Yöntem makalesi

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

DOI:

10.3791/55278

⸱

2 Mart 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, 2Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M r epressible c ell m arker bir nalysis (MARCM) yaygın karmaşık morfolojileri tasvir ve aksi takdirde işaretlenmemiş ve soğukkanlı içinde nöronların alt kümelerinin genlerin işlevini işlemek için Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanan bir pozitif mozaik etiketleme sistemi osaic organizmalardır. MARCM sisteminde üretilen genetik mozaik mitoz sırasında her iki işaretlenmiş (MARCM klonları) ve işaretlenmemiş yavru hücrelere üretilmesi için ön-madde bölünen hücreler içindeki homolog kromozomlar arasındaki yere özgü rekombinasyon yoluyla aracılık edilir. MARCM yönteminin bir uzantısıdır, adı çift Noktası MARCM (tsMARCM), iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilen yataklı hücrelerin hem de etiketler. Bu teknik, hem hemi-soydan gelen yararlı bilgi alınmasını sağlamak için geliştirilmiştir. kapsamlı tsMARCM klonlarının farklı çiftleri analiz ederek, tsMARCM sistemi, yüksek çözünürlüklü sinir soy Mappin izing ortak progenitör hücrelerden üretilen etiketli nöronların tam doğum sırasını ortaya çıkarmak için. Ayrıca, tsMARCM sistemi, farklı hayvan aynı nöronların fenotipik analizi izin gen fonksiyon çalışmalarını uzanır. Burada, Drosophila nöral gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için tsMARCM sisteminin nasıl uygulanacağını açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir çok sayıda ve nöronların farklı türde oluşan beyin, algılama, süreç ve dış dünyadan sorunlara yanıt yeteneği ile hayvanları endows. Yetişkin Drosophila merkezi beynindeki nöronlar, nöral kök hücrelerin sınırlı sayıda türetilen gelişim 1, 2 sırasında çağrılan Nöroblastlar (Onaylanmış). Onaylanmış Drosophila beyin nöron katılan çoğu kendini yenileyen Onaylanmış Kuruluşlarının ve ganglion anne hücreleri (GOK değerleri) oluşturmak için asimetrik bölünme geçmesi ve GOK değerleri daha sonra (Şekil 1A nöronlar 3 içine ayırt iki kızı hücreleri üretmek için bölünme bir tur geçmesi ). Çünkü nöronal morfoloji karışıklık ve spesifik nöronlar, pozitif bir mozaik etiketleme teknolojisi, bir bastırılabilir hücre markeri (MARCM) ile mozaik analizlerinde ile ilişkili zorluklar, visualizat sağlamak için icat edildiTek bir nöron veya çevre, etiketsiz nöronların 4 nüfusun dışında nöronların küçük bir alt iyon.

MARCM Flippase (FLP) tanımı, normal olarak, bir raportör geninin 4 ekspresyonunu önleyen bir represör genin bir heterozigot aleli taşıyan bir bölme ön-hücre içinde homolog kromozomlar arasındaki site-spesifik rekombinasyon aracılık etme / FLP tanıma hedef (STT) sistemi kullanmaktadır. mitotik bölünmesinden sonra, rekombinant kromozom artık bir hücre homozigot represör genin alelleri ve diğer hücre Resim represör genini-o hücrenin (ve onun soyundan) Raportör ekspresyonu sahip içerecek şekilde, çift hücrelere ayrılmış olan 4 engellendi. FLP stokastik Onaylanmış ve GMC'ler indüklenir sonucunda üç klonal desenler genellikle MARCM deneyde bulunan: tek hücreli çözünürlük nöronal morfoloji tasvir tek hücreli ve iki hücre GMC klonlar,ortak bir NB (Şekil 1B) türetilen nöron bütün morfolojik desenler ortaya n ve çok hücreli-NB klon. MARCM tekniği yaygın beyin çapında kablo ağlarını yeniden nöronal tip tanımlama dahil olmak üzere, Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanmıştır, nöral soy nöronlar, hücre kaderi şartnamede yer alan gen fonksiyonlarının fenotipik karakterizasyonu gelişim tarihini ifşa analizleri ve nöronal morfonogenezi ve farklılaşma 5, 6, 7, 8, 9, 10 inceler. Geleneksel MARCM sadece uyarılmış mitoz rekombinasyon olayından sonra iki yavru hücreye (ve soy) birini etiketler, çünkü işaretsiz taraftan potansiyel olarak yararlı bilgiler kaybolur. Bu sınırlama, temel M uygulanmasını engellerYüksek çözünürlüklü ARCM sistemi hızlı tempoda hücre kaderi değiştirmek çok sinir soy analizleri veya hassas farklı hayvanların 11, 12 özdeş nöronlarda gen fonksiyonlarının analiz eder.

İkiz-spot MARCM (tsMARCM) böylece orijinal MARCM sisteminin 11 sınırlama (üstesinden ikiz hücrelerin her iki tarafın yararlı bilgi kurtarma sağlayan iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilmiş nöronlar etiketleri gelişmiş bir sistemdir Şekil 2A - 2C). TsMARCM sisteminde, iki RNA interferans (RNAi) baskılayıcılar, bir ön-madde, hücre içindeki homolog kromozom trans-sitesi bulunmaktadır tabanlı ve bu baskılayıcılar ifadesi bağımsız olarak, ilgili muhabir (Şekil 2B) ekspresyonunu inhibe eder. FLP / FRT sisteminin aracılık site-spesifik rekombinasyon mitotik sonra, twhaline O RNAi tabanlı baskılayıcılar tat muhabir (Şekil 2B) ekspresyonuna izin vermek için tek kişilik hücrelere ayrılmış. İki klon desenler çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücre tipik olarak bir tsMARCM deneyi (Şekil 2C) görülür. Gibi bilgiler doğum kalma etiketli nöronlar gibi nöral nesilli analiz yüksek çözünürlükte, etkinleştirme diğer taraf için referans olarak kullanılabilir çift yataklı hücrelerin bir taraftan elde edilen ve fenotipik hassas araştırma için farklı hayvan özdeş nöronların analizleri sinir gen fonksiyonu 11, 12 arasında. Burada, (varsa, yanı sıra diğer dokuların gelişimini) Drosophila nöral gelişim çalışmalarını genişletmek için diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan bir tsMARCM deney, yapmak için nasıl açıklayan bir adım-adım protokol mevcut.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gerekli Transgenlerin 11, 13 kullanılarak tsMARCM hazır Sinekler oluşturun

  1. Bireysel sinekler 11 tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sinekler özgün sürümünü oluşturun (bakınız Tablo 1). Aynı sinek stoklarının 13 çoklu transgenler koyarak, daha önce tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranış.
    1. Bir ebeveyn doğrultusunda, FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (ilk muhabir, mCD8 :: GFP transgenlerin araya; transgen ifadesi bir zar-gergin muhabiri üreten yukarı aktivasyon dizisi promoter kontrolü altındadır sıçan küme o ifadesi karşı RNAi, yeşil flüoresan protein ile kaynaşmış farklılaşma 8 proteininin fare küme) ve UAS-rCD2RNAi (ikinci muhabiri ifadesini inhibe baskılayıcıf farklılaşma 2, rcd2) 2. kromozomun sol kolunda. yer dokuya özgü eğer mümkünse, X veya 3. kromozom üzerinde -GAL4 sürücüsü.
    2. Diğer ebeveyn doğrultusunda, FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP transgenlerin araya (ikinci muhabiri, rCD2 :: RFP, diğer zar-gergin muhabir kırmızı floresan proteini ile kaynaşmış rCD2 proteini oluşan) ve UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı, GFP ifadesi karşı RNAi) 2. kromozomun sol kolunda. X veya 3. kromozomun, mümkünse ısı-şok (hs) -FLP veya doku-Seçicilik FLP yerleştirin.
  2. Bireysel sinekler 14 tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sineklerin yeni sürümü oluşturun (bakınız Tablo 1). s tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranışreviously, aynı sinek stoklarının 13 çoklu transgenlerin koyarak.
    1. Bir ebeveyn doğrultusunda, aynı kolunda birlikte bir FRT site ve UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP ve rCD2 ifadesini :: RFP inhibe bastırıcı bir kombine transgen) arasında transgenlerin araya 2. veya 3. kromozomu (STT ve UAS mCD8.GFP.UAS-rCD2i bölgesinin transgenlerin uygun çift Tablo 1 'de belirtilmiştir). Mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-GAL4 sürücüsü yerleştirin.
    2. Diğer ebeveyn doğrultusunda, bir FRT site ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (diğer kombine rCD2 bir transgen :: RFP ve mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı) aynı kolun içinde transgenlerin araya STT transgenlerin 2. veya 3. kromozom (uygun çiftlerinin ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi) Tablo 1'de gösterilmiştir. Yeri hs-FLP veya mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-FLP.

2. Çapraz tsMARCM hazır Onların Döl içinde tsMARCM klonlarının oluşturmak için Sinekler

  1. Birlikte Çapraz tsMARCM hazır sinekler taze bir sinek gıda şişede (örneğin, birlikte adım 1.1.2 veya 1.2.2 uçar adım 1.1.1 ya da 1.2.1 ve 20-30 bakire kadın 10-15 erkek sinekler koymak) şişenin duvarda -yapılan maya yapıştırın.
  2. döllenmiş yumurta toplama önce çiftleşme şansı artırmak için 2 gün boyunca 25 ° C'de geçti tsMARCM hazır sinekler koruyun.
  3. Sık transferini kolaylaştırmak için (boğmakta önlemek sinekler aşağı dokunun veya sinekler uyutmak için karbondioksit kullanmak için taze mayalı şişeleri içine geçti tsMARCM hazır sinekler aktarmak; aracılığı ile 10 ml sinek gıda 80-100 döllenmiş yumurta daha fazla tutmakl) çok fazla yumurtadan larva önlemek için.
  4. Kültür tsMARCM hayvanlar (örneğin, döllenmiş yumurtalar, tsMARCM hayvan genotipinin bir örneği, Şekil 3'te kullanılan şekliyle, HS-FLP [22], a / a; UAS mCD8 :: GFP, UAS rCD2RNAi, FRT 40A GAL4-GH146 / UAS rCD2 :: RFP UAS GFPRNAi, FRT 40A +; arzu edilen aşamada (embriyo, larvalarına karşı geliştirmek kadar 25 ° C 'de seri olarak transfer şişelerde atılmıştır +), veya pupa).
  5. oluşturmak için FLP ekspresyonunu indükleyen ısı şok uygun zamanı belirlemek aktarılır 10 için 37 ° C su banyosu, 20, 30, 40, aynı gelişim aşamasında tsMARCM hayvan içerir şişe ve 50 dakika yerleştirin Çevrede tsMARCM klonları. Doku Seçicilik FLP tsMARCM deneyde kullanılan ediliyor bu adımı atlayın (hs-FLP sinir soy tercih edilir analizleri bu tercihin nedenleri daha önce 15 tarif edilmiştir).
    NOT: ilgi daha fazla tsMARCM klonları istedi eğer gelecekte tsMARCM deneylerinde ısı şoku optimal zamanı kullanarak adımı yineleyin 2.5; Genellikle, daha FLP ifade ile kıyaslandığında, hs-FLP [22] indüklenir hs-FLP [1] Aynı ısı-şok süresi.
  6. Kültür onlar 25 ° C'de ısı şok tsMARCM hayvanlar uygun gelişim aşamasına ulaştı ve ardından 3. adıma geçin kadar.

3. Leke hazırlayın ve Dağı Fly Brain tsMARCM klonlarının İçeren

  1. forseps koruma yemekleri hazırlayın. A bileşenini (30 g) ve aktive edilmiş mangal kömürü (0.25 g) ile Silikon Elastomer Kit B bölümünde (3 g) karıştırın. Uygun yemekleri içine karışımı dökün.
  2. Diseksiyon mikroskobu ile görüntülenen bir forseps koruma çanak forseps kullanarak 1x fosfat tamponlu tuzlu su içinde tsMARCM hayvanlar (PBS) üzerinden larva, pupa veya ergin beyinleri teşrih. NOT: sinek beyin diseksiyon için bir protokol azalan olmuşturDaha önce 16 belirlemiş.
  3. 1X PBS, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 formaldehit içeren bir cam Noktası plaka uçucu beyinleri düzeltildi. adımların geri kalanı için bu cam nokta plakasında sinek beyinleri işleyin.
  4. Kaldırmak PBT:; yıkama PBT çıkarın ve hızlı bir şekilde yeni PBT ekleyin: sinek beyinleri% 1 PBT (1 x PBS,% 1 Triton X-100 ihtiva eden) ve% 1 PBT (durulamada 30 dakika boyunca her biri üç kez yıkama ile üç kez yıkayın yeni PBT eklemek ve bir orbital karıştırıcı kullanılarak yeni PBT sinek beyinleri) kuluçkaya yatmaktadır.
  5. gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat için birincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. ihtiva eden ve fare anti-Bruchpilot (BRP) antikoru (1:50),% 1 PBT: tavşan anti-DsRed antikoru (800 1): Primer antikor karışımının bir örneği, sıçan anti-CD8 antikoru (1: 100) olan % 5 normal keçi serumu (NGS).
  6. Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın.
  7. gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat için ikincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. Ve keçi anti-fare: sarı floresan boya (800 1) ile konjuge keçi anti-tavşan IgG antikoru: sekonder antikor karışımının bir örneği, yeşil floresan boya (800 1) ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG antikoru olan % 5 NGS içeren% 1 PBT: IgG antikoru uzak-kırmızı-floresan boya (800 1) ile konjuge.
  8. Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın. Bir anti-söndürme maddesi ile mikro lam üzerine monte edin. sinek beyinleri kapsayacak ve korumak için mikro slaytta bir mikro cam kapak koyun. net oje kullanarak mikro kapak camı ve mikro slayt kenarları mühür. Bu monte edilir ve 4 ° C'de beyin numuneleri sinek kapalı saklayın.

4. Süreç alın ve tsMARCM Klonların Floresan Görüntüler analiz

  1. tsMARCM klonları fr floresan görüntüler yakalayınom numuneler tercih konfokal mikroskopi sistemini kullanarak adım 3.8 oluşturulan.
  2. Iki boyutlu içine tsMARCM konfokal floresan görüntülerin proje yığınlar, seçim konfokal mikroskopi sistemi ile birlikte verilen görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri düzleştirilmiş (Şekil 3B bakınız - basık örnekleri için 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O ve 3Ç konfokal floresan görüntüler).
  3. Uygun bir görüntü işleme yazılımı (ImageJ 17, örneğin, "Hücre Sayaç" fonksiyonunu kullanarak tsMARCM klonlarının çoklu hücresel NB iki hücre sayısını, hücre örnekleri için Şekil 3E, 3j, 3O ve 3T bakınız nöronların organları).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tsMARCM sistemi ortak Onaylanmış türetilen nöronlar üzerinde önemli bilgiler alarak sinir soy analizleri ve gen fonksiyon çalışmaları kolaylaştırmak için kullanılır olmuştur. Sistem, nöronal türleri (hepsi değilse de) çoğu belirlemek her nöronal tip hücre sayısını belirlemek, ve tsMARCM kullanarak bu nöronların doğum sırası 11, 12, 18 (detaylar için Tartışma Bölüm bakın tespit e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 Adımlar ve 3.2 iyi tsMARCM sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sinir atalarda GAL4 ifade etmez, dokuya-özgü -GAL4 sürücüler adımları 1.1.1 ve 1.2.1 için tercih edilir. Adım 2.3 sinek gıda şişeleri yetiştirilen hayvanların aşırı kalabalık kaçının. Indüksiyon gecikme, ısı şoku üzerine FLP ifade seviyesi, ve sinir atalarıdır (yani, Onaylanmış ve GOK değerleri) ortalama bölen süresi bilinmemektedir, çünkü ısı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen (EN 104-2311-B-001-034) ve Hücresel Enstitüsü ve Organismic Biyoloji, Academia Sinica, Tayvan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Karbondioksit (CO2)Yerel satıcın.a.Anestetizesinekler
CO2 pedYerel satıcın.a.Sort, çapraz ve transfer sinekleri
10x PBS pH 7.4Uniregion Bio-Tech (veya diğer satıcılar)PBS001Sinek beyinlerini inceleyin, durulayın, yıkayın ve immünostain yapın
FormaldehitSigma-Aldrich 252549Sinek beyinlerini düzeltin
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Sinek beyinlerini durulayın, yıkayın ve immünostain yapın
Normal keçiJackson ImmunoResearch 005-000-121İmmünostain sinek beyinleri
serumu
Sıçan anti-fare CD8 antikoruInvitrogenMCD0800Immunostain sinek beyinleri
Tavşan anti-DsRed antikoruClonetech632496Immunostain sinek beyinleri
Fare anti-Brp antikoruGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankasınc82İmmünostain sinek beyinleri
Alexa Fluor 488InvitrogenA11006ile
InvitrogenA11035konjuge keçi anti-tavşan IgG antikoruİmmünostain sinek beyinleri
Alexa Fluor 647 ile konjuge keçi anti-fare IgG antikoruInvitrogenA21236İmmünostain sinek beyinleri
SlowFade altın antifade reaktifiMoleküler ProblarS36936Sinek beyinlerini monte edin ve floresan söndürmeyi koruyun 
PYREX 9 çöküntü cam spot plakasıCorning7220-85Sinek beyinlerini diseksiyon, durulama, yıkama ve immünostain
Sylgard 184 silikon elastomer kitiDünya Hassas AletlerSYLG184Beyin diseksiyonu sırasında forsepsleri korumak için siyah Sylgard tabakları yapın
Aktif kömürSigma-Aldrich242276-250GSiyah Sylgard yemekleri
yapın Dumont #5 forsepsGüzel Bilimler Araçlar11252-30Sinek beyinlerini inceleyin ve monte edin
Mikro slaytCorning2948-75x25Sinek beyinlerini monte edin
Mikro kapak camı No. 1.5VWR International48366-205Sinek beyinlerini monte
edin OjeYerel satıcımevcut değilMikro slaytlarda mikro kapak camını kapatın
İnkübatör Kansin InstrumentsLTI603kültürü 25 ° C'de uçuyor; C
(veya diğer satıcılar)
Su banyosuKansin InstrumentsWB212-B237 ° C'de sineklerde ısı şokunu indükler; C
(veya diğer satıcılar)
Orbital çalkalayıcıKansin InstrumentsOS701Sinek beyinlerini yıkayın ve immünostain yapın
(veya diğer satıcılar)
Diseksiyon mikroskobuLeicaEZ4Sinekleri sıralayın, çaprazlayın ve transfer edin; Sinek beyinlerini diseksiyon, durulayın, yıkayın ve immünostain yapın
Konfokal mikroskopZeiss (veya diğer satıcılar)LSM 700 (veya diğer modeller)Image tsMARCM,
görüntü işleme yazılımı 1
(örn., Zeiss LSM görüntü tarayıcısı) 		ZeisskullanılamıyorProje konfokal görüntü yığınları
görüntü işleme yazılımı 2
(örn., ImageJ) 		mevcut değildeğiltsMARCM klonlarının hücre sayısını
konjuge keçi anti-sıçan IgG antikoruAlexa Fluor 546 ile mevcut

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
  2. Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
  3. Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  6. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
  9. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  10. Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
  11. Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
  12. Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  14. Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
  15. Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
  16. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).
  19. Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
  20. Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  22. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  23. Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre Soyu AnaliziDrosophila N robiyolojisiFlippaz EkspresyonuKonfokal MikroskopiIs oku ProtokolN ral Soy HaritalamaMozaik aretleme SistemiGenetik Mozaikler

İlgili makaleler