Yöntem makalesi

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

DOI:

10.3791/55282

⸱

24 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mathematical and Physical Sciences, Faculty of Science, Japan Women's University, 2Department of Bioorganization Research, Okazaki Institute for Integrative Bioscience, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of Life and Coordination-Complex Molecular Science, Institute for Molecular Science, National Institutes of Natural Sciences, 4Research Center for Complex Systems Biology, The University of Tokyo

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek oranda paketlenmiş mikrometre boyutunda bileşenler içeren dev kesecikler kullanışlı hücre modelleridir. Yağda su emülsiyonu santrifüjleme yöntemi, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin hazırlanması için basit ve güçlü bir araçtır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

yapıcı biyoloji ve yapay bir yaşam oluşturmak için sentetik biyoloji yaklaşımı biyolojik veya biyolojik olmayan materyallerin aşağıdan yukarıya düzeneğini içerir. Bu tür yaklaşımlar yaşam ve cansız madde arasındaki sınırda araştırma önem aldık ve son yirmi yılda yapay hücreleri oluşturmak için kullanılır olmuştur. Özellikle, Dev veziküller (GV) çoğu zaman yapay hücre membran olarak kullanılmıştır. Bu yazıda, son derece yoğun biyomoleküllerin içeren hücrelerin bir model olarak oldukça dolu mikroküreler encapsulating GVs hazırlanmasını tarif etmektedir. GV basit bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifügasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Spesifik olarak, bir homojenleştirici malzeme kapsüllenecek ihtiva eden sulu bir çözelti ve çözünmüş fosfolipid ihtiva eden bir yağ emülsiyon haline getirmek için kullanılan ve elde edilen emülsiyon bir sulu çözeltinin yüzey dikkatle tabakalanmıştır. Tabakalı sistem, ardından t santrifüjlenmiştiro GV oluşturmak. Bu güçlü yöntem, küçük moleküllerden mikrosferler kadar maddeleri kapsüllemek için kullanılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

yapıcı, ya da sentetik biyoloji yaklaşımı yaşam arasındaki sınırı keşfetmek ve konuyu cansız için büyüleyici bir cadde. Hücre yaşam için gerekli asgari birim olduğundan şu anda anladığımız gibi çeşitli araştırmacılar, yapay hücrelerin içinde meydana gelen olaylar ele alınabilir ve böylece açıklık nihai hedefi, basit, iyi anlaşılmış kimyasallardan yapay hücreleri oluşturmak için çalıştılar hayatın kökeni ve canlı hücreler 1, 2, 3 temel fonksiyonları okuyor. Özellikle, 4 veziküller, amfifilik moleküllerden oluşan küresel microcompartments ve bu tür proteinlerin 5, 6 ve DNA 7, 8, 9 biyolojik moleküllerin kapsülleyen olanlass = "xref"> 10, genellikle biyolojik membranların model olarak kullanılmıştır.

Vesiküller, büyük (çapı <1 um), veya dev (çapı> 1 um) (<100 nm arasında bir çapa sahip olarak tanımlanmıştır), küçük olarak sınıflandırılabilir. bu boyut, şekil ve yapıda canlı hücreler benzer çünkü Dev veziküller (GV) yaygın olarak incelenmiştir. GVs büyüklüğü nedeniyle, GV membran morfolojik değişiklikleri kolayca bir optik mikroskop altında, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

GV hazırlanması için bir çok yöntem sıvı alımı yöntemi 12, 13, donma-çözülme yöntemi 14, electroformation yöntemi 15, 16 ve sıvısal cihaz yöntemi 17, 18 dahil olmak üzere, 11 bildirilmiştir. Bununla birlikte, kapsülleme proteinler ve diğer MACROMBu yöntemler vasıtasıyla yüksek konsantrasyonlarda GVs bölgesindeki olecules zordur. Özellikle, hücre 19, 20 içinde kalabalık bir ortamda taklit etmek için yeterli miktarda (20-30 hacim olarak%) biyolojik malzemelerin kapsüllenmesi için son derece zordur. GV anında Weitz ve çalışma arkadaşları, emülsiyon santrifügasyon yöntemi 21, 22 (w / o), bir su-içinde-yağ tesis oluşturmak. Bu yöntem, beş önemli özelliklere sahiptir. Bu yöntemle hazırlanan GVs düşük lameller 23, 24, çünkü İlk olarak, kendi membranlar kolayca deforme olabilir, böylece ince. FtsZ (bakteriyel hücre bölünmesi proteini), tübülin ve diğer makromoleküller tarafından uyarılan GV membran deformasyon, 27, 26, 25 28 incelenmiştir, ve polyhe gözlenen mikro-29, 30 kapsüllenmesi ile indüklenen GV membran Dron benzeri deformasyon. İkinci olarak, zar proteinleri zorluk 31 ile de olsa, bu yöntemle, veziküler membran içine sokulabilir. Örneğin, Yomo grup membran proteini α-hemolizin 32 in vitro sentezini ve gözenek oluşturucu etkinliğini incelemek için bu yöntem kullanılır. Üçüncü olarak, iç ve dış broşür lipid bileşenleri, farklı 22 olan asimetrik GVs üretmek mümkündür. Örneğin, Whittenton ve diğ. negatif yüklü polinükleotidleri saklanması iç talimatında katyonik lipidler, ve dış broşürde nötr lipidler ile oluşturulan asimetrik GV toksisite ve nonspesifik hücresel alımı 33 azaltmak için. Dördüncü olarak, GVs içindeki maddelerin konsantrasyon ve hacim fraksiyonu nispeten yüksek olabilirs = "xref"> 28, 34. Beşinci olarak, malzeme birden fazla türde 35 kapsüllenebilir. Örneğin, Nishimura ve diğ. GVs içine bir in vitro transkripsiyon-translasyon sistemi kapsüllenmiş ve GVs 36 olan yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek için sistem kullanılır. Bu beş özellik emülsiyon santrifüj hücre taklit Gvs üretmek için vazgeçilmez bir yöntem w / o olun.

Önceki çalışmada, santrifüj ile oluşturulan GVs nihai sulu çözeltinin 22 bazı içeren uzun 16 G, paslanmaz çelik bir iğne ile donatılmış bir şırınga vasıtasıyla toplanmıştır. deneyimsiz teknisyenleri elinde, bu toplama yöntemi kolayca yağ bazı GV kirlenmesine neden olabilir. Bu çalışmada,, Yomo grup 23, 37 tarafından geliştirilen s / y emülsiyonu santrifüj protokolü kullanılanbir delik de hazırlanmış olan santrifüj tüpünün tabanına açılan yoluyla hangi çökelmiş GVs toplanır. Biz hücre içi organellere boyutunda benzer 1.0 mikron mikroküreler, kapsülleme Gvs hazırladı. mikroküreler kullanımı bize onların hacim fraksiyonu hesaplayarak kendi konsantrasyonunu tahmin etmek izin verdi. Malzemeler yoğun şekilde paketlenmiş edildiği GVs hazırlanması için bir yöntemin oluşturulması yapay hücreleri oluşturmak için önemli bir adımdır. İç malzeme türleri için protokol yararını teyit etmek için, daha da GFP ve küçük bir suda çözünür floresan molekül (Uranine) GVs kapsüllenmiş edilebilir olduğunu göstermiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Su / Yağ emülsiyonu santrifügasyon yöntemi ile GVs hazırlanması 1.

  1. 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin bir stok çözeltisi (DOPC, 25 mM) ve Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn -glisero-3-fosfoetanolamin bir stok solüsyonu, trietilamonyum tuzu (Texas Red hazırlanması DHPE, 0.20 kloroform içinde mM) ve -20 ° C'de stok solüsyonları saklayın.
  2. Bir yağ çözeltisi hazırlayın.
    1. DOPC stok çözeltisi (51.0 ul ve azot gazı akışı altında Texas Red DHPE stok çözeltisi (19.2 ul) oluşan bir karışım buharlaştırılır ile 5 ml'lik bir cam şişenin iç yüzeyinde bir lipid filmi oluşturmak.
    2. Gece boyunca indirgenmiş basınç altında bir film inkübe ve sonra, (g / cm3 0.86-0.89) şişeye sıvı parafin 1.0 ml. alüminyum folyo şişeyi sarın ve geri kalanı 80 ° CO / N it at kuluçkaya yatmaktadır. 3 mM - DOPC ve Texas Red DHPE son konsantrasyonları 1.3 ve 3.8 x 10 vardırVe sırasıyla DOPC: 0.3: Texas Red DHPE mol oranı 100'dür.
  3. İç sulu dispersiyonu hazırlanır.
    1. 1.5 ml kapaklı mikrotüp, 1.0 um nonfluorescent mikroküreler (2.5 hacim%) ve 1.0 mikron floresan mikroküreler (2.5 hacim%) içindeki bir dispersiyonun 12.5 ul dispersiyonun 237.5 ul karıştırın; Floresan mikrosferler nonfluorescent 5 (h / h) oranında bu 95 karşılık gelir.
    2. Tris tamponlu solüsyon 125 ul (TBS, 1 M) ve deiyonize su 875 ul ve ardından sükroz, 64 mg ekleyin. mikrosferlerinin nihai hacim fraksiyonu 0.5 hacim% olduğu, ve Tris-HCl (pH 7.5) ve sukroz nihai konsantrasyonları sırası ile, 0.1 ve 0.15 M vardır.
    3. Vorteks 30 saniye boyunca mikrotüp ve daha sonra 10 dakika için sonikasyon.
  4. Dış bir sulu çözelti hazırlayın.
    1. Tris-tamponlu bir çözelti, 10 ml hazırlanmasından sonra (0.1 M Tris-HCI [pH 7.5], 0.15 M glukozitOSE) iç sulu ortam ile aynı prosedürde, mikrotüp kapaklı 1.5 ml çözeltinin 1 mi yerleştirin. Vorteks 30 saniye boyunca mikrotüp ve daha sonra 10 dakika için sonikasyon.
  5. Mikro küreleri içeren w / o emülsiyonu hazırlayın.
    1. 1.5 ml'lik bir mikrotüp iç sulu çözelti 300 ul yağ çözeltisi (sıvı parafin ihtiva eden DOPC ve Texas Kırmızı DHPE) 1 ml karıştırın.
    2. mekanik homojenleştirici (yüksek hızda dönerler bıçaklı bir karıştırıcı) kullanılarak mikrotüp iki bileşeni emülsifiye oda sıcaklığında 2 dakika için 10,000 rpm'de çalıştırılan.
  6. GV hızlandırabilir.
    1. Yavaşça mikrotüp kapaklı 1.5 ml, 4 ° C de, dış sulu çözelti, 1 ml üst yüzeyinde s / y emülsiyonunun 300 ul tabaka. 4 ° C'de 10 dakika süre ile, mikrotüpü Chill.
  7. GV toplayın.
    1. Hemen mikrotüp ürpertici sonra,30 dakika süre ile 18,000 x g de santrifüjlenir. Bir raptiye ile mikrotüp alt piercing ve sterilize 1.5 ml mikrotüp bir damlacık toplayarak çöktürülmüş Gvs elde edin.
    2. Elde edilen GV gözlem zorlaştırmak için yeterince büyük miktarlarda elde edilmesi durumunda seyreltilir çökelen GV dış sulu çözeltisi ile hacim olarak 10-100 misli damlacıklara bölünür.

GVs 2. Mikroskopi Gözlem

  1. Mikroskopi numune hazırlamak.
    1. Bir mikroskop kapak cam üstüne yerinde polimeraz zincir reaksiyonu ve melezleme (kamara boyutu kalınlığında 9 mm x 9 mm x 0.3 mm) bir yapıştırıcı kuluçka odasına yerleştirin.
    2. bir mikropipet kullanarak, seyreltilmiş mevduat 25 ul numune alan üzerinde Gvs çöktürülmüş ve hemen kuluçka odasının üstüne başka cam kapak (yaklaşık 0,15 mm kalınlığında) yerleştirin.
  2. Kayıt diferansiyel girişim contrasGVs t mikroskobu görüntüleri.
    1. Bir 12V100WHAL-L halojen lambası ile donatılmış bir mikroskop (10X, 20X ve 40X hedefleri) ile veziküllerin rekor mikroskobu görüntüleri.
  3. Floresan mikroskobu incelemelerde bulunmak.
    1. mikroskop içine U-FBNA ve U-FMCHE floresan ayna birimleri yerleştirin. ve sırasıyla, 510-550 nm ve 600-690 nm ışık iletimi radyasyon filtreleri 470-495 nm ve 565-585 nm eksitasyon filtreleri üniteleri yerleştirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S / y emülsiyonu santrifiij yöntemi, Şekil 1 'de fotografik ve şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 1 'de şematik bir görüntüsü Bu yöntemin başarısı en önemli belirleyicisi GVs santrifüj sırasında çökelmesi böylece iç sulu çözeltinin özgül ağırlığı, dış sulu çözeltisi daha büyük olması gerektiğini olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, su / yağ ara yüzeyinde bir lipid tek tabaka oluşumu emülsiyonu dış sulu çözeltisi üzerine yerleştirilmiş sonra sistemin 10 dakika için soğutulmuş gerektirir. W / O arayüzü boyunca emülsiyon damlacıklarının transferi ile GV formu için, iç ve dış sulu tabakalar ozmotik basınç aynı olması gerekir. Bir kontrol deneyinde olduğu gibi, işlem vasıtasıyla herhangi bir mikro küreleri içeren da hazırlanabilir GVs, Şekil 1 'de gösterilen ve iç sulu çözelti olması dışında, 1.3 adımmikro-olmadan hazırlandı.

Santrifüj işleminden sonra çökelen GVs toplanması, Şekil 2'de gösterilmiştir. Mikrotüp en altındaki yarı saydam faza ek olarak, aynı zamanda, dış sulu bir çözeltisi (Şekil 2a), beyaz bir bulanık ara faz görülmektedir. Alt faz GVS içerdiği oysa Bu ara aşama, mikroküreler ve petrol toplanmaları zengin oldu. Bu nedenle, bir iğnenin (Şekil 2b) ile mikrotüp alt delici sonra GVs büyük miktarda ihtiva sadece ilk damla (Şekil 2c) toplandı. En fazla iki damla toplanır emin olmak için önemlidir; Başka damla GVs daha düşük bir yoğunluğa neden olur mikrosferler ve lipid toplamalardan içerebilir. Elde edilen veziküllü dispersiyon genellikle GVs dışında kapsüllenmiş malzemeler ihtiva ofte GVs nedeniylesantrifüj sırasında n rüptürü. Sadece GV elde edilmesi için, diyaliz, jel filtrasyonu ya da floresans ile aktive edilen hücre gibi bir ayırma yöntemi kapsülleme malzemelerinin boyutları nedeniyle seçilmelidir sıralama. Çökelen GV kullanılacak olan amaç için Gerekirse, dış sulu çözelti ile seyreltilebilir. Bazı durumlarda, ara faz oluşan herhangi bir veziküller yağ ile bir arada tutulduğunu gösteren, tüpün altına uzatılabilir.

Bu mikro-olmayan GV diferansiyel girişim mikroskopisi ve floresan mikroskobu görüntülerini elde (Şekil 3a, 3b) ve mikrosferler ile (Şekil 3C -3, f). Daha önceki raporlarda 23, 37 ile uyumlu olarak, düşük bir lameller olan GV eden protokol ile oluşturulmuştur. Kırmızı Fluores yayar Texas Red DHPE, konjuge Lipidlerbu vezikül oluşumu doğrudan ince zarın görselleştirme ile doğrulanabilir böylece artmasına neden olmuştur, kullanılmıştır. Elde 160 GV, 55 kapsüllü mikroküreler ve 105% 34 kapsül oranını veren boştu.

Aşağıdaki yöntemi ile GVs mikrosfer hacmi fraksiyonu (j, hacimce%) belirlendi. Her GV birkaç yüz mikro küreler onlarca içerdiğinden, bir optik mikroskop altında mikro küreler sayımı zordur. Bu nedenle, manüel olarak floresans mikroskop altında sayıldı flüoresan mikro-küçük bir miktar ile nonfluorescent 1.0 um mikro küreler karıştırılır. Kapsüllenmiş mikro-sayısı (K), 20 el ile sayılmıştır flüoresan mikro-sayısı (n) çarpılmasıyla hesaplanmıştır (: floresan mikrosferler nonfluorescent 5 [h / h] 'ye oranı, orijinal 95 göre). Değeri66; sonra v mikro kürelerin hacmidir ve V ise, herbir GV hacmi Nv 100 / V olarak tahmin edilmiştir. N, N olduğu tahmini sayımı hatalara neden olur not edin ve φ hesaplanırken bu hatalar dikkate alınmalıdır. Φ değeri doğrudan 20 N olarak hesaplanmıştır N, tahmin edilen, ve bu da φ olasılık ile sonuçlanmıştır doğru gerçek değeri% 50 N 20 N etrafında bir ölçüde dalgalanır, bu yüzden ben n hata olduğu, (n i ±) 20 olarak dikkate almak gerekir. Bu bir N olasılığı bir Poisson dağılımına dayanarak elde edilen% 50 den fazla olabilir ± sırayla i tahmin etmiştir. Biz buna bize 20 hesaplamak (n i ±) ve değerleri için izin, hangi i tahmin66; Bu 10 ve 15 um (Tablo 1) çapları GVs hatalarını sayma dahildir. Bu prosedüre göre, Şekil 3C'de gösterildiği GV mikro-hacim oranı 11 ± 3 hacim% olarak tahmin edilmiştir. hesaplanan hacim fraksiyonu hassas% 10-30 idi.

Bizim sonuçlarımız başarılı bir yüksek hacimli kısmını GVs 1 mikron mikroküreler kapsüllü olduğunu göstermektedir. Aynı dış sulu çözelti ve aynı protokol (Şekil 4) kullanılarak da 100 mol% DOPC GVs içine diğer malzemeleri saklanması başardık. Özel olarak, 0.1 um mikro küreler içeren GV 0.1 M Tris-HCl 1.0 mikron mikro küreler içeren GVs için tarif edilen protokol ile (pH 7.5), 0.15 M sukroz ve 0.5 hacim% flüoresan mikro küreleri içeren (bir Tris-tamponlu çözelti hazırlandı Şekil 4a). protokol açıklanan abov ardındanE, GFP (0.1 M Tris-HCI [pH 7.5], 0.15 M sukroz ve 100 ug / mL GFP Şekil 4b) ihtiva eden DOPC GV ve Uranine ihtiva GVs (0.1 M Tris-HCI [pH 7.5], 0.15 M sukroz, 30 uM Uranine Şekil 4c) de hazırlanmıştır.

n N φ (10 um çapında) φ (15 um çapında)
3 60 ± 20 6.0 ± 2.0 1.8 ± 0.6
4 80 ± 20 8.0 ± 2.0 2.4 ± 0.6
5 100 ± 20 10 ± 2 3.0 ± 0.6
6 120 ± 30 12 ± 4 3.6 ± 1.2
10 200 ± 32 20 ± 3 5.9 ± 0.9
20 400 ± 45 40 ± 5 12 ± 2
30 600 ± 55 - 18 ± 2
metinde tarif edilen bir hatalar belirlendi; n = elle sayıldı mikro-sayısı; kapsüllü mikroküreler N = toplam sayısı.

Tablo 1: Mikrokürelerinin bir Sayıları ve Ses Kesirler (φ, hacimce%). metinde tarif edilen bir hatalar belirlendi; n = elle sayıldı mikro-sayısı; Kapsüllü mikroküreler N = toplam sayısı.

figure-results-1
Şekil 1: Akış Ch sanat ve / W O Emülsiyon Santrifüj Yöntemi şematik tasviri. (A) DOPC ve Texas Kırmızı DHPE oluşan yağ çözeltisi: sıvı parafin (100 0.3 mol oranı). (B) Tris-HCI tamponu içinde sükroz ve mikro-oluşan iç sulu dispersiyon. (C) Tris-HCI tamponu içinde glikozdan oluşan dış sulu çözeltisi. (D), yağ çözeltisi, 1 ml ve iç sulu dispersiyon 300 ul karışımı. Bir homojenizer (10.000 rpm, 2 dakika) ile (E) Buharlaşma. (F) W / O emülsiyonu. Dış sulu çözelti, 1 ml emülsiyon 300 ul (g) Katmanlama. (H) çöktürülmüş GV hemen sonra santrifüj. (I) s / y emülsiyonu santrifügasyon yöntemi prensibi şematik olarak gösterilmesi. Siyah ok merkezkaç ivme yönünü gösterir..jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: mikrotüp Piercing. (A) çöktürülmüş GV sadece (ayrıca Şekil 1 saat tasvir) santrifüj sonra. Kırmızı elips Çökelen GV dispersiyon damlacığı gösterir. Bir raptiye ile mikrotüp (b) Pirsing. GVS içeren pelet bir raptiye ile dibe yakın mikrotüp piercing ve delikten damlacıkları toplanmasıyla elde edilmiştir. Dış sulu çözelti ile seyreltilmiştir, Seyreltilmiş dispersiyonun (sarı ok ile belirtilen) tortulaşan GVs (c) Damlacık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 3: GV Mikroskopi Görüntüler. Mikro-olmayan bir GV (a), farklılık belirleyici kontrast mikroskopi görüntüsü. GV çapı yaklaşık 10 um idi. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Mikroküreler olmadan GV (b) Floresan mikroskobu görüntüsü. kırmızı floresans Texas Red DHPE tarafından yayılan edildi. Mikro küreleri içeren bir GV (c), farklılık belirleyici kontrast mikroskopi görüntüsü. Bir GV içindeki 1.0 um mikro küreler (YG karboksilat mikrosferler) (d) floresan mikroskobu görüntüsü. Sayılır flüoresan mikroküreler (n) sayısı, bir Poisson dağılımına göre hataları (i = 2) yaklaşık 6 idi. Sonra ((n i ±) N = 20) iç mikro kürelerin toplam sayısını tahmin 120 ± 40 idi. O hesaplanmıştırGV h mikrosferler hacmidir ve V GVs hacmi yaklaşık 11 ± 3 hacim olarak%, bir hacim fraksiyonu (φ = Nv 100 / V) de 1.0 um mikro küreler ihtiva etmiştir. Bir GV membran (e) floresan mikroskobu görüntüsü. kırmızı floresans Texas Red DHPE tarafından yayılan edildi. (F) paneller d ve e görüntülerin görüntü Birleştirilmiş. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4: Farklı Encapsulated Malzemelerle GVs Diferansiyel Girişim Kontrast ve Floresan Mikroskopi Görüntüler. Farklılık belirleyici kontrast mikroskobu (üst) ve floresan mikroskobu (alt) görüntüleri(A) 0.1 um mikro küreler, (B) GFP ve (c) Uranine ihtiva GVs. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İç sulu bir dispersiyon ortamı ve dış sulu çözelti Özgül ağırlıklar dikkatle seçilmelidir. s / y emülsiyonu santrifüj sırasında dış sulu çözelti içine çökmesi için, bir iç sulu dispersiyon ortamının belirli özgül ağırlığı, dış sulu solüsyon daha büyük olması gerekir. Biz şeker olmadan iç ve dış çözümleri kullanılarak Gvs hazırlamak için çalıştı, ama iç sulu çözelti iki faz arasındaki paraziti geçmeye yeterli kütleye sahip değildi çünkü biz, bu koşullar altında hiçbir Gvs aldı. küçültmek veya yırtılması olabilir dış sulu çözelti içine çökelti iki çözümleri, GVs arasında büyük bir ozmotik basınç farkı varsa. Bu nedenle, iç ve GVs dışında ozmotik basıncı eşit olmalıdır. Bunu gerçekleştirmek için, dış sulu çözelti içinde çözünen olarak iç sulu dispersiyon ve glikoz bir çözünen olarak sukroz kullanılır; Her iki şekerler aynı konsantrasyonda edildi. Hem tuzP = "xref"> 22 ve şeker 23, 35, 38 bu amaçlar için kullanılmaktadır, ancak bu daha az toksik ve tuz daha çözünür olduğu için, şeker, genellikle kullanılır. Çok fazla şeker ilave edilir Ancak, GVs kapak cam ve çöküşün alt ile temas edebilir. Bu kaçınmak için çeşitli stratejiler vardır. Bir strateji, GV, ılımlı koşullar altında çökeltilmesi için, iç ve dış sulu çözeltiler arasındaki yoğunluk farkı azaltmak için; özel olarak ise, çökeltilmiş GV dispersiyon yüzer kaldırma kuvveti sonucu kapak camı yapışma yoluyla veziküler kopma ihtimalini azaltmak için, iç sulu çözeltiye aynı olan bir çözelti ile değiştirilebilir. Başka bir strateji ince lipid filmine 29 kapak gözlük hem ön kaplama etmektir.

emülsiyonun hazırlamayı ve kuluçka edilirönemli. Petrol çözeltisi hazırlamak için, sıvı parafin kullanılır. Madeni yağ 26, 31, 21 dodekan, 33 ve skualen 33, 39, genellikle bir çözücü yağ olarak kullanılır. Bu malzemeler, belirli yoğunluk, viskozite ve yüzey gerilimi değişiklik gösterdiğinden aynı santrifüj şartları 33 kullanıldığı zaman, veziküller farklı sayıda daha oluştururlar. Hedef özelliklere sahip veziküller elde etmek için, özgül ağırlığı ve iç ve dış sulu çözeltilerin viskozitesi ve yağ fazının santrifüj acceleration.For hazırlanmasını optimize esastır, inkübasyon yüksek sıcaklıkta ve kuru gerçekleşmelidir çevre bir kuluçka veya dehydrator gibi. Bu çalışmada, tamamen lipit molecules.In ilave çözmek için 80 ° C'ye kadar ısıtıldı sıvı parafin, emülsiyon olmalıdırgerekli ve o hazırlanan hemen sonra kararsız olduğu ve çünkü hemen santrifüj tabi olması gerektiği gibi sadece hazırlanacak damlacıkları kolayca birbirine kaynaştırmak w / o. Emülsiyon sonikasyon, vorteks veya dokunarak büyük miktarlarda elde edilebilir. Bununla birlikte, bir homojenleştirici kullanılarak yüksek viskozitede yağ içinde emülsiyon büyük miktarlarda hızlı hazırlanması ve daha kolay emülsiyon sağlar. Emülsiyon yumuşak ve hızlı bir şekilde ve 4 ° C'de, sonra soğutulmuş dış sulu çözeltisi üzerine yerleştirilmiş olması da önemlidir. emülsifikasyon ve santrifüj ile süresini kısaltmak için, yağ dış sulu çözelti sistemi emülsiyonu üzerinde katmanlı önce önceden soğutulmuş edilebilir beyaz türbidite hızlı veya daha yavaş normalden daha mekanik görünür immediately.If tüm sistemi daha sonra santrifüj edilebilir homojenleştirici iyice temizlik deterjanları kaldırmak için durulanması gerekir. Buna ek olarak, emülsiyon haline getirilmesinden önce, yağ çözeltisi, bir iç sulu bir çözeltisi ve emülsiyon yapıcı R olmalıdırOda sıcaklığına eturned.

Uygun merkezkaç ivme de önemlidir. 18,000 x g'da santrifüjleme ile, yüksek bir konsantrasyonda kapsüllenmiş tek bir iç malzeme ile GVs hazırlamak mümkün. birden fazla malzeme kapsülleme gerekli olduğunda, santrifüj ivme azaltmak için daha iyidir. Örneğin, yedi bileşikleri içine alan bir aktin montaj sistemi en az 350 x g 35 santrifüjleme ile elde edildi. Santrifüj arzu olduğu durumlarda, GVs şeker konsantrasyonu ayarlanarak ya da kendi kütlesinin 38, 40, 41 etkisi altında emülsiyonun çökeltilmesiyle elde edilebilir.

Burada bildirilen yöntem iki önemli sınırlamalar vardır. Weit tarafından işaret edildiği gibi bir GV zar içinde çözülmüş olabilir (bu durumda, parafin) petrol moleküllerz grubu 21. GV membran içine bir zar proteini yerleştirilmesi istendiğinde, protein üzerindeki eşlik eden yağ moleküllerinin dikkate alınmalıdır. diğer sınırlama hacim fraksiyonu çeşididir. Bu çalışmada, GVs mikrosfer hacmi fraksiyonları 4-30 Vol% arasında değişmektedir tahmin; birim fraksiyonlar GV hazırlanması için kullanılan iç sulu çözeltinin hacmi fraksiyonuna denk değildi. Bu mikroskop gözlem için yeterince yüksek bir hacim fraksiyonu en GVs içinde mikro-kapsüllenmesi için mümkün olmakla birlikte, bu yöntem, bir homojen hacim fraksiyonu dağılımı GVs hazırlanması için uygun değildir. Mikrosfer kesrinin dağılımı santrifüj 34 boyunca değişen bildirilmiştir.

s / y emülsiyonu santrifiij yöntemi yaygın olarak kapsüllenmiş malzemeler içeren GVs oluşumu için kullanılır. Ancak, az sayıda rapor p nitelendirdilermikro malzemeleri 34, 42 encapsulating GVs onarımı. Son zamanlarda, bir kapsüllenmiş DNA, aygıtı veya bir Moleküler Device içeren moleküler robotlar, 44 43 inşa edilmiştir. bölmeli GV uygulamalar bu tür için ilk seçenektir; Bu nedenle, çok çeşitli yüzey işlevsellik manyetik mikro-küreler ve mikro-kapsüllenmesi için kullanılabilir bizim gibi teknikler, 44 yararlı olması beklenebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Şekil 1'de şematik görüntüsünü çizim Tomoko Yamaguchi teşekkür ederiz. Bu çalışma Fen Bilimleri theNational Enstitüleri Bütünleştirici Bioscience için Okazaki Enstitüsü Okazaki ORION Projesi (NINS) tarafından desteklenmiştir; Astrobiyoloji Merkezi Projesi NINS ve (. No AB281010) tarafından; (. No 25102008) Yenilikçi Alanları Bilimsel Araştırma (entegre fonksiyonları oluşturulması için biyomoleküler sistemlerin dinamik sipariş) Bilim Teşvik Japonya Derneği için bir Grant-in-Aid (JSPS) tarafından; Genç Bilginler bir Grant-in-Aid (B) (KK, 15K17850 no.) JSP'lerden; andby bir Grant-in-Aid Araştırma Etkinlik Başlangıç ​​için (YN için, hayır. 15H06653) JSP'lerden. Ek destek Noguchi Enstitüsü, Fen Kao Vakfı tarafından sağlanan hibe ve Kurita Su ve Çevre Vakfı hibe hibe sağlanmıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > REAKTİFLER: < / güçlü >
1,2-Dioleoil- sn < / em >-glisero-3-fosfokolin (DOPC)Avanti Polar Lipidler850375CVeziküler membran molekülü
Texas Red 1,2-dihekzadekanoil-sn < / em>-glisero-3-fosfoetanolamin, trietilamonyum tuzu (Texas Red DHPE)Thermo Fisher ScientificT1395MP
1 M Tris-HCl (pH 7.5)Nippon Gene Co.318-90225Tampon çözelti
D (+) - GlikozWako Saf Kimya Endüstrileri049-31165Dış su çözeltisi için
SükrozWako Saf Kimya Endüstrileri196-00015İç su çözeltisi için
Poliboncuk karboksilat mikroküreler 1.0 ve mikro; mPolysciences08226-15Floresan olmayan, 2R = 1.0 &mikro; m
Floresbrit YG karboksilat mikroküreler 1.0 ve mikro; mPolysciences15702-10Floresan, 2R = 1.0 &mikro; m
Floresbrit YG karboksilat mikrokürecikleri 0.10 ve mikro; mPolysciences16662-10Floresan, 2R = 0.10 &mikro; m
Floresein sodyum tuzu (idrar)Sigma Aldrich JaponyaF6377-100G
GFP standardı (rekombinant)Vector LaboratoriesMB-0752
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar
EKİPMANLAR:
Santrifüj 5427REppendorf 5409000233Santrifüj rotoru: FA-45-48-11
PhyscotronMicrotec Co.NS-310EIIIKullanışlı mikrohomojenizatör
Jeneratör miliMicrotec Co.NS-4Homojenizatör ataşmanı
yerinde PCR ve hibridizasyon için Frame-Seal inkübasyon odalarıBio-Rad LaboratuvarlarıSLF0201Hibridizasyon odası hacmi: 25 & mikro; L
Oda boyutu: 9 ve kez; 9 & kez;
in situ PCR ve hibridizasyon için 0,3 mm Frame-Seal inkübasyon odalarıBio-Rad LaboratuvarlarıSLF0601Hibridizasyon odası hacmi: 65 & mikro; L                   
Oda boyutu: 15 ve kez; 15 & kez; Viskoz sıvı için 0,3 mm
Microman EGilsonFD10006Pipeti. Bunu kullanarak sıvı parafin ölçtük.
Ters mikroskopOlympus Co.IX73
Ayna ünitesiOlympus Co.U-FBNAUyarma filtresi: 470 - 495 nm
Emisyon filtresi: 510 - 550 nm
Ayna ünitesiOlympus Co.U-FMCHEUyarma filtresi: 565 - 585 nm
Emisyon filtresi: 600 - 690 nm

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
  2. Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
  3. Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
  4. Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
  5. Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
  6. Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
  7. Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L. Polymerase chain reaction in liposome. Chem Biol. 2 (10), 677-682 (1995).
  8. Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
  9. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
  10. Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352(2015).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  13. Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  14. Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
  17. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  18. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  19. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  20. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  21. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  22. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  23. Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
  24. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
  25. Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
  26. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  27. Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
  28. Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
  29. Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683(2016).
  30. Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
  31. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  32. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
  33. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  34. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  35. Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
  36. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  37. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  38. Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  39. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  40. Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
  41. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  42. Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853(2014).
  43. Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
  44. Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Santrif j Y ntemiMikrok re Kaps llemeDOPC Lipid FilmiTris Tamponlu zeltiFloresan MikroskopiDiferansiyel Giri im MikroskopiAk SitometrisiSentetik Biyoloji

İlgili makaleler