Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Summary

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Abstract

Hücre göçü bağışıklık tepkilerinin, büyüme ve yara iyileşmesi önemli bir parçasıdır. Hücre göçü hücreleri, hücre-dışı matris ve çözünen ve çözünmeyen bir kimyasal faktörleri (örneğin, Kemoattraktantlar) arasındaki etkileşimleri içeren karmaşık bir süreçtir. Bu Boyden Chamber tahlilinde, bir bölücünün iki tarafında hücre sayımı yolu ile çalışma gibi hücrelerin göçünü ölçmek için standart yöntemler. Bu teknikler kullanımı kolay; Bununla birlikte, farklı uygulamalar için çok az bir geometrik değişiklik vardır. Bunun aksine, mikroakışkan cihazlar çözünür ^{faktörlerin, 1, 2} özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanı hücre göçü için kullanılabilir. Ancak, Mikroakiskan tabanlı deneyleri yapma yöntemleri öğrenmek için zor olabilir.

Burada, kimyasal konsantrasyon gradyanı yanıt olarak hücre göçü ölçmek için hücre kültürü odaları oluşturmak için kolay bir yöntem tarif eder. Bizim cep mibütünleştirme oda yönteminin, çeşitli uygulamalar için, hücre göçü incelemek üzere farklı doğrusal konsantrasyon gradyanları oluşturabilir. Bu yöntem kullanımı nispeten kolaydır ve genellikle lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilir.

Mikrokanal odası iyi bir Petri kabı içine nihai mikrokanal odasının şeklinde bir akrilik insert yerleştirerek oluşturuldu. Bundan sonra, poli (dimetilsiloksan) (PDMS) ekin üzerine döküldü. PDMS sertleşmeye bırakıldı ve daha sonra da ekleme uzaklaştırılmıştır. Bu, herhangi bir arzu edilen şekil ya da boyutta kuyu oluşturulması için izin verdi. Hücreler, daha sonra mikrokanal odasına ilave edilebilir ve çözünebilir maddeler arzu edilen maddenin bir agaroz blok ıslatılmasıyla kuyu birine eklenebilir. Agaroz blok kuyu birine ilave edilir ve zaman atlamalı görüntüler hücre göçü miktarını belirlemek amacıyla mikrokanal odasının alınabilir. Bu yöntemin varyasyonları bu yöntem HIG yapmak, belirli bir uygulama için yapılabilirhly özelleştirilebilir.

Introduction

Yara iyileşmesi, bağışıklık tepkileri ve embriyonik gelişim gibi hayati süreçlerin gerçekleşmesi için hücre göçünün gerçekleşmesi gerekir. Hücre göçü, hücreler ve komşu hücreler, hücre dışı matris ve çözünür kimyasal ipuçları (cezbedici veya kovucular) arasındaki etkileşimi içerir. Örnek olarak, yara iyileşmesi sürecinde, fibroblastlar, hücrelerin hücre dışı matris^{3'ü oluşturmak için kollajen sentezlemek üzere yaralanma bölgesine alındığı fibrogenez ve yara kasılmasında ayrılmaz bir rol oynar}. Fibroblastların bir yara bölgesine göçünün arkasındaki çok sayıda mekanizma incelenmiştir ve bunlar farklı mekanik, fiziksel, elektriksel ve kemotaktik faktörleri içerir⁴. Fibroblastlar, büyüme faktörlerinin farklı konsantrasyon gradyanlarına özellikle iyi yanıt verir. Bu farklı büyüme faktörleri, doku rejenerasyonunu optimize etmek için birlikte çalışır⁵. Fibroblastların büyüme faktörü konsantrasyonlarına kemotaktik tepkisini gözlemlerken, fibroblastların yönlü göç paterni ve hedeflerine ulaşmak için kendilerini fiziksel engeller etrafında nasıl yönlendirdikleri incelenebilir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, ilk olarak fibroblast büyümesinin fiziksel engeller tarafından yönlendirilerek izlenebileceği bir sistem geliştirmek ve ikinci olarak fibroblastların sistem boyunca gezinirken büyümesini modellemekti.

Şu anda, Boyden odası testi, hücrelerin göçünü ölçmek için en yaygın kullanılan sistemdir⁶. Boyden odası, her bir kuyucuğun kemoatraktanlı veya kemoatraktansız ortam içerebileceği iki odacıklı çok kuyulu bir plakadan oluşur⁷. Bir filtre membranı, her bir oyuktaki iki oda arasında gözenekli bir arayüz sağlar; Bu, hücrelerin aktif göç olmadıkça geçememesi için bir bariyer oluşturur. Tipik olarak, Boyden odası için, alt odaya bir kemoatraktan eklenir ve sistemin üst ve alt kuyular arasında bir gradyan oluşturmak üzere dengelenmesine izin verilir⁴. Boyden odası tahlili ile ilgili bir sorun, dik gradyanların, zarın yüzeyine dik olan tek bir eksen boyunca oluşmasıdır. Bu, üst ve alt kuyucuklar arasındaki kemoatraktan konsantrasyonundaki farkın, başlangıçta beklenenden daha düşük olmasına neden olur. Bu kısıtlama nedeniyle, Boyden odası testi, belirli hücre tepkilerini eğim ve konsantrasyon farkı gibi belirli gradyan özellikleriyle ilişkilendirmeyi zorlaştırır. Bu ölçümler olmadan, çok gradyanlı sinyal entegrasyonunu incelemek zordur.

Geleneksel Boyden odası testinin bazı kısıtlamalarını ele almak için, özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanları oluşturmak üzere mikroakışkan testler geliştirilmiştir¹. Mikroakışkan sistemler oluşturmak için standart yöntemler, litografik teknikler için temiz odalar gerektirir. Bu tekniklerin öğrenilmesi, özellikle standart bir sınıf ortamında zor olabilir. Bu nedenle, hücre göçünü ölçmek için temiz oda kullanmadan yapılabilecek bir hazne sistemi tasarladık. Sistemimizi kullanarak, tahlilin kuyuları tercih edilen bir boyuta ayarlanabilir ve özelleştirilmiş eğimin doğrusal bir konsantrasyon gradyanı üretilebilir. Bu, rastgele hareketten kemotaksisin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Tasarım, farklı kimyasal uyaranlara yanıt olarak hücre büyümesini modellemek için ucuz ve kullanımı kolay bir sistemdir.

Protocol

1. Bir Konsantrasyon Gradient Oluşturma için Microchannel Chamber Üreten

1. Bir akrilik kalıp parçanın kesilmesi
   1. istenen genişlikte akrilik bir parça elde edilir. Tipik olarak 1/16-inç kalınlığında akrilik levhalar kullanmak. Kalın yaprak onları sürecinde kırmaya veya çözgü neden gerekli mekanik gücüm yok iyi ve çok ince yaprak kesmek zordur.
   2. polidimetilsiloksan (PDMS) içinde bir boşluk üretmek için akrilik parça istenen şekle sahip bir CAD dosyası oluşturun. Bireysel deneysel protokollere uygun istenen degrade elde etmek için kanal genişliği ve uzunluğunu ayarlayın.
      1. Iki kare (0.254 cm x 0.254 cm) bir 0.127 cm genişliğinde kanal tarafından (0.254 cm uzunluğunda) bağlı (Şekil 1): Burada, aşağıdaki boyutlardan bir akrilik parça kullanın.
   3. manu göre bir lazer kesici akrilik parça lazer kesme aparatı içine CAD dosyasını içe ve koyunfacturer protokol.
      NOT: Alternatif olarak, CAD tasarım parça 3D-yazdırın. Bu yöntemin avantajı, diğer maddeler, kalıp için kullanılabilir olmasıdır; Ancak, çözünürlük ve uyarlık lazer kesim ile karşılaştırıldığında 3D baskı ile azaltılabilir.

Şekil 1: Mikrokanal Odası Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) Temsil. Bu görüntü mikrokanal odasını oluşturmak için gerekli akrilik ekin çizim CAD göstermektedir. 1 A) CAD çizim, 1B) inç boyutları ile çizim CAD Side view, 1C) inç boyutları ile çizim CAD Üst bakış Üstten görünüm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. polidimetilsiloksan Dökme (PDMS)
   1. Bir ağırlık teknede ticari Elastomer Sertleştirici (örneğin Sylgard 194), ağırlıkça 1 kısım ticari Elastomer baz ağırlığı (örneğin Sylgard 184) 10 kısım karıştırın. Tipik haliyle, Elastomer Sertleştirici 1 g elastomer tabanı 10 g karıştırılır.
   2. 5 dakika boyunca, bir mikropipet ile taban ve sertleştirme maddesi birleştirmek için karıştırın.
   3. bir vakum çan kurmak ve hava kabarcığı kaldırmak için 30 dakika süreyle vakum PDMS ile tartın tekne yerleştirin.
   4. Vakumu kapatın ve tartmak tekne çıkarın. Küçük bir Petri kabındaki akrilik cut-out üstüne PDMS dökün. PDMS tamamen ekleme kapsar emin olun.
   5. PDMS oda sıcaklığında (en azından 18 saat) bir gecede bekletilmelidir.
3. PDMS gelen parçayı çıkarma
   1. PDMS kür sonra, dikkatlice bir neşter ile akrilik parçası etrafında PDMS keserek çıkartın.

2. Microchannel Odası Hücreler Kaplama

1. Hücreleri kaplama hazne Sterilizasyon.
   Not: PDMS, etilen oksit veya diğer teknikleri kullanarak sterilize edilebilir olsa da, hızlı bir UV muamele hücre kültürü çalışmaları için, hızlı, ucuz ve yeterlidir. kısa UV tedavi süresi PDMS parçasının yapısı veya mekanik bütünlüğüne zarar vermedi.
   1. Standart bir hücre kültürü kabininde tamamen% 70 etanol ile bölmeyi kapsamaktadır.
   2. kapaklı kapalı olarak laminer akış kaputu Petri kabı koyun.
   3. Kaputu kapatın ve UV ışığı açın. 1-2 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalmaktadır.
   4. laminer akış kaputu açın ve akışını yeniden kurmak için 15 dakika bekleyin.
   5. % 70 etanol çıkarın.
   6. steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odaları yıkayın. her bir yıkama için 1 mL PBS kullanın. PBS kaldırmak ve odaları kapaklı kapalı bir gecede kurumasını bekleyin.
      NOT: Alternatif olarak, yerineVarsa bir laminer akış kaput kullanarak, sterilizasyon UV odası kutusunu kullanın. alüminyum folyo ile kaplı bir karton kutusunun arkasında bir UV ışık kaynağı koyarak UV kutusu yapın. Alüminyum folyo örnek da aydınlatma sağlamak için ışık yansıtır.
2. Odasına Hücreler Kaplama
   1. Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
      1. % 0.4 tripan mavisi 400 uL hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. nazikçe cam lamel altında iki bölmeyi doldurarak hemasitometre bu çözümün 100 mcL uygulayın.
      2. hemasitometre ızgara üzerinde odaklanmak için bir 10X amacı ile bir mikroskop kullanın. hemasitometre 16 meydanlarından biri kümesi içinde canlı boyanmamış hücreleri saymak için bir el taksitli sayacı kullanın.
      3. 16 kareler her 4 set halinde hücreleri saymak. 16 kareler 4 setleri ortalama hücre sayısını alın ve 5x10 ⁴ ile çarpın. Bu son sayı numbe olduğunuhücre süspansiyonu hücre / ml r.
   2. Her bir bölme bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. Bu ~ 30,000 / ^cm2 'lik bir yakın konfluent hücre yoğunluğuna çevirir.
   3. Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin).

3. Dekstran Sırılsıklam Agaroz Blokları

1. Bir agaroz blok oluşturma
   1. 3D baskılı kalıbın (2 mm x 2 mm x 2 mm arasında) agaroz% 3 dökün.
   2. 30 dakika kabarcıkları uzaklaştırmak için agaroz bir vakum odasına katılaşmasına izin verin.
   3. kalıptan agaroz bloğunu çıkarın.
      Not: Alternatif olarak, 2 mm kalınlığında, küçük bir Petri kabı içine agaroz% 3 dökün. bir neşter ya da başka kesici alet kullanılarak bir 2 mm x 2 mm x 2 mm'lik bir blok kesin. Bu kalıp sistemi gibi kesin değil ama yapmak için biraz daha kolay olabilir.
2. tamamen submergkemotaktik faktörü istenen konsantrasyonda bir çözelti e agaroz bloğu. konsantrasyon gradyanı oluşumu değerlendirmek için, floresan dekstran ile birinci bölme yıkayın. dekstran konsantrasyonu ve moleküler ağırlığı, bir çözünür faktör veya ilgi duyulan ilaç ile aynı olmalıdır.
3. Agaroz blok gecede ıslatın.

Çözünür Faktörü Konsantrasyon Gradient değerlendirin Dekstran Difüzyon 4. Time-lapse

1. mikrokanal odasının küçük bir kare kuyuda dekstran batırılmış agaroz blok yerleştirin.
2. Bir hücre görüntüleme sisteminde mikro odasına yerleştirin veya bir time-lapse özelliği ile başka bir floresan mikroskop kullanın. üreticinin talimatlarına uygun olarak zaman atlamalı başlayın.
   NOT: Gösterilen sonuçlar GFP filtresi,% 50 ışık, 4/10 pH ve 4X büyütme ile alınır.

Hücre Büyüme 5. Time-lapse

1. bir ucunda, mikrokanal bölmesi Levha hücreleribölme. Burada, 3T3 fibroblastların kullanın. Mikrokanal odası içinde, bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. 2.2.1 açıklandığı gibi hücreleri saymak.
   1. Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin). % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de kaplanmıştır hücrelerle mikrokanal odası tutun. kanaldan hücre göçü bir mikroskop ile görülebilir.
   2. bir belirteç ekleme veya mesafeyi hücre ön hamle ölçmek için bir başlangıç ​​yeri olarak hizmet etmek üzere bir belirteç olarak odasında bir mikroskobik kusur kullanın.
2. Bir agaroz jel (8 ^mm3 blok) ihtiva eden yerleştirerek gradyanı oluşturulması konsantre büyüme faktörü, kemo-çekici, ilaç veya diğer bir faktör, test edilen mikrokanalın bir ucunda (burada,% 40 FBS, örnek olarak kullanılıyor) bölme.
3. Hareketli hücre ön time-lapse fotoğraf çekmek. Burada, sonuçlar fro hücre görüntüleri gösterirnt o bir görüntüleme sistemi kullanılarak 12 saatte çekildi.
4. Hücre büyüme hızını ölçmek için hücre ön resimlerini kullanın. ilk hücre ön, kanal duvarları ve referans markeri ile tanımlanan bir çokgen maske oluşturmak için (roipoly) MATLAB polyfit işlevini kullanarak büyüme oranını hesaplayınız. Bu maskenin boyutları ortalama hücre ön hız hesaplanır hangi ön göç mesafesini verir. Diğer çalışmalar benzer bir yöntem ⁸ kullanmışlardır.
   NOT: Aynı mesafeden çözünür faktörün konsantrasyonuna her karede hücre büyümesi ön kenarını karşılaştırın. çözünür faktör konsantrasyon gradyanı 1D difüzyon modeli yaklaşımı kullanılarak hesaplanır.
5. Phalloidin ve DAPI boyama kullanarak hücrelerin floresan görüntüleri çekmek.
   1. Phalloidin ile boyamadan önce hücreleri sabitleyin.
      1. 37 ° C 'de sıcak bir% 4 paraformaldehid.
      2. hücreleri karşılamak için yeterli% 4 paraformaldehid ekleyin. hücreleri tutun10 dakika boyunca paraformaldehit.
      3. 15 dakika her zaman için iki kez PBS ile durulayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın.
   2. hücreler PBS çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli su-geçirimli çözeltisi (PBS içinde% 0.1 Triton X-100) ilave edin. 10 dakika süre ile çözelti bırakın.
   3. 5 dakika, her seferinde, PBS ile iki kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın.
   4. hücreler PBS çıkarın ve 20 dakika çözeltisi (PBS içinde% 1 sığır serumu albümini) bloke ekleyin.
   5. Bloklama çözeltisi, çıkarın ve her biri 5 dakika bir zaman boyunca PBS ile 2 kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın.
   6. kullanılmadığı zaman, bu noktadan sonra, alüminyum folyo ile ışıktan hücreleri korur. hücreler PBS çıkarın ve 1 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş Phalloidin 488 1:50 ekleyin.
   7. her bir yıkama için, 5 dakika süreyle PBS içinde 2 kez yıkayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. Sonra hücrelerden PBS kaldırmak.
   8. 15 dakika boyunca hücreler PBS içinde 1000: DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol); 1 seyreltilmiştir.
   9. Kaldır DAPI veher bir yıkama için 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri.
   10. Son yıkama çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli PBS ekleyin. Hücreler artık floresan mikroskop ile görüntülenebilir.

Results

Şekil 2, hücre plakalanmıştır burada kanal, zıt uca yerleştirilen fetal sığır serumu gradyanı yanıt olarak kanal boyunca hücre ön hareketini gösterir. Hücre ön 48 saat (Şekil 2A), 72 saat (Şekil 2B), 96 saat (Şekil 2C), ve 120 saat (Şekil 2B) sonrası kaplama gösterilir. Hücre ön hareketi bu zaman atlamalı görüntüleri ile takip edildi ve göç mesafesi ve büyüme oranı MATLAB polyfit işlevi tarafından hesapl...

Discussion

Bizim mikrokanal odası büyüme faktörleri ve kimyasal çekici yanıt olarak, hücre göçü hızının belirlenmesi ve bir polimer matristen bir ilacın difüzyon oranını ölçmek de dahil olmak üzere amacıyla, bir çok kullanılabilir. Hücrelerin büyümesine ve odanın bir ucunda, bir kemoatraktanttır yerleştirmek için mikrokanal bölmesini kullanmak mümkündür. Hücreler kemoatraktan yanıt olarak büyür ve hücre göçü, hücre göçü oranını belirlemek üzere analiz edilebilir zaman atlamalı görüntü alınarak belirlenebilir. Bu yöntemin Örnek son...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti	Sigma-Aldrich	761036	poli (dimetilsiloksan) silikon elastomer taban ve silikon elastomer kürleme maddesi içeren 2 parçalı kit
Akrilik Levhalar	US Plastik	44200
Tek Kullanımlık Petri Kapları	Şahin	25373-041
Floresein izotiyosiyanat – dekstran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agaroz, Tip I, Düşük EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium	Fisher Scientific	11965092	Hücre ortamı bileşenleri
Fetal Sığır Serium	Fisher Scientific	16000036	Hücre ortamı bileşenleri
Penisilin-streptomisin	Fisher Scientific	15140148	Hücre ortamı bileşenleri
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Hücre Görüntüleme Sistemi	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Zaman atlamalı görüntüler çekmek için kullanılan alet
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Model numarası: VLS2.30	Plastik kesmek için kullanılan lazer kesici