerin izolasyonu için adımları da dahil olmak üzere Şekil 1 'de gösterilen üretim ve tek hücre lizatları, tek hücreli bir cDNA kütüphanelerinin onay cDNA kütüphanelerinin ön amplifikasyon sıralı oyuklar ve qPCR gen ifadesinin ölçümü.
tek hücre izolasyonu ve gen ekspresyon analizi için hazırlanırken, ilk önce her bir ilgi hedef genin geçerli oligonü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu kültür içinde yetiştirilen yapışan hücreler popülasyonundan tek tek memeli hücrelerini izole etmek için, her hücrede yaklaşık 96 gen ekspresyonunu analiz etmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem iyi çalışması için iyi bir ön hazırlık çok önemlidir. primerler tek hücreli ölçümlerin kalitesini belirlemek olarak, özellikle ilgi transkriptleri (1.2-1.3 adımlar) özgü tasarımı ve test primer çiftleri, zaman alıcı ama önemli adımlardır. güvenilir bir primer çiftleri elde edildikten sonra, bu ilgi transkript cDNA yı çoğa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında hücre sıralama yapmadan onu yardım için CCR ETIB Sitometrisi Core V. Kapoor teşekkür etmek istiyorum. Biz de bu protokolün geliştirilmesi sırasında qPCR performans onların yardım M. Raffeld ve CCR LP Moleküler Tanı Ünitesi ve J. Zhu ve NHLBI DNA Dizilimi ve Genomik Çekirdek teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| RNase İnhibitörü | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz ile Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT Yüksek Hassasiyetli dsDNA Test Kiti | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0 ml düşük yapışmalı mikrosantrifüj tüpleri | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Süspansiyon Tamponu | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2 ml Maxymum Geri Kazanım İnce Duvar PCR Tüpleri | Corning | PCR-02-LC | |
| GE 96.96 Dinamik Dizi DNA Bağlayıcı Boya Örneği & Test Yükleme Reaktif Kiti | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 ortamı | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | SH30027.01 | |
| Fetal Sığır Serumu, Sertifikalı (ABD) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiyotik-Antimikotik Çözelti | Corning | 30-004-CI | |
| Neokarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELİMİNaz | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect Tek Adımlı qRT-PCR Kiti | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sızdırmazlık Filmi, Steril | Excel Bilimsel | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biyolojik Bilimler | ||
| HyClone Tripsin% 0.05 | GE Sağlık Yaşam Bilimleri | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 & mikro; m Hücre Süzgeci | Corning | 352340 | |
| Eksonükleaz I | New England BioLabs | M0293S | |
| Bio-Rad | SsoFast EvaGreen Supermix | 172-5210 | |
| 96.96 Gen İfadesi için Dinamik Dizi IFC (mikroakışkan qPCR çipi) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Kontrol Cihazı HX (yükleme makinesi) | Fluidigm | ||
| BioMark veya BioMark HD (mikroakışkan qPCR makinesi) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analiz yazılımı | Fluidigm | ||
| MATLAB yazılımı | MathWorks |
Kaynaklar
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
