Bu protokol, bakım davranışı ölçmek için sağlam, nicel veri üreten, Drosophila'daki ölçeklendirilebilir bireysel bakım tezgah tekniğini tanımlamaktadır. Yöntem, bakımsız ve bakımlı hayvanlar arasındaki boya birikimindeki farkın belirli bir süre boyunca karşılaştırılmasına dayanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila tımar etme davranışı hem ön hem arka kıskaçların koordine hareketini gerektiren karmaşık, çok adımlı bir lokomotif programdır. Burada, damlama deneyi protokolünü ve Drosophila damatlaştırma konusundaki küçük ölçekli veya büyük ölçekli araştırmalar için uygun maliyetli ve ölçeklendirilebilir yeni oda tasarımı sunuyoruz. Sinekler Brilliant Yellow boya ile vücudun her tarafına tozlanır ve boya oda içindeki bedenlerinden uzaklaştırılması için zaman verilir. Sinekler daha sonra, boya çözündürmek için belirli bir hacimde etanol içine çöker. Dezenilmemiş hayvanlara kıyasla bakımsız hayvanlar için boya etanol numunelerinin göreceli spektral absorbansı ölçülür ve kaydedilir. Protokol, tek tek sinekler için boya birikiminin niceliksel verilerini verir; bunlar kolaylıkla ortalanabilir ve örnekler arasında karşılaştırılabilir. Bu, deneysel tasarımların mutant hayvan çalışmaları veya devre manipülasyonları için damat yeteneğini kolayca değerlendirmesini sağlar. Bu verimli prosedür çok yönlü ve ölçeklenebilir. WOrk akışını ve Drosophila tip I Dopamin Reseptörü ( DopR ) için WT hayvanları ve mutant hayvanlar arasındaki karşılaştırma verileri.
Giriş
Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) 'de tımarlama , birden fazla bağımsız motor programının koordinasyonunu içeren sağlam bir doğuştan gelen davranıştır 1 . Meyve, toz, mikrop ve diğer patojenler vücutlarını temizler; bu da, görme ve uçuş gibi normal fizyolojik fonksiyonları engelleyebilir veya önemli bağışıklık sorunlarına yol açabilir. Hem mekanik 2 hem de bağışıklık aktivasyonunu 3 algılar ve yanıt verirken, sinekler yeterli derecede temizleninceye ve vücudun bir başka bölümüne doğru ilerleyinceye kadar bacaklarını birlikte ya da hedeflenen bir vücut bölg....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hazırlık
- Canlı Drosophila'yı kültür şişesinden damat odasına taşımak için bir aspiratör hazırlayın. Aspiratörler, anestezinin sonraki davranışsal gözlemi etkilememesini sağlamak için bilinçli hayvanların davranış odasına transfer edilmesine izin verir.
- Makas kullanarak, 1 fitlik tek kullanımlık mikropipet ucunun ucundan en az 1 inç uzakta, 1.5 fit tigon borusu ID 1/8 kes. Kesme ucu üzerine 1 cm'lik kare mesh (açıklık 0.196 inç) tutun.
NOT: Çoğu 1mL ipucu, tipin paket kutusuna oturduğu, genellikle o satıra kesilen bir derecelendirme çizgisine sahiptir. - Örgü / kesme ucu üzerine taze 1 mL'lik ....
- Makas kullanarak, 1 fitlik tek kullanımlık mikropipet ucunun ucundan en az 1 inç uzakta, 1.5 fit tigon borusu ID 1/8 kes. Kesme ucu üzerine 1 cm'lik kare mesh (açıklık 0.196 inç) tutun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Damatlık tahlilinde, ayarlama için belirlenen bir süre boyunca (30 dakika) sineklerin bedenlerinde kalan biriken boyanın göreli geri kalanına dayanılarak davranış performansını değerlendirmek için niceliksel veriler elde edilir. Sürgülü damat odası tasarımının örnek görüntüleri ve tahlilin ana adımları Şekil 1'de vurgulanmaktadır. Sinekler, boya varlığında vorteks yaparak hemen tozlanma olayından önemli miktarda boya toplarlar ( Şekil 2d, 2e ). Tozla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bakım testi nispeten basittir, ancak deneyanları aşağıdaki hususlara özel dikkat etmeye özen göstereceğiz. Sinekler ve boyayı taktıktan sonra üst ve alt plakalardaki vidaları sıkarak sıkı bir sızdırmazlık korumak tekrarlanabilir sonuçlar için gereklidir. Parlak Sarı boya çok ince ve gevşek derzler odanın kenarlarından boya kaybına izin verecek. Her kuyu için boya içeriğindeki düzensizlik, tımar halindeki olaylar için varyasyon ve sahte pozitif oranları artıracak düzensiz tozlama gibi bakım kantifikasyonunu kolaylıkla at.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Bu metodoloji ve oda tasarımlarını test etme ve tesis etme konusunda erken çalışmalar yapmak için Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon ve Rose Hedreen'e teşekkür etmek istiyoruz. Yazıyı okumak ve düzenlemek için Kelly Tellez ve Graham Buchan'a teşekkür ediyoruz. Andrew Toeds ve Julie Simpson'a öncü çalışmaları ve Brilliant Yellow Dye (Sigma) kullanımını önermek için verdikleri tavsiye ve destekleri nedeniyle teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Mary E. Groff Cerrahi ve Tıbbi Araştırma ve Eğitim Yardım Kuruluşu Güvenliği, Bronfman Bilim Merkezi ve Hellman Fellows Programı tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Yüksek Esnekliğe Sahip Tygon PVC Şeffaf Boru | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", ağız aspiratörleri oluşturmak için mikropipet uçları ve ağ ile birlikte kullanılır |
| Mikropipet uçları (1 mL ve 200 &# 956; L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Naylon Hasır Ekran, 2 x 2.6 " | McMaster-Carr | 9318T44 | Bakım odası ve ağız aspiratörleri yapmak için kullanılır |
| Dumont # 5 Forseps | Roboz Cerrahi Alet | RS-5050 | |
| Parlak Sarı Boya | Sigma-Aldrich | 201375-25G | Bu ürünü |
| kullanırken nitril eldiven kullanmanızı öneririzVortexer | Fisher Scientific | 12-812 | "dokunmaya" ayarlandı |
| Etanol | Carolina Biyolojik Tedarik | 86-1282 | |
| 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL mikrosantrifüj tüpleri | VWR International | 20170-293 | tüpleri ardışık tahlillerle yeniden kullanılabilir |
| UV 96 kuyulu plaka | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX Plaka Okuyucu | BioTek'in | ürün numarasına erişmek için kataloğu indirmeniz gerekiyor | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Mikroplaka Okuyucu ve Görüntüleyici Yazılımı | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila İnkübatör | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" akrilik plastik | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 somun | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" altıgen başlı vidalar | McMaster-Carr | 92185A199 | bu boyuttaki vida için alt plakanın diş açılması gerekir 8 |
| - 32 x 1/2" altıgen başlı vidalar | McMaster-Carr | 92185A194 | üstten ikinci plakanın vidalanması gerekiyor |
| 2 - 56 3/8" düz başlı yıldız makine vidaları | McMaster-Carr | 91500A088 | bunlar iki orta plakayı bir arada tutar |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" alüminyum boru | McMaster-Carr | 92510A044 | Şirket içinde üretilmiştir; Listelenen ürün yaklaşık olarak aynı boyutlardadır ve 8 numara vidalar için çalışmalıdır. Bunlar, 1" vidalar için kılıf görevi görür ve altıgen kapağı üst plakanın yüzeyinden biraz yukarı doğru yerleştirir |
Kaynaklar
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
