Yöntem makalesi

İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

DOI:

10.3791/55222

⸱

20 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Allergy Unit, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, 2Division of Medicine, Department of Public Health and Clinical Medicine, Umeå University, 3Divison of Infectious Diseases, Department of Clinical Microbiology, Umeå University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsanlardaki dendritik hücreler (DC'ler) dahil olmak üzere akciğerde yerleşik bağışıklık hücreleri, solunan patojenlere ve alerjenlere karşı savunma için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, insan akciğer dokusunun kıtlığı nedeniyle, çalışmalar sınırlıdır. Bu çalışma, immünohistokimya ve akış sitometrisi kullanarak akciğer DC'lerini incelemek için insan mukozal endobronşiyal biyopsilerini işlemek için protokoller sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğerler sürekli olarak zararsız partiküllerin yanı sıra patojenler, alerjenler ve toksinler de içeren dış ortama maruz kalır. Toleransı korumak veya bir bağışıklık tepkisini indüklemek için, bağışıklık sistemi inhale antijenleri uygun şekilde kullanmalıdır. Akciğer dendritik hücreleri (DC'ler), abartılı bir inflamatuar yanıt nedeniyle akciğerlerde ikincil hasara neden olmadan gerektiğinde bağışıklığı başlatmak için hassas bir dengenin korunmasında gereklidir. İnsan kanındaki DC'ler gibi bağışıklık hücrelerinin fenotipi ve işlevi hakkında ayrıntılı bir anlayış olsa da, bu hücrelerin akciğerler gibi daha az erişilebilir dokulardaki bilgisi çok daha sınırlıdır, çünkü insan akciğer dokusu örnekleri üzerinde yapılan çalışmalar, özellikle sağlıklı bireylerden, azdır. Bu çalışma, endobronşiyal biyopsilerin örneklenmesi için bronkoskopi yapılan sağlıklı insanlarda akciğer dokusunda yerleşik DC'lerin ayrıntılı mekansal ve fenotipik karakterizasyonunu oluşturmak için bir strateji sunmaktadır. Her bireyden birkaç küçük biyopsi toplanabilir ve daha sonra ultra ince kesitler için gömülebilir veya ileri akış sitometrik analizi için enzimatik olarak sindirilebilir. Ana hatlarıyla belirtilen protokoller, kararlı durum koşulları altında yalnızca düşük bir DC frekansı içeren küçük doku örneklerinden maksimum bilgi verecek şekilde optimize edilmiştir. Bu çalışma DC'lere odaklanırken, açıklanan yöntemler doğrudan mukozal akciğer dokusunda bulunan diğer (bağışıklık) hücreleri içerecek şekilde genişletilebilir. Ayrıca protokoller, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), sarkoidoz veya akciğer kanseri gibi bronkoskopinin tanı koymanın bir parçası olduğu akciğer hastalıklarından muzdarip hastalardan elde edilen örneklere de doğrudan uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğerler dış çevre ile sürekli temas halindeyiz ve çok hastalığa neden kapasitesine sahip hem zararsız parçacıkların ve mikropların maruz kalmaktadır. Bu nedenle, işgalci patojenlere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisini monte bağışıklık sistemi için çok önemlidir, ancak hastalığa neden olmayan inhale edilen antijenler tolerans sağlamak için eşit derecede önemlidir. güçlü bir bağışıklık gözetim sağlamak için, solunum sistemi, dendritik hücreler (DC) da dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, bir ağ ile astarlanmıştır. DH'ler naif T hücrelerini aktive etmek özgü kapasiteli profesyonel antijen sunan hücrelerdir. İnsan akciğerlerde, yerleşik DH'ler bir antijen ve sonra işlemi karşılaşırsanız ve T hücreleri 1, 2, 3 tanıtımı ve aktivasyonu için akciğer lenf düğümlerine taşıyın.

insan bağışıklık sisteminde, DCler Distin ile birkaç alt takımından ayrılabilirct ama örtüşen fonksiyonları: CD1c + ve CD141 + miyeloid DH'ler (MDC) ve CD123 + plazmositoid DC'ler (PDC) 4, 5. Insan DC'lerde en detaylı bilgi kanda çalışmalardan kaynaklanıyor olsa da, insan akciğerleri de T-hücre uyarıcı kapasitesi 6, 7, 8, 9 DC alt gruplarının nadir popülasyonları liman artık açıktır. Ancak, biriken veri DC'lere dahil bağışıklık hücreleri, onların anatomik konumu 10 bağlı frekans, fenotip ve fonksiyon açısından farklılık göstermektedir. Nedenle, yerel bağışıklık ve hoşgörü katkılarını anlamak için, ilgili dokudan bağışıklık hücrelerini incelemek için önemlidir. Birlikte ele alındığında, bu kan DC'ler daha kolay kullanılabilir ve erişilebilir olmasına rağmen, akciğer hastalıkları ele alırken akciğer yerleşik DC'ler incelemek gerektiğinin altını çizen İnsanlarda.

Insanlarda akciğer yerleşik DH'lerin inceleyen ilk çalışmalar öncelikle immünohistokimya 11, 12, 13 kullanılarak doku kesitlerinde, morfoloji ve HLA-DR ve CD11c'nin olarak tek belirteçler, ifadesi dayanmıştır. Buna karşılık, genellikle akış sitometrik dayanıyordu daha yeni çalışmalar, farklı immün hücre alt grupları incelemek için analiz eder. bu benzersiz belirli bir DC alt kümesini tanımlayan tek bir hücre-yüzey işaretleyici bulmak zor olduğundan Ancak, çalışmaların potansiyel sınırlama sadece dört renkli akım sitometri uygulayarak DC'ler benzer fenotipik işaretleri ile hücre popülasyonlarının dahil riskidir. Örneğin, CD11c, tüm miyeloid DC'lerin ve monositlerin büyük çoğunluğu üzerinde ifade edilir. Öte yandan, çalışmalarda daha ileri akış sitometri panelleri uygulanması, hastanın cerrahi rezeksiyon ile ilgili kanserli olmayan akciğer dokusu tipik olarak kullanılanxref "> 10, 14, 15, 16, nadir popülasyonları sağlıklı kişilerde DC'ler mevcut gerçekten temsilcisi olmadığı belirsizdir rağmen. Genel olarak, çalışmalar nedeniyle cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olmasından büyük ölçüde sınırlıdır.

Bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için, bu iş mekansal dağılımı ve bronkoskopi geçmesi sağlıklı gönüllülerden elde edilen mukozal endobronşiyal biyopsi DC'lerin bir fenotipik tanımlama ayrıntılı bir analizini gerçekleştirmek açıklamaktadır. Birkaç küçük biyopsiler her birey alınabilir ve daha sonra kesit ve analiz gelişmiş akım sitometri analizi için sindirilmiş enzimatik immünhistokimya veya kullanmak için gömülü olabilir. bronkoskopi elde endobronfliyal biyopsi şeklinde akciğer dokusu kullanılarak mümkün st gerçekleştirmek için yapma avantajı kazandıranudy sağlıklı gönüllü üzerinde, akciğer açık cerrahi aksine bilinen nedenlerle, göğüs cerrahi gerektiren hastalar ile sınırlıdır, o. Ayrıca, sağlıklı gönüllülerden bir bronkoskopi sırasında örneklenir doku akciğer hastalığı olan hastalarda akciğer dokusunda olmayan bir etkilenen bölgeye aksine, fizyolojik olarak normaldir. Öte yandan, biyopsiler, küçük ve birden fazla biyopsileri havuzu da alınan hücrelerin sayısı, gerçekleştirilebilir analizlerin sınırlar.

Bu çalışma DC'ler odaklanırken, doğrudan genişletilebilir açıklanan yöntemler, insan mukozal akciğer dokusunda bulunan diğer ilgi (bağışıklık) hücreleri dahil etmek. Ayrıca, protokoller aynı zamanda bronkoskopi, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), sarkoidoz, ya da akciğer kanseri gibi tanı oluşturulması parçası olan pulmoner hastalıklardan muzdarip hastalardan elde edilen örneklerde için direkt olarak uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Bu araştırma Umea, İsveç'te bölgesel Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.

İnsan Deneklerin Örnekleme Endobronşiyal Biyopsilerinde 1. Bronkoskopi

  1. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam edinin.
  2. Oral midazolam (4-8 mg) ve intravenöz glikopirronyum (0,2-04 mg) bronkoskopi önce 30 dk konuları davranın. gırtlak ve bronşlarda lidokain topikal anestezi uygulayın. lidokain% 4 ~ 3 ml konu gargara edelim ve dil kökünde ve bir gırtlak şırıngayla gırtlak içine 3 ml uygulanır. lidokain sprey 8-10 dozları ile topikal anestezi optimize edin. Konu oturma ile bu adımı yürütmek.
  3. yatar pozisyonda konu ile plastik ağızlık yoluyla ağız yoluyla bir esnek video bronkoskop yerleştirin. bronkoskop aracılığıyla uzak trakea ve bronşların topikal anestezi tamamlamak için bir amaç yapımı sprey kateter kullanın. Burada yaklaşık bir doz kullanmaklidokain% 2 5-10 ml.
  4. 6-9 ana karina endobronşiyal mukozal biyopsi ve Fenestralı forseps kullanarak ana bronş bölünmeler (Şekil 1) atın. bronkoskopi ardından ve hastaneden ayrılmadan önce, 2-4 saat boyunca söz konusu dinlensin ve hafif bir yemek ile onu / onu sağlamak.

2. Glikol Metil (GMA) reçine içinde Biyopsisi katıştırma

NOT: GMA immün protokol başlangıçta Southampton Üniversitesi, Histokimyası Araştırma Birimi 17 geliştirildi.

  1. Sabitleme: İmmünohistokimya için, forseps biyopsi çıkarın ve (buz soğukluğunda susuz aseton ve proteaz inhibitörlerinin 3 ml içeren cam şişelere doğrudan fenilmetilsülfonil florid (35 mg / 100 mi aseton) yerleştirmek ve iyodoasetamid (370 mg / 100 mi aseton )). -20 ° C (Şekil 2) gece boyunca doku sabitleyin.
    Not: Aşağıdaki adımlar perfo edilmelidirUygun nitril eldiven ile davlumbaz rmed. gömme kiti hassasiyeti, tahriş ve / veya alerjik reaksiyonlara neden olabilir bileşenleri içerir. Tüm atık tehlikeli atık olarak bertaraf edilmelidir.
  2. Dehidrasyon: inhibitörleri ile aseton alınır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (RT) (inhibitörsüz), taze susuz aseton ile değiştirin. aseton çıkarın ve 15 dakika boyunca metil benzoat ile değiştirin.
  3. Sızma: glikol metakrilat monomer içinde% 5 metil benzoat çözeltisi bir işleme çözeltisi hazırlanması; 10 mi, bir vial için yeterlidir. metil benzoat çözeltisi kapalı plastik pastör pipet, emme kullanılarak ve işleme çözeltisinin 3 ml'si ile değiştirin. biyopsileri ve 2 saat boyunca 4 ° C de aşırı işlem çözeltisinin inkübe; Pasteur pipet çözeltisi gömme dahil olmak üzere tüm müteakip çözeltisi değişiklikler için de kullanılabilir.
  4. işleme çözüme her 2 saat (3x 2 saat inkubasyon), yani biyo toplam sızma süresini alışverişiişlem çözelti içinde psies en az 6 saattir. biyopsi tanımlamak için gömme kapsüllerin üst ucunu kağıt etiketleri yerleştirin.
  5. glikol metakrilat monomer, 10 ml, 75 mg benzoil peroksit bir gömme çözeltisi hazırlayın. Polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak için gömme çözeltisine, N, N -dimethylaniline poli (etilen oksit), 0.25 ml (gaz) ekleyin. işleme çözüm çıkarın ve forseps kullanarak ilgili gömme kapsül içine bir biyopsi yerleştirin.
  6. Yavaşça çözüm gömme ile üst gömme kapsülünü dolduracak ve kapağını kapatın. biyopsi rahatsız ve büyük hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Reçine tamamen polimerize kadar 4 ° C 'de kapsüller inkübe edin.
  7. silika jel, yaklaşık 5 g ihtiva eden bir 50 ml tüp içinde -20 ° C de gömülü biyopsi saklayın.

GMA gömülü Endobronşiyal Biyopsilerinde 3. Kesit

  1. Mikroskop lamı kaplama: bir mikroskop slaytlar yıkayınNormal döngüsünde bulaşık makinesi. slaytlar Kapak ve havada kurumaya onlara izin.
  2. damıtılmış su içinde% 10 poli-L-lisin (PLL) çözeltisi bir kaplama çözeltisi hazırlandı. 5 dakika boyunca kaplama solüsyonu slaytlar Batmak, ve daha sonra onlara hava kurumaya bırakın. kendi orijinal kutularında kuru PLL kaplı slaytlar saklayın.
  3. damıtılmış su içinde% 0.1 Tween 20 düz cam şeridi yıkayın. kağıt havlu ile% 70 etanol ve kuru ile cam durulayın. Bir bıçak yapımcısı kullanarak cam şerit cam kanatları kesin. kesme kenarı hasarlı veya yakalattıracak olmadığından emin olmak için hareketi engelleyen bir kap içinde bıçakları saklayın.
  4. Biyopsi kırparak: Bir kapsül ayırıcı biyopsi kapsülü yerleştirin ve bir karbon-çelik tek kenar bıçak kullanılarak her tarafı aşağı kesti. GMA gömülü biyopsi çıkarın ve bir mengeneye sıkıca yerleştirin. çelik bıçak kullanarak biyopsi etrafında aşırı GMA Trim.
  5. GMA bölümleme.
    1. damıtılmış su ile% 0.05 amonyak çözeltisi hazırlayın. th cam bıçak ve biyopsi yerleştirine mikrotom. Dikkatle bıçak bloğunun yüzeyine düz duracak şekilde bıçak tutucu ve biyopsi bloğunun açısını ayarlayarak bıçak ile biyopsi bloğunu aynı hizaya getirin.
    2. Yavaş kesim hızı mikrotom kullanılarak 2 mikron kalınlığında bölümleri kesmek ve aktarmak ve amonyak su bölümleri yüzer forseps kullanabilir. nazik antijen alımı sağlayan ve bölümün açılımı, 45-90 saniye boyunca bölümleri yüzer.
    3. mikroskop lamı ile bölümleri toplayın. hızla toluidin mavisi ile boyanarak biyopsi histoloji kontrol edin.
    4. 50 ° C'ye kadar bir sıcak plaka kümesi slaytlar kurutun ve plastik bir Pasteur pipeti kullanılarak bir bölüme süzüldü toluidin mavi leke 500 ul uygulanır. yeşil bir halka leke kenarında ortaya çıkmaya başlayana kadar sıcak plaka bölümüne ısıtın ve daha sonra su ile iyice yıkayın.
    5. Bir ışık mikroskobu kullanılarak, biyopsi histoloji kontrol edin. immünohistokimya için kullanılan Bölümler hasarsız lamina iyi alanlarını içermelidiraz sayıda bezleri ve mümkün olduğu kadar az düz kas propriya ve epitel.
    6. bölüm 3.4.2 olduğu gibi, iyi histoloji sahip bölümleri kesmek ve immünohistokimyasal için PLL kaplı mikroskop lamı ile onları almak. Analiz için biyopsisinden gelen en az iki bölüm kesilir. en az 1 saat için kuru kayar. Kurutma işleminden sonra, bölümler kalay folyo içine de sarılabilir ve en fazla 2 hafta boyunca -20 ° C'de saklandı veya hemen boyanmış olabilir.

GMA gömülü Endobronşiyal Biyopsilerinde 4. İmmünohistokimyasal Boyama

NOT: Sodyum azid zehirli. Davlumbaz içinde% 0,1 sodyum azid çözeltisi hazırlayın ve uzak asitlerden. Asitlerle temasında toksik gaz çıkarır.

  1. Bir elmas uçlu kalem kullanarak bölümleri etrafında çizin ve bir boyama raf üzerine slaytları düzenlemek.
  2. Bir Peroksidaz bloğu gerçekleştirin. % 0.1 sodyum azid çözeltisi içinde% 0.3 bir hidrojen peroksit peroksidazı bloke çözeltisi hazırlayın. ApplY1 bölümlere peroksidazı bloke ml ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. 0.05 M Tris-tamponlu tuzlu su (TBS), pH 7.6 bir yıkama çözeltisi hazırlayın. , TBS içinde 3x 5 dakika slaytlar yıkayın.
  4. DMEM içinde% 1 BSA blok çözeltisi hazırlayın. peşin ve büyük hacimler, kısım bu yapın ve gerektiğinde kadar dondurmak. slaytları süzün ve özgül olmayan bağlanma antikorun bloke etme 30 dakika blok çözeltisi içinde bölümleri inkübe edin. özgül olmayan bağlanma devam ederse, ikinci antikor olarak aynı türden% 5 serum bloğu ile bir 30 dakika inkübasyon aşamasını içerir.
  5. (:; CD1a 1 oranında sulandırılmış 1000: 1,00 1 seyreltilmiş CD45) ve slaytlar uygulamak istenen konsantrasyona TBS birincil antikor (CD45 veya CD1a) seyreltin. bölümler lamel ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
  6. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. (TBS içinde istenen konsantrasyona (2) bu durumda tavşan anti-fare F (ab 'primer antikor konak türlerinden karşı), 1:30 biyotinlenmiş sekonder antikor seyreltilir0 seyreltme) ve slaytlar için geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
  7. Kullanmadan önce streptavidin-biyotin peroksidaz kompleksi en az 30 dakika hazırlayın. Tüm slaytları karşılamak için yeterli olduğundan emin olun. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. slaytlar solüsyonu uygulanır ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
  8. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. 3-amino-9-etilkarbazol (üretici talimatlarına göre yapılmıştır) (AEC) peroksidaz substrat çözeltisi hazırlayın. slaytlara uygulamak ve 20-30 dakika süreyle ya da istenen leke yoğunluğu gelişene kadar kuluçkaya yatmaktadır.
  9. 5 dakika boyunca musluk suyu slaytlar durulayın. 2 dakika süreyle süzülmüş Mayer hematoksilin çözeltisi ile bölümleri counterstain. 5 dakika boyunca musluk suyu slaytlar yıkayın.
  10. slaytlar boşaltın ve kalıcı sulu montaj ortamı ile bölümleri kapsamaktadır. bir kurutma fırınında 80 ° C'de slaytlar kurutun. slaytlar soğutun ve daha sonra DPX ile monte ve bir lamel yapmasına izin ver.

5. StTahliye Analiz

  1. Bir bilgisayara bağlı bir monte edilmiş bir kamera ile bir ışık mikroskobu kullanılarak 40X büyütmede bölümleri analiz edin.
    Not: Hücresel analiz için, pozitif düz kas, bezler, büyük kan damarları ve uyumsuz veya zarar görmüş dokuların alanlar hariç, bronşiyal lamina propria ve bozulmamış epitel içinde, çekirdekli hücreler boyanmış sayısı.
  2. hücre sayımı ortalama ve lamina propria alanı ve epitel uzunluğu ortalama hücre sayısını düzeltin. ve lamina propriya epitel uzunluğunun alanı bir görüntü analiz programı kullanarak hesaplanabilir.

Endobronşiyal Biyopsilerinde 6. Enzimatik sindirimi

  1. Yıkama biyopsileri: Hank tamponlu salin solüsyonu (HBSS) (Şekil 3), 10 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içinde steril forseps yer sağlam biyopsileri kullanılması. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. steril d biyopsileri aktarınHBSS ile 15 ml tüp içeriğini boşaltılarak ish.
  2. DTT ile mukus bozmak: 5 mM 1,4-ditiyotreitol (DTT) içeren HBSS, 10 ml bir tüp HBSS değiştirin. Steril forseps kullanarak 15 ml tüp içine geri biyopsi aktarın. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. 15 sn için tüp hafifçe karıştırın. HBSS ve DTT ile 15 ml tüp içeriğini boşaltılarak steril kabı üzerine biyopsi aktarın.
  4. Kültür ortamına biyopsileri aktarma: RPMI 1640 kültür ortamında, 10 ml bir tüp içinde HBSS ve DTT değiştirin. Steril forseps kullanarak 15 ml tüp içine geri biyopsi aktarın. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  5. kolajenaz ve DNaz ile biyopsi sindirilmesi.
    1. 1 M HEPES çözeltisi içeren, önceden ısıtılmış RPMI kolajenaz II (0.25 mg / ml) ve DNase (0.2 mg / ml) 'in bir sindirim çözeltisi hazırlayın. 48-çukurlu bir doku kült 500 uL oyuk başına sindirim çözeltisi ekleyinure plakası.
    2. Sindirim solüsyonu içinde oyuk başına 1 biyopsi yerleştirin. 220 rpm'de 37 ° C'de 60 dakika boyunca bir çalkalama platformu üzerinde plaka inkübe edin. Pipet yukarı ve 30 dakika biyopsi yeniden dağıtmak için sonra aşağı ve 60 dakika sonra tamamen doku ayrıştırmak.
  6. tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması.
    1. birlikte yüzme 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek bir 50 ml tüp içine kuyu sindirilmiş biyopsileri. buz gibi soğuk FACS tampon maddesi (fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden% 2 fetal sığır serumu) ile yıkanmasından kalan hücreler toplanır.
    2. Bir şırınga pistonu arkasını kullanarak hücre süzgecinden kalan doku sıkın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de sindirilmiş hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi 5 ml pelletini. elle hücrelerin canlılığını değerlendirmek için bir hemasitometre ve Tripan mavisi leke kullanarak hücreleri saymak.

7. Enzimatik Sindirim sonra Endobronşiyal Biyopsilerinde Tek Hücre Akış Sitometrik Analizi

  1. FACS tampon 200 ul, yaklaşık 1 x 10 6 hücre hücre pelletini.
  2. üreticinin protokolüne uygun olarak, ölü hücre çıkarılması için, bir hücre canlılığı boya ekleyin.
  3. FcR bloke edici ayıracı 5 ul ilave edin ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
  4. , CD16 (0.5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123, CD45 (2 ul), soy (2 ul, her CD3, CD20, CD56, CD66abce ve CD14) karşı hücre yüzeyi antikor ekleyin (5 ul), CD1c (3 ul) ve CD103 (2 ul) ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. antikorlar ile ilgili ayrıntılar yöntemleri bölümünde bulunan, ancak kullanımda sitometre kesin akışına antikorlar titre ve optimize edilebilir. 400 x g'de 5 dakika boyunca PBS ile aşırı antikorların yıkayın. bir akış sitometresinde taze örnekleri Edinme veya daha sonra acquisit öncesinde% 1 paraformaldehid hücreleri saptamakiyon.
  5. Tahlil 18 (Şekil 4) sitometri bir akış kullanılarak akciğer biyopsilerinde insan DC'ler belirleyin.
    Not: Analiz yazılımı sitometri akışı ile, bağışıklık hücreleri CD45 üzerinde kapılama diğer akciğer hücrelerinden ayırt edilir. Ölü hücreler CANLI / DEAD boya için pozitif hücreler olarak devre dışı bırakılabilir. Tüm canlı CD45 + hücreleri, soy hücrelerinin (B hücreleri, T hücreleri, NK hücreleri, nötrofiller ve monositler) bir kanal CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 ve CD16 karşı antikorların bir kokteyl ile devre dışı bırakılabilir. HLA-DR + hücrelerinin insan DH'lerinin kimlik sağlayacak sonra. MDC CD11c sentezlenmesi sırasında veya CD11c eksikliği göre PDC ayırt edilebilir. MDC daha CD1c + MDC veya CD141 + ayrılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DC'lere dahil olmak üzere insan solunum doku yerleşik bağışıklık hücrelerini, karakterize Çalışmalar, büyük oranda cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olması nedeniyle sınırlıdır. Burada, sitometri immünhistokimya kullanarak dokuda bağışıklık hücreleri incelemek veya akış sağlıklı gönüllülerde ve gelişmiş protokollerin endobronşiyal biyopsi (EBB) akciğer dokusunu elde etme az invazif bir yöntem özetlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kağıt immünohistokimya kullanılarak sağlıklı insanlarda akciğer dokusu yerleşik DC'lerin detaylı mekansal ve fenotipik karakterizasyonu üretmek ve bronkoskopi sırasında toplanan endobronşiyal mukozal biyopsi üzerinde flow sitometri açıklamaktadır. Aşağıdaki paragraflarda protokol kritik adımlar ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

Protokol Kritik adımlar

Kesit ve immünhistokimya: Onlara (adım 2.5) kullanmadığınız zamanlarda -20 ° C'de biyopsi blokları tutma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmanın klinik malzeme katkıda bulunan gönüllülere teşekkür etmek istiyorum. Biz de tüm klinik materyalin toplanması için Halk Sağlığı ve Klinik Tıp, Tıp / Solunum Hastalıkları Bölümü, Üniversite Hastanesi, Umea (Norrlands universitetssjukhus) Bölümü personeline teşekkür ediyoruz.

Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kalp-Akciğer Vakfı, Stratejik Araştırmalar İsveç Vakfı ve Karolinska Enstitüsünde AS-S hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bronchoscopy
Bronkoskop BF1T160OlympusBF1T160
Işık kaynağı OlympusExera CV-160
Fenestrated forsepsOlympusFB21CBiyopsi almak için kullanılır
Isırık BloğuConmed142920 mm x 27 mm
Glikoz %25 500 ml intravenöz
Glycopyrronium bromür 0.2 mg / mlİntravenöz. Mukus/tükürük salgısını önler
Mixt. Midazolam 1 mg / ml p.oEkstra rahatlama için kullanılabilir
Lidokain, 40 mg / mlAğız ve boğaz uygulaması / Gargara
Lidokain 100 mg / ml spreyBoğazın arkasına uygulanır
Lidokain 20 mg / ml spreyBronkoskop aracılığıyla hava yollarına
< güçlü >GMA işleme ve gömme< / güçlü>
Cam şişeler5 ml
AsetonSigma-Aldrich32201-1L
Moleküler elekler, 4 & # 197;Alfa Aesar881203-4 mm çaplı peletler
Fenilmetilsülfonil florürSigma-AldrichP-76260,035 g/100 ml aseton
İyodoasetamidSigma-AldrichI-61250,37 g/100 ml aseton
Polietilen-düz  TAAB gömme kapsülleriTAAB laboratuvarlarıC094500x 8 mm çaplı, polietilen, düz tabanlı kapsüller
Kapsül tutucuTAAB laboratuvarlarıC05425 8 mm kapsül tutar
JB-4 GMA gömme kitiPolysciences00226, JB-4 Çözelti A (0026A-800), JB-4 çözelti B (0026B-3.8), benzoil peroksit (02618-12)
Metil benzoatSigma-Aldrich27614-1L
Nem göstergeli silika jelScharlauGE00432,5-6 mm 
GMA kesit alma
Glass mikroskop slaytlarıThermoFisher Scientific10143562CEFKesik kenarlar, buzlu uç
Poly-L-Lizin çözeltisiSigma-AldrichP8920-500mL1:10
Ultramikrotomi için düz cam şeritlerAlkar
Tween 20Sigma-AldrichP2287Yıkama çözelti (%0,1 Tween20)
LKB 7800B Bıçak yapıcıLKB
Kapsül ayırıcıTAAB laboratuvarlarıC065
Karbon çeliği tek kenar bıçaklarıTAAB laboratuvarlarıB054
Yardımcı
Amonyak, %25VWR1133.10001 L'de 2 ml, 1:500 (%0,05)
MikrotomLeicaLeica RM 2165
Işık kaynağıLeicaLeica CLS 150 XE
Salıncak kolu standlımikroskop LeicaLeica MZ6
GMA İmmünohistokimya
Elmas uçlu kalemHistolab5218
Hidrojen peroksit %30 çözeltiAnalaR Normapur23619.264
Sodyum azidSigma-AldrichS8032
TrisRoche10708976001
Sodyum klorürVWR kimyasalları27810.295
Sığır serum albüminiMillipore82-045-2Probumin BSA tanı sınıfı
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)Sigma-AldrichD5546
Anti-insan CD45 antikoruBioLegend304002Fare monoklonal, klon HI30, izotip IgG1k. 500 ng / ml
Anti-insan CD1a antikoruAbD SerotechMCA80GAFare monoklonal, klon NA1 / 34-HLK, izotip IgG2a çalışma konsantrasyonu. 10 & mikro çalışma konsantrasyonu; g/ml
Fare monoklonal IgG1 izotip kontrolüAbcamab27479
Fare monoklonal IgG2a izotip kontrolüDakoX094301-2
Vectastain ABC Elite standart kitVector LabsPK-6100
AEC (3-amino-9-etilkarbazol) peroksidaz substrat uçurtmaVektör LaboratuvarlarıSK-4200
Mayers hematoksilenHistoLab01820
Kalıcı Sulu Montaj OrtamıAbD SerotechBUF058C
Kurutma fırını
DPX kalıcı montaj çözümü VWR360292F
Işık mikroskobuLeicaLeica DMLB
Mikroskop kamerasıLeicaLeica DFC 320
Analiz yazılımıLeicaLeica Qwin V3
Enzimatik sindirim
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Sigma-Aldrich55021C
Ditiyotreitol (DTT)Sigma-AldrichDTT-RO
Kollajenaz IISigma-AldrichC6885
DNaseSigma-Aldrich10104159001  ROCHE
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
Forseps
Platform külbütörHibe aletleriPMR-30
50 ml konik tüplerFalcon14-432-22
40 & m hücreli süzgeçFalcon352340
Flow sitometrisi
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
CANLI/ÖLÜ Aqua sabitlenebilir ölü hücre leke kitiYaşam TeknolojileriL34957
CD45BD555485
CD3BD557757
CD20BD
CD56Biyoefsane318332
CD66abceMiltenyi130-101-132
HLA-DRBD
CD14BD557831
CD16Biyoefsane302026
CD11cBD560369
CD1cMiltenyi130-098-009
CD141Miltenyi130-090-514
CD103Biolegend350212
ParaformaldehitSigma-AldrichF8775
LSR II Akış sitometresiBDAkış sitometresi
FlowJoFlowJoAnaliz yazılımı
içerirÇalışma çözümü için335829 555813

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tissue DigestionBronchoscopy SamplesMucosal ImmunologyCell Isolation

İlgili makaleler