Kurutma Hava-LC Arayüz üzerinde Megamolecular Biyopolimerlerin Kendinden entegrasyonu için Yöntemler

Özet

hava-sıvı kristal arayüzünde megamolecular biyopolimerlerin kurutma kaynaklı kendini entegrasyon için bir yöntem olup burada sağlanır. Bu metodoloji Biyopolimerlerin makroskopik potansiyellerini anlamak için değil, aynı zamanda biyomedikal ve çevre alanlarında yumuşak malzemeler için bir değerlendirme yöntemi olarak sadece yararlı olacaktır.

Özet

su kullanımı Yaşayan organizmalar daima ortamda kurutma yatkındır. damar demetleri olarak suyun hareket ettirilmesi ve cilt katmanlarında suyun nemlendirici vakalarında görüldüğü gibi Bunların faaliyetleri, biyopolimer bazlı mikro ve makro yapılar yönlendirmektedir. Bu çalışmada, kurutma üzerine biyopolimerlerin oluşan bir sulu sıvı kristalin (LC) çözeltiler etkisini değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. LC biyopolimerler megamolecular ağırlığa sahip olarak, polisakkaritler, sitoskeletal proteinler ve DNA çalışması seçtik. polarize ışık altında kurutma sırasında biyopolimer çözeltilerinin gözlem kararsız hava LC arayüzü başlayarak milliscale kendini entegrasyonu ortaya koymaktadır. Sulu LC biyopolimer çözeltiler dinamiklerinin bir tek taraflı açık hücreden suyun buharlaştırılması ile kontrol edilebilir. Çapraz-polarize ışık kullanılarak çekilen görüntüleri analiz ederek, yönelim düzeni parametresinde uzay-zamansal değişikliklerin tanımak mümkündür. Buyöntem yapay çeşitli alanlarda malzemeler, aynı zamanda doğal yaşam dokuların sadece karakterizasyonu için yararlı olabilir. Biz biyomedikal ve çevre alanlarında yumuşak malzemeler için bir değerlendirme yöntemi sağlayacağına inanıyoruz.

Giriş

Biyopolimerlerin katı, çubuk şeklinde yapılar üzerinde yoğunlaşarak, dinamik yumuşak malzemeler polisakarit biyofilm matrisler ^1, sitoskeletal proteinler ² oluşan "aktif jeller" ve istenen şekil ³ "DNA origami" da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. yapısal özelliklerini açıklamak için, bir çok stratejileri, transmisyon elektron mikroskopisi, tarama elektron mikroskopisi, atomik kuvvet mikroskopisi ve konfokal floresan mikroskobu olarak, araştırılmıştır. Bu yöntemler çoğunlukla kurutulmuş veya statik halde üstlenilen çünkü Ancak, gerçek yaşam sistemlerinde görüldüğü gibi, makroskopik ölçeklerde dinamik davranışları açıklamak zordur. Son zamanlarda, başarılı bir şekilde polarize ışığın ⁴ boyunca, sulu hava LC arayüzünde biyopolimerlerin dinamik davranışı görülmektedir. yönlendirilmiş bir yapı kazandırmak görselleştirilmesi sırasında biyopolimer kurutulurkenÇözelti, geçici değişiklikler kararsız hava LC arayüzünde biyopolimerlerin kendini entegrasyonunu göstermektedir.

Burada, polarize enstrümanları kullanarak hava-LC arayüzü LC biyopolimer çözeltiler kurutulması için bir protokol açıklar. ^{5, 6} kurutma değerlendirmediğiniz LC fazının diğer analizler aksine, kurutma işlemi sırasında LC dinamikleri tek taraflı açık hücre sıvı fazın yan görünümde yönelim düzeni parametresinin değerlendirilmesinden burada incelenmiştir . Hücre buharlaştırma kombinasyonu ve kontrollü bir buharlaşma yönü ile makroskopik izlenmesi için izin polarize araçların kullanımı. Buna ek olarak, bu yöntem etkinliğini göstermek için, moleküler ağırlık, konsantrasyon vs etkilenen adsorbe mikro bölgeleri, kristalin yapılar üzerinde yoğunlaşarak kurutma kayıtları doğrulamak mümkün olduğunu, kurutma proörneğin polisakaritler, mikrotübüllerin (MTS), ve DNA olarak rijit çubuk şekilleri ile bazik biyopolimerler ve proseslerine araştırılmıştır. bunlar megamolecular ağırlıklara sahip hiyerarşik makromoleküllerin tipik örnekleridir ve bunların moleküller arası etkileşimler LC durumları meydana sağlayacak dolayı bu biyopolimerlerin seçtik.

Protokol

1. Araçlar

1. Polarizasyon cihazı
   1. Bir polarizasyon aygıtı oluşturmak için, bir halojen lamba, bir ışık kılavuzu, polarize, örnek bir sahne, bir optik tren, çubuk anlamına gelir ve bir dijital tek lens refleks kamera (bir ışık kaynağı temin kutuplaşmayı Şekil 1C ve Malzeme Listesi bkz cihaz parçalar).

Biyopolimer Çözüm 2. Hazırlık

1. polisakkarit çözümleri
   1. Birden fazla 12 saat boyunca ~ 80 ° C'de karıştırma ile saf su (100 mL) içinde sacran ⁷ (0.5 g) içinde çözülür. çözünme esnasında, buharlaşmayı önlemek için bir plastik film ile bir kap kapağı. aynı şekilde, ksantan sakızının, sulu bir çözelti hazırlayın.
   2. % 0.5 ağırlık sulu çözeltiler elde etmek için ~ 25 ° C 'de çözüm soğutun.
   3. kirletici maddelerin (48.400 x g, 4 ° C, 1 saat, 3 tim kaldırmak sacran çözeltisi santrifüjes).
2. MT çözümü
   1. Bir Britton-Robinson tamponu içinde% 0.5 ağırlık tübülin solüsyonu (1 mL) ile hazırlanması (80 mM N, N'-bis piperazin (2-etansülfonik asit) (PIPES), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) - N, N, N 'N' tetraasetik asit (EGTA), buz ⁸ ve 5 mM _MgCl2, pH 6.8).
   2. % 0.5 ağırlık tübülin çözeltisi (50 uL) ve kullanım guanozin-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GpCpp) (5 uL), bir GpCpp içeren tübülin solüsyonu (50 uL) hazırlanır. stabil bir MT çekirdeği elde etmek için 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
      NOT: GpCpp rolü MT oluşumunu desteklemek ve tamamen tübülüne MT depolimerizasyonunu bastırmaktır.
   3. stabil bir% 0.5 ağırlık MT çözelti elde etmek için 1 gün boyunca ~ 25 ° C 'de% 0.5 ağırlık tübülin çözeltisi (950 uL) ve GpCpp içeren tübülin solüsyonu (50 uL) karıştırın.
3. DNA solüsyonu
   1. (1 mM EDTA içeren 10 mM Tris, pH 8.0,) Tris-EDTA tampon maddesi çözeltisi içinde bir% 0.5 ağırlık, DNA çözeltisi (1 ml) hazırlayın.
4. Kurutma deney için, 25 ° C 'de% 0.5 ağırlık biyopolimer örnek eriyiği bulundurun.

Çapraz polarize ışık altında 3. Kurutma Deneyleri ve Gözlem

1. Tek taraflı açık hücre içindeki çözeltileri (Şekil 1A)
   1. Bir silikon levha kesme 1 mm bir kalınlığa sahip olan, uygun bir şekil (Malzeme listesi) (5-15 mm, 1 mm bir iç boyutu ve yaklaşık 20 mm, Şekil 1A).
      1. ~ 20 mm ve iki modifiye edilmemiş bir cam slaytlar (76 mm x 1 mm ile 26 x) 5-15 mm arasında, 1 mm bir iç boyutu olan bir silikon ayırıcı oluşan tek taraflı açık hücre monte ve. dışarı sızmasını örnek çözümü tutmak için önceden çift klipleriyle hücrenin her iki tarafını sabitleyin.
   2. Yavaş yavaş ~ 1 mm gözenek boyutlu bir pipet kullanılarak 0.5 ağırlık% biyopolimer çözeltisi (100-300 ul) her bir ekleme~ 25 ° C 'de, her bir hücreye te ucu. bir şırınga iğnesi kullanarak hücrelerin içindeki hava kabarcıklarını çıkarın.
   3. buharlaştırma için atmosfer basıncı altında 60 ° C'de bir hava sirkülatör bir fırında hücreleri yerleştirin; Buharlaşma yönü yerçekimi edilene tersidir.
2. Çapraz polarize ışık altında Gözlemler (Şekil 1B-1C)
   1. Geniş bir alanı (80 mm x 80 mm) üzerinde düz bir yüzey ışık kaynağı ile 100 W halojen lamba aracılığıyla düz bir görülebilir ışık sağlar. Tutucuları (Şekil 1C) kullanılarak 45 ° ve 135 ° 'ye polarizörleri ayarlayın.
   2. Bir optik tren ve çubuk standları (Şekil 1C) kullanılarak ışık kaynağı, polarizörler, numune aşamasında ve kameranın konumlarını saptamak. İki polarizörler Numune katı yerleştirin (polarizörler arasındaki mesafe ~ 5 cm olmalıdır). odaklama sağlamak için numune aşamasından ~ 20 cm kamerayı yerleştirin.
   3. Verilen zamanlarda, pola arasındaki aşama 3.1.3 örnekler yerleştirmekXZ-düzleminde sahne paralel rizers ve siyah bir perde cihazı kapsamaktadır; Gerçek cihaz Şekil 1C 'de gösterilmiştir.
   4. Standart zoom lensle dijital tek lensli refleks kamerasını kullanarak doğrusal çapraz polarize yoluyla örnekleri fotoğraflamak (Malzeme Listesi bakınız). Bilgisayar yazılımı (Malzeme Listesi bakınız) kullanılarak, bu tür odak mesafesi gibi kamera ayarlarını kontrol edin.
3. Iletilen ışık yoğunluğunun uzay-zaman analizi (Şekil 1C)
   1. Kurutma işleminde yönelim düzeni parametre değişikliğini değerlendirmek için, 24 saat boyunca saat başı fotoğraf toplar.
   2. (Örneğin, ImageJ) bir görüntü işleme programı kullanılarak bir gri değer olarak, Z-doğrultusunda merkez hattı boyunca geçen ışık yoğunluğu ölçülür.
   3. üst açık tarafı olan uzaklığın bir fonksiyonu olarak, gri değer grafiğe geçirilir.
4. Çapraz-polarize aydınlatabiliriz altında mikroskopik gözlemlert (Şekil 1D)
   1. Yöntemleri kontrol bir CCD kamera ⁹ ile donatılmış bir polarizasyon mikroskobu ile mikroskobik gözlemler yapmak. ışık yolu bir ilk dereceden geriliği plakasını tutun. PC yazılımı kullanılarak fotoğraflar için koşulları kontrol edin.

Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterildiği gibi, aygıt kullanılarak, mikro bölgesi kendi kendine entegrasyon hava LC arayüzü değerlendirilmiştir bir kurutma (Şekil 2A) ile macrodomain için. Kurutma Deneyin ilk gösterimi olarak, megamolecular polisakaritler, sacran _(Mw = 1.9 x 10 ⁷ g ^mol-1) ve ksantan sakızı (4.7 x 10 ⁶ g ^mol-1) iki türlü karşılaştırıldı. Şekil 2B, çapraz polarize ışık altında...

Tartışma

Dolayı iletilen ışık yoğunluğu çok düşük olmasının kamera numunesi odaklanmak için bazen zor oldu. Bu gibi durumlarda, sahnede uzun bir saydam plastik film yerleştirerek odak düzenlemek için yardımcı oldu. gözlemlenebilir çözünürlük sınırlaması ~, bu durumda 10 mikron kamera lensi bağımlıydı. örnek kalınlığı, Dy, gözlemlenebilir sınırlama ~, bu durumda 10 mm lambanın maksimum ışık şiddetine bağlı olmuştur.

Şekil 1 B 'de gösterilen cihazın avantajı, numune yan resimlerini...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
sacran	Green Science Materials Inc., Japonya		Aphanothece'den sacrum. Mw = 1.9 & kez; 107 g mol-1
ksantan sakızı	Taiyo Kagaku Co., Japonya	Neosoft XC	isimli ev sahibinden Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 &kat; 106 g mol-1
tubulin	Cytoskeleton, Inc., ABD	T240	Domuz beyninden.
GpCpp	Jena Bioscience, Almanya	NU405L
piperazin-N, N & prime; -bis (2-etansülfonik asit)	Sigma-Aldrichi, Co., LLC.	P6757-500G	BORULAR
etilen glikol-bis (β -aminoetil eter) -< > N, N, N', N' < / em>-tetraasetik asit	Dojindo Moleküler Teknolojiler A.Ş.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2O	Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Saf Kimya Sanayi, Ltd	162-21813	pelet
DNA	Sigma-Aldrich, Co., LLC.	D1626	Somon testislerinden Mw = 1.3 &kez; 106 Da (~ 2.000 bp)
Tris-EDTA tampon çözeltisi	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
sürgülü cam	ile Matsunami Glass Ind., Ltd., Japonya	S1111
silikon kauçuk levha	Asone Co.	6-611-32	Kalınlık: 1 mm
santrifüj	Beckman-Coulter, Inc., ABD	JA-20 rotor ışık kaynağı ile donatılmış	Avanti J-25
	Sumita Optical Glass, Inc., Japonya	LS-LHA
ışık kılavuzu	Sumita Optical Glass, Inc., Japonya	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm ve süre; 80 mm
halojen lamba	Ushio Inc., Japonya	JCR 15V150WBN
sahibi	Sigmakoki, Co., Ltd.	KMH-80
numune aşaması	Sigmakoki, Co.,Ltd.	TARW-25503L
numune tutucu	Sigmakoki, Co.,Ltd.	SHA-25RO
çubuk	Sigmakoki, Co., Ltd.	ROU-12-40
direk sahibi	Sigmakoki, Co.,Ltd.	RS-6-40
direk tutucu	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-60
direk tutucu	Sigmakoki, Co.,Ltd.	RS-12-80
direk tutucu	Sigmakoki, Co., Ltd.	RS-12-130
taşıyıcı	Sigmakoki, Co.,Ltd.	CAA-25LS
kamera tutucu	Sigmakoki, Co.,Ltd.	CMH-2
orta optik ray	Sigmakoki, Co.,Ltd.	OBA-500SH
lens tüpü	Tomytech, BORG	lens tüpü BK	80φ, L25 mm
lens tüpü	Tomytech, BORG	lens tüpü BK	80φ, L50 mm
çok bantlı	Tomytech, BORG		80φ
V plaka	Tomytech, BORG	V plaka 60S
plaka tutucu	Viexen, Co., Ltd.	plaka tutucu SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Japonya	8594B001	standart zoom lens ile,  EFP 18-55 mm
fotoğraf yazılımı	Canon Inc., Japonya	EOS Yardımcı
PC	Microsoft	Yüzey
polarizasyon mikroskobu	Olympus	BX51
birinci dereceden geciktirme plakası	Olympus	U-TP530	ve lambda; = 530 nm
CCD kamera	Olympus	DP80
fotoğraf yazılımı	Olympus	cellSens Standard
Java tabanlı görüntü işleme programı	National Institutes of Health	ImageJ