Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

10K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55235

⸱

20 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

Bu makalede

Özet

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

Özet

Her yıl, mevsimsel grip salgınları dünya çapında toplumları derinden etkiliyor. Küresel çabalara rağmen, influenza inatçı bir sağlık yükü olmaya devam ediyor. Enfeksiyonları azaltmak için temel strateji yıllık aşılamadır. Grip geçirmiş kişilerde, antiviral ilaçlar semptomları hafifletebilir. İnfluenza ile mücadele için alternatif stratejiler geliştirmek için açık ve karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Konak-influenza etkileşimlerini modellemek için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Burada, sistemik ve lokalize insan influenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu için zebra balığı modelleri oluşturmak için protokoller açıklanmaktadır. Sistemik bir IAV enfeksiyon modeli kullanılarak, potansiyel antiviral aktiviteye sahip küçük moleküller taranabilir. Prensip kanıtı olarak, IAV ile enfekte zebra balığında antiviral ilaç Zanamivir'in etkinliğini gösteren bir protokol açıklanmaktadır. IAV ile enfekte zebra balıklarında potansiyel antivirallerin göreceli etkinliğini puanlamak için hastalık fenotiplerinin nasıl ölçülebileceğini gösterir. Son yıllarda, nötrofillerin influenza enfeksiyonuna insan konak yanıtında oynadığı kritik rol için artan bir takdir olmuştur. Zebra balığının, insan tıbbı üzerinde doğrudan etkileri olan nötrofil biyolojisi çalışmaları için vazgeçilmez bir model olduğu kanıtlanmıştır. Lokalize bir viral enfeksiyon bağlamında nötrofil biyolojisini incelemek için Tg(mpx:mCherry) zebra balığı hattında lokalize bir IAV enfeksiyonu oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Lokalize enfeksiyon bölgelerine nötrofil alımı, terapötik uygulamalara sahip olabilecek deneysel manipülasyonları değerlendirmek için ek bir ölçülebilir fenotip sağlar. Her iki zebra balığı protokolü de insan IAV enfeksiyonunun yönlerini aslına uygun olarak özetlemektedir. Zebra balığı modeli, yüksek doğurganlık, optik netlik, ilaç taramasına uygunluk ve nötrofiller gibi bağışıklık hücrelerinin floresan proteinlerle etiketlendiği olanlar da dahil olmak üzere transgenik hatların mevcudiyeti dahil olmak üzere çok sayıda doğal avantaja sahiptir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokoller bu avantajlardan yararlanır ve sonuçta kliniğe dönüşebilecek konakçı-IAV etkileşimleri hakkında kritik içgörüler ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre, grip virüsleri yetişkinlerin% 5-10 ve yıllık çocukların% 20-30 bulaştırmak ve şiddetli hastalık 3-5 milyon vaka neden ve dünya çapında 1 500.000 ölüm. Gribe karşı Yıllık aşı hastalığı önlemek için en iyi seçenek olmaya devam etmektedir. DSÖ Küresel Eylem Planı gibi çabalar morbidite ve mevsimsel influenza salgınları 2 ile bağlantılı ölüm azaltmak için daha güçlü aşı stratejileri içine mevsimsel aşı kullanımı, aşı üretim kapasitesi, araştırma ve geliştirme artmıştır. Nöraminidaz inhibitörleri (örn Zanamivir ve oseltamivir) gibi Antiviral ilaçlar bazı ülkelerde mevcuttur ve başlangıcı 3, 4, 5, ilk 48 saat içinde uygulandığında, hafifletici semptomlarda etkili olduğu kanıtlanmıştır. küresel çabalara rağmen, mevsimsel grip çevreleme ouinfluenza virüsü antijenik sürüklenme genellikle virüsün 6 değişen genomunun uyum mevcut yeteneklerini aştığı olarak tbreaks, şu anda müthiş bir sorun olmaya devam etmektedir. Virüsün yeni suşlar hedefleyen aşı stratejileri önceden geliştirilmeli ve bazen nedeniyle, sonunda bir grip sezonu hakim soyların türleri öngörülmeyen değişikliklere en iyi şekilde etkili daha az işlenir. Bu nedenlerden dolayı, enfeksiyonlara içeren ve mortalite azaltmak için alternatif tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için açık bir ihtiyaç vardır. Konak-virüs etkileşiminin daha iyi bir anlayış elde ederek, yeni bir anti-grip ilaçları ve adjuvan tedavilerin 7, 8 geliştirmek mümkün olabilir.

insan konak-grip A virüsü (IAV) etkileşim karmaşıktır. insan IAV enfeksiyonu Çeşitli hayvan modelleri dahil olmak, konak-virüs etkileşimi anlamak için geliştirilmiştirfareler, kobay, pamuk sıçan, hamster, dağ gelinciği, olmasmm 9 ing. konak-IAV dinamiklerinin anlaşılmasını arttırmıştır önemli verileri sunarken, her model organizma insan tıp içine bulguları çevirmek için çalışırken dikkate alınması gereken önemli sakıncalar sahiptir. Insan influenza 9 izole bulaşmış Örneğin, en yaygın olarak kullanılan model olan fareler, hali hazırda IAV kaynaklı enfeksiyon semptomları geliştirmez. Faresi epitel hücreleri yerine insan epitelyum hücrelerinin 10 eksprese α-2,6 sialik asit bağlarının α-2,3 sialik asit bağlarının ifade beri insan influenza doğal tropizmi izole yoksun olmasıdır. İnsan IAV mevcut hemaglutinin proteini olumlu, bağlanma ve reseptör dolayımlı endositoz 9, 11 ile α-2,6 sialik asit bağlarının taşıyan konakçı hücrelere giriş izolatları 12, 13> kadar. Sonuç olarak, artık insan influenza fare modelleri gelişmekte olan, bakım, insan hastalık yönlerini özetlemek hastalık fenotipleri ulaşmak için grip uygun suşu ile fare uygun gerginlik eşleştirmek için alınması gerektiğini kabul edilmektedir. Bunun aksine, dağ gelinciği, üst solunum yolundaki epitel hücreleri, insan hücreleri 14 benzer α-2,6 sialik asit bağlarının sahiptirler. Enfekte gelincikler insan ve kuş gribi virüslerinin 14 patojenite ve bulaşabilirliği, 15 de dahil olmak üzere insan hastalığında gözlenen patolojik ve klinik özellikleri, birçok paylaşıyoruz. Ayrıca aşı etkinliği çalışmalarda yüksek ölçüde uygundurlar. Bununla birlikte, insan influenza gelincik modeli istatistiksel olarak önemli edinimi yapmak esas boyutu ve hayvancılık maliyeti ile ilgili çeşitli dezavantajları vardırcan veriler zorlu. Buna ek olarak, gelincikleri önceden test etkinliği zorlaştıran ilaç farmakokinetiği, biyoyararlanım ve toksisite farklılıkları göstermiştir. Örneğin, dağ gelincikleri M2 iyon kanal inhibitörü amantadin 16 toksisite gösterirler. Nedenle, insan IAV enfeksiyonları ile ilgili soruları incelemek için bir hayvan modeli seçiminde, kendine özgü avantajları ve sınırlamaları ve soruşturma altında konak-virüs etkileşimin yönünü dikkate almak önemli olduğu açıktır.

Zebra balığı Danio rerio 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, birdestek sınıfı = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Zebrabalıkları hücrelerin yüzeyi üzerinde α-2,6-bağlantılı sialik asit infeksiyon çalışmalarında karşılanır ve IAV 19'un bir flüoresan raportör suşu kullanılarak in vivo görüntülenmiştir IAV, karşı duyarlılığının önerdi. IAV enfekte zebrabalıkları, antiviral ifnphi1 ve mxa transkriptlerinin artmış ekspresyonu doğuştan gelen bağışıklık tepkisi teşvik edildiğini göstermiştir ve ödem ve doku tahribi içeren IAV enfekte zebra balığı görüntülenen patoloji, insan influenza enfeksiyonları gözlenene benzerdi . Ayrıca, IAV antiviral nöraminidaz inhibitörü Zanamivir sınırlı mortalite ve zebrabalıkları 19 azalmış viral replikasyon.

Bu raporda, sistem başlatma için bir protokolZebra balığı embriyolarının in ic IAV enfeksiyonları tarif edilmektedir. Bir kanıtı madde olarak klinik açıdan uygun dozlarda Zanamivir kullanılarak, anti-viral etkinlik için bileşiklerin elenmesi için zebrabalıkları IAV enfeksiyon modeli yardımcı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, zebrabalıkları lokalize bir epitel IAV enfeksiyonu üretilmesi için bir protokol, anatomik ve fonksiyonel olarak benzer bir memeli akciğer 21, 29, 30, 31 olarak kabul edilir bir organ mesane yüzmek tarif edilmektedir. Bu yerelleştirilmiş IAV enfeksiyon modeli kullanılarak, enfeksiyon sitesine nötrofil göçünü IAV enfeksiyon ve inflamasyon nötrofil biyoloji rolüne soruşturma sağlayan izlenebilir. Bu zebrabalıkları modeller, insan IAV enfeksiyonlarının mevcut hayvan modelleri tamamlar ve küçük molekülleri ve nedeniyle geliştirilmiş s olasılığı bağışıklık hücrelerinin karşı etkilerini test etmek için özellikle yararlı olantatistical güç, yüksek verimli tahlillerine orta- kapasitesi ve yetenekleri ışık mikroskobu ile bağışıklık hücre davranışlarını ve fonksiyonunu izlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm iş biyogüvenlik düzeyi 2 (veya BSL2) Hastalık Kontrol (CDC) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri (IACUC) tarafından kurulan direktifleri doğrultusunda ABD Merkezleri tarafından açıklanan standartlar kullanılarak yapılmalıdır. güvenlik ve uyum sağlamak için uygun yetkililerle görüşmek edin.

1. Zebra balığı Bakım ve Onarım

  1. zebrafish spawn ve deneyler için embriyo gerekli sayıda toplamak. Tüm Adatto ve arkadaşları tarafından tarif edilenler gibi, gerekli kitle ıslah tankı. 32, gelişimsel aşamalı embriyoların sayıda toplamak için kullanılabilir.
  2. Embriyolar düşük yoğunlukta derin Petri kapları istenen gelişim aşamasında (lokalize, yüzmek mesane enfeksiyonu için bir sistemik IAV enfeksiyonu [bölüm 3] ya da 5 gün sonrası fertilizasyon için 48 saat sonrası döllenme [bölüm 4]) (kadar geliştirmeye olanak sağlar < 6 ihtiva eden steril bir yumurta suda 28 ° C 'de 100 embriyo / çanak)Distile su içinde 0 ug / ml deniz tuzu (örneğin, Anında okyanus).
    1. plastik transferi pipetleri ile ölü embriyolar çıkarın ve optimal sağlık ve gelişimini sağlamak yumurta suyu günlük olarak değiştirin.

Malzeme ve Reaktiflerin 2. Hazırlık

  1. Damıtılmış su ve otoklavda Tricaine-S, 4 mg / ml stok çözeltisi (7.0-7.4 pH ayarlamak) hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
  2. Mikropipet çektirmenin kullanarak filamentler ile borosilikat cam kılcal çekin (aşağıdaki ayarlarla örneğin Mikropipet Çektirme: basınç ayarı = 100, ısı = 550, pull = [hiçbir değer], hız = 130, süresi = 110).
    NOT: Ön iğne kırpma için, iğne iğne ucu kadar incelecek başlar yerden uzunluğu yaklaşık 12-15 mm olacaktır. Bu tercih ve uygulamaya göre, ancak, değişebilir. Daha uzun, daha yavaş konik çünkü embriyo delmek için artan yetenek ve düşük ri daha tercih edilebilirİğne bükme veya kırılma sk.
  3. Bir mikrodalga kullanarak 100 ml yumurta suda agaroz 2 gr eritin. sıraya ve derin Petri kapları içine erimiş agaroz ve katılaşmaya izin dökülmesi embriyolar enjekte plakaları olun.
  4. nükleaz içermeyen su içinde zanamivir 10 mg / ml stok olun. -20 ° C'de kısım ve dondurularak.
  5. Embriyo agaroz montaj yapmak için bir mikrodalga kullanarak 50 ml yumurta suda 0.5 g agaroz eritin. görüntüleme sırasında kullanmak için hazır olana kadar, 50 ° C'de su banyosu içinde muhafaza edin.

3. Sistemik IAV Enfeksiyon (48 saat sonrası fertilizasyon)

DİKKAT: Tüm araştırma personeli IAV ile çalışmaya başlamadan önce aşılama konusunda amirlerine ve doktorlarına danışmalıdırlar.

  1. El ile 5. forseps kullanarak deney gününde embriyolar dechorionate. kaldırmak ve / ml Tricaine solüsyon 200 mcg süreç yaralandı embriyolar euthanize özen gösterin.
  2. Preparat OMikroenjeksiyon f IAV
    Not: zebra balığı embriyolar enfekte ettiği gösterilmiştir soylar, influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), grip bir X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) ve bir flüoresan raportör olan grip suşu NS1-GFP 33. APR8 ve X-31 ve diğer suşlar ilgili ayrıntılar, İnfluenza Research Database bulunabilir
    1. Daha önce 34, 35 açıklandığı gibi embriyo halindeki tavuk yumurtalarının içinde IAV ve NS1-GFP gerginlik yaymak. Toplamak kısım, ve -80 ° C 'de alantoik IAV ihtiva eden sıvı ve mağaza titre. APR8 önceden titre edilmiş ve X-31 virüs ticari olarak satın alınabilir.
      1. enfeksiyon hemen önce hızla eldivenli elinde bir IAV kısım Çözülme ve daha sonra hızlı bir şekilde titre kaybını azaltmak için buz üzerine yerleştirin.
    2. viral seyreltme
      1. APR8 ya da X-31 virüslerin kullanıldığı takdirde, 3.3 x 10 6 yumurta enfektif doz% 50 (EID50) seyreltin / ml steril, buz gibi soğuk PBS ile bağlı ek olarak% 0.25 fenol kırmızı tasyonlu bir laminer akış başlığı içinde (görselleştirme yardımcı olmak için). Eş zamanlı olarak% 0.25 fenol kırmızısı ile steril PBS içeren bir denetim kurmak.
      2. NS1-GFP suşu 33 kullanılıyorsa,, steril, buz gibi soğuk PBS içeren% 0.25 fenol kırmızı NL başına 1,5 x 10 2 plak oluşturan birim (pfu) bir laminer akış başlığı içinde (görselleştirme yardım etmek için) seyreltin. Eş zamanlı olarak% 0.25 fenol kırmızısı ile steril PBS virüs gibi seyreltilmiş bulaşmamış tavuk yumurta allantoik sıvı içeren bir denetim kurmak.
      3. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde IAV koruyun.
    3. kullanımdan hemen önce Microloader ipuçlarını kullanarak mikroenjeksiyon iğneler içine Pipetleyin virüs çözümü. Enjeksiyon aparatı (örn MPPI-3 basınçlı enjeksiyon sistemi) uygun tutucu içine mikroenjeksiyon iğne takın.
    4. Stereo mikroskop altında izlerken, hafifçe keskin, sterilize 5. forseps ile mikroenjeksiyon iğne ucu klibi.
      NOT: yapılması önerilmiştir olduğunuded mikroenjeksiyon ucu yavaş yavaş kırpılmış olması.
    5. basınçlı enjeksiyon sistemi ayak pedalına basınız ve bir kalibrasyon mikrometre slayt mikroskop daldırma petrol bir damla enjekte. damla çapını ölçün. , Denklem kullanılarak damla hacmini hesaplayın V = V hacmi nl olduğunu ve r um içinde yarıçapı / 3πr 3 4.
      NOT: damla çapı çok küçük ise, ek cam kırpılabilir veya basınç ve zamanlama ayarları ayarlanabilir. damla çapı çok büyükse, basınç ve zamanlama ayarları ayarlanabilir.
    6. Basınç enjektörü basınç ve zamanlama ayarlarını yapın ve / veya istenilen enjeksiyon hacmi (tipik olarak 1-3 nl) elde edilene kadar iğne ucu reclip. 40 ve 80 milisaniye arasında 20 ve 30 psi ve darbe süresi ayarları arasındaki basınç ayarları tipiktir. bu kılcal basınç sayaçları ama IAV (net sıfır basınç) akmaması böylece geri basınç ayarlayın.
  3. Enjeksiyon için Embriyolar hizalayın
    1. 200 ug / ml Tricaine içinde dechorionated embriyoların uyutmak.
    2. hareket durur sonra, plastik bir pipet ile (bölüm 2.3 hazırlanan)% 2 agaroz plaka 10-20 embriyo transferine. Fazla sıvının çıkması için pipet kullanın.
    3. Yavaşça yangın cilalı ve mühürlü borosilikat cam kapiller ile mikroenjeksiyon için embriyolar hizalayın. Cuvier ve kanal veya posterior kardinal ven mikroenjeksiyon iğne (Şekil 1A) ile uyumlu olacak şekilde, yavaşça şark embriyolar stereo mikroskop kullanarak.
  4. IAV Mikroenjeksiyon
    1. Yavaşça Cuvier ve kanal veya posterior kardinal ven içine mikroenjeksiyon iğne takın. Embriyo (Şekil 1A) dolaşım sistemi içine IAV istenen hacim enjekte ayak pedalına basın. Gerekirse Embriyolar birden çok kez enjekte edilebilir.
      NOT: Enjeksiyon bolus dolaşıma ve distrib içine süpürüldü olmalıdırvücuda uted. enjeksiyon hacmi enjeksiyon yerinde toplar ise, deney ve euthanize embriyo çıkarın.
    2. seçilen virüs suşu için özel kontrol solüsyonu ile farklı embriyolar üzerinde enjeksiyon tekrarlayın. APR8 ve X-31 için, bölüm 3.2.2.1 tarif kontrolü kullanmak; NS1-GFP için, bölüm 3.2.2.2 açıklanan kontrol kullanır.
  5. 33 ° C'de kuluçka steril yumurta, su ve yer içeren etiketli Petri embriyo transferi.
    Not: Enfekte embriyolar gelişmiş virüs kopyalanmasını desteklemek için 33 ° C'de yetiştirilir. Buna ek olarak, 33 ° C'de inkübasyon daha yakından IAV enfeksiyonları meydana burada dış ortamda düşük sıcaklıklarda ile yakın temas içinde olan ve üst solunum yolu, sıcaklığını taklit eder. Embriyolar geniş bir sıcaklık aralığında 34 ACCLIMATE edebilirsiniz.

4. Lokalize, Tg içinde yüzmek Mesane IAV Enfeksiyon (mpx: mCherry) Transgenik Zebra balığı (5 gün sonrası fertilizasyon)

  1. Mikroenjeksiyon için IAV hazırlanması
    1. bölüm 3.2'de anlatıldığı gibi NS1-GFP zorlanma ve kontrol enjeksiyon çözeltisi ile seyreltilir.
    2. bölüm 2.2'de anlatıldığı gibi iğneler hazırlayın.
    3. Tg (mpx: mCherry) hizalamak şu istisna ile bölüm 3.3'te anlatıldığı gibi şişirilmiş yüzmek mesane içeren 35 larva. İğne yüzmek mesaneyi delip olabilir ve daha önce 36 (Şekil 2A) açıklandığı gibi virüs, yüzme mesane posterior yatırılır olabilir böyle bir şekilde larva hizalayın.
  2. IAV Mikroenjeksiyon
    1. Yavaşça yüzmek mesane içine mikroenjeksiyon iğne takın ve yapısı (Şekil 2A) ve posterior doğru istenilen hacmi (örneğin 5 nl) enjekte edilir.
      NOT: Enjeksiyon bolus posterior doğru toplamak gerekir ve yüzmek mesane hava kabarcığı b gerekirE öne yerinden. GFP 3 saat sonrası enjeksiyon olarak uyulması gereken başlamalıdır.
    2. Bölüm 3.4.2'de tarif edildiği gibi, seçilen virüs suşuna özel kontrol çözeltisi ile tekrar enjeksiyonları.
  3. 33 ° C'de kuluçka steril yumurta, su ve yer içeren Petri kapları için larva aktarın.

5. Antiviral İlaç Tedavisi

NOT: protokol aşağıda daha önce Gabor ark gösterilen Zanamivir tedavisini tarif etmektedir. 19. Bu protokol, diğer anti-viral ilaçlar taranması için tadil edilmiş bir 96 gözlü levha, yüksek verimli bir biçimde birden çok bileşikleri taramak için değiştirilebilir potansiyeline sahip olabilir.

  1. 3 saat sonrası enfeksiyon, 0, 16.7 ya da 33.3 ng / ml Zanamivir içeren steril yumurta su ile yumurta NS1-GFP- suyunu ve kontrol enfekte balık değiştirin.
    NOT: Bu konsantrasyonlar fo elde fizyolojik seviyelerini çoğaltmak girişimi için seçildiİnsan hastalara (günde iki kez 100, 200 ya da 600 mg, iv, günde iki kez ya da inhale 10 mg) 'de zanamivir llowing idaresi. Insan hastalarda serum konsantrasyonları 9.83 45.3 ng / ml 36 arasında değişmekteydi.
  2. 5 gün boyunca, yumurta suya her 12 saat değiştirin ve zanamivir uygun miktarda içeren steril yumurta su ile değiştirin.
  3. Enfeksiyon Kursu izleyin.
    1. 200 ug / ml Tricaine zebrafish uyutmak. görsel IAV ile enfekte olan ve kontrol balık ile ilaçların farklı konsantrasyonlarda batırma balık arasında enfeksiyon modellerindeki farklar gözlemlemek için bir stereo floresan mikroskop ile GFP ifade izleyin.
    2. 5 gün boyunca morbidite ve mortalite izleyin.
      1. uyuşukluk belirtileri ve ödem kanıt, pigmentasyon farklılıkları, göz ve kraniofasial deformiteler ve lordoz dahil hastalık patoloji ile ilgili enfeksiyon dinamikleri hakkında rekor gözlemler. hastalık patolojitipik olarak enjekte virüs miktarına bağlı olarak, 24-48 saat sonra enjeksiyon de kontrol enfeksiyona balık belirgin hale gelir. görüntüleri 24 saat sonrası enjeksiyon toplayın.
      2. 5 gün sonrası enfeksiyon için her 24 saat, ölü morbid ve sağlıklı larvaların sayısını kaydedin. Ölüm fark edilebilir bir kalp atışı olmaması ile tanımlanır. İstediğiniz gibi veri çizilir. Örneğin, sağlıklı marazi veya ölü balık yüzdeleri ile yığılmış çubuk grafik olarak arsa verileri, x ekseninde y ekseninde ve tedavi grubuna çizilen. 19
        NOT: Ölümleri Kaplan-Meier sağkalım tahminlere göre attı olabilir. Uygulamaya bağlı olarak, gözlenen yukarıda belirtilen patolojik özelliklerine göre morbidite derece ölçmek olabilir bir puanlama matrisine dahil puanlama balık morbidite için alternatif yaklaşımlar geliştirmek için uygun olabilir.
      3. uygun istatistiksel analiz uygulamak için bir istatistikçi danışın.

6. nötrofil Göç

NOT: protokol aşağıda lokalize, epitel IAV enfeksiyonun ardından yüzmek mesane nötrofil göçünü izlemek için bir yöntem açıklanır. tarif edilen yöntemler genetik ve kimyasal işlemler etkilerini test etmek için modifiye edilebilir. Bu tekniği kullanarak, bir IAV enfeksiyonu sırasında nötrofil davranışı altında yatan mekanizmaları karakterize etmek mümkün olacaktır.

  1. Görüntüleme için Zebra balığı Montaj
    1. larvaları anestezisi 200 ug / ml Tricaine yansıması.
    2. Yumurta su (~ 50-100 ul) küçük bir damlacık iyi bir 24 bir kuyuya NS1-GFP ile enfekte olmuştur larva, cam alt plakayı: Tek bir Tg (mCherry mpx) aktarın. Diğer IAV-enfekte ve kontrol balık tekrarlayın.
    3. Yavaş yavaş büyük kabarcıklar tanıtmak için özen her bir kuyu (bölüm 2.5) için% 1 agaroz embriyo montaj medya ekleyebilirsiniz.
      1. onun tarafına monte edilir şekilde hafifçe larva konumunu ayarlamak.Goody ve Henry 37 filamentler ile borosilikat cam kılcal damarlar monte ve yerinde superglued olan böcek pimleri kullanarak bu uygulamada iyi çalışması probları yapmak nasıl açıklar.
    4. Agaroz sertleşince yavaşça 200 ug / ml Tricaine ihtiva eden yumurta su ile, ayrı ayrı kuyuların doldurun.
    5. konfokal mikroskop ile, 20X objektif kullanılarak aydınlık ve floresan görüntüleri yığını serisi Az yakalama yüzme mesane üzerinde duruldu.
      1. hepsi gözle gözlenebilen yeşil ve kırmızı floresan yakalamak böylece üst ve alt limitlerini ayarlayın.
      2. ≤ 4 mikron olan adımlarla 2.0 mikro-sn / pikselde Yakalama görüntüleri. Piksel başına süresinin arttırılması ve adımlar arasındaki mesafeyi azaltarak (örneğin 0,5-1,0 mikron) resim çözünürlüğü ve kalitesini artırır.
      3. katmanları birleştirerek iki boyutlu bir görüntü oluşturmak.
      4. mpx mCherry-pozitif nötrofil mevcut i sayısını karşılaştırınn IAV-enfekte ve kontrol enjekte zebrafish yüzmek mesane.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, zebrafish sistemik IAV enfeksiyon ilaç etkinliği (Şekil 1A) test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren veriler mevcuttur. 48 saat sonra döllenme Embriyolar, bir viral enfeksiyon başlatmak için Cuvier bir kanal yoluyla APR8 (Şekil 1C, 1F), X-31 (Şekil 1D, 1G) ya da NS1-GFP (Şekiller 1 H-1 H) enjekte edilmiştir. 48 saat sonrası döllenme de embriyoların başka kohort viral enfeksiyon (Şekil 1B, 1E)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

insan konak-patojen modellemek için küçük bir hayvan kullanılarak elde edilen yararları maksimize etmek için, model sisteminin doğasında avantajları yararlanmak araştırma soruları ve hipotez sınaması çerçeve önemlidir. İnsan IAV enfeksiyonu için bir model olarak, zebra balığı, yüksek doğurganlık, optik berraklık, ilaç taraması için amenability ve nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri etiketlemek transgenik kuşaklar mevcudiyeti de dahil olmak üzere pek çok güçlü, yer alır. Zebra balığı inflamasyon ve doğal bağışıklık çal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, zebra balığı bakımı ve bakımı için Mark Nalan'a ve NS1-GFP'yi yaydıkları ve IAV titrelerini belirledikleri için Meghan Breitbach ve Deborah Bouchard'a teşekkür etmek istiyor. Bu araştırma, NIGMS hibesi NIH P20GM103534 ve Maine Tarım ve Orman Deney İstasyonu (Yayın Numarası 3493) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anında OkyanusSpektrumu MarkalarıSS15-10
100 mm x 25 mm steril tek kullanımlık Petri kapları VWR89107-632
Transfer pipetleri Fisherbrand13-711-7M
Trikain-S (MS-222)Filamentli Batı Kimyasal
Borosilikat cam kılcal damar Sutter Enstrümanı BF120-69-10
Alevli/Kahverengi mikropipet çektirmesi Sutter EnstrümanıP-97
AgarozLonza50004
ZanamivirAK BilimselG939
Dumont # 5 forseps Elektron Mikroskobu Bilimleri72700-D
Mikro yükleyici uçlarıEppendorf930001007
Mikroskobu daldırma yağıOlympusIMMOIL-F30CC
Mikroskop aşaması kalibrasyon slaytı AmScopeMR095
MPPI-3 basınç enjektörü Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon
Stereo mikroskopOlympusSZ61
Geri basınç ünitesiUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonBPU
Mikropipet tutucu kitiUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMPIP
Ayak pedalıUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonFSW
MikromanipülatörUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMM33
Manyetik tabanUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonManyetik Baz
Fenol kırmızı Sigma-Aldrich P-4758
Düşük sıcaklık inkübatörüVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
AydınlatıcıZeissHXP 200C
Soğuk ışık kaynağıZeiss CL6000 LED
Cam tabanlı çok kuyulu plaka, 24 kuyuluMattekP24G-0-13-F
Konfokal mikroskopOlympusIX-81, FV-1000 lazer taramalı konfokal sistem
Fluoview yazılımıOlympus
Prism v6GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virüsü Charles Nehri 490710
İnfluenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Charles Nehri 
Manicassamy et al. 2010'da Referans Verilenİnfluenza NS1-GFP
Tg(mpx:mCherry)Lam et al. 2013'te atıfta bulunulmuştur
490715

Kaynaklar

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Zebra Bal nfluenza ModeliAntiviral la TaramaN trofil GSistemik Viral EnfeksiyonLokalize Enfeksiyon ModeliTg mpx mCherry Zebra BalMikroenjeksiyon Tekni iKonfokal Mikroskopi G r nt lemeZanamivir Etkinlik TestiKonak mm n Yan t
İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.