Yöntem makalesi

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

6.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55297

⸱

26 Haziran 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Özet

Burada açıklanan protokoller, araştırmacıların, hücrelerin bulunduğu ortamın bütünlüğünü değiştirmeden hücre iletişimini incelemelerine izin vermek için tasarlanmıştır. Spesifik olarak, omurilik nöronları gibi uyarılabilir hücrelerin elektriksel aktivitesini analiz etmek için geliştirilmiştir. Böyle bir senaryoda, omurga hücresinin bütünlüğünü korumak çok önemlidir, ancak ilgili sistemlerin anatomisini ve fizyolojik şeklini korumak da önemlidir. Gerçekten de, sinir sisteminin ve diğer karmaşık sistemlerin nasıl çalıştığının anlaşılması, sistemik bir yaklaşıma dayanmalıdır. Bu nedenle canlı zebra balığı embriyosu model sistem olarak seçilmiş ve embriyoların fizyolojik durumlarına müdahale edilmeden spinal nöron zarı voltaj değişiklikleri değerlendirilmiştir.

Burada, zebra balığı embriyolarının kullanımını FRET tabanlı bir biyosensörle birleştiren bir yaklaşım açıklanmaktadır. Zebra balığı embriyoları, çok basitleştirilmiş bir sinir sistemi ile karakterize edilir ve şeffaflıkları sayesinde görüntüleme uygulamaları için özellikle uygundur, bu da zebra balığı gelişimi sırasında plazma zarında floresan bazlı voltaj göstergelerinin kullanılmasına izin verir. Bu iki bileşen arasındaki sinerji, fizyolojik durumu bozmadan, bozulmamış canlı organizmalardaki hücrelerin elektriksel aktivitesini analiz etmeyi mümkün kılar. Son olarak, bu non-invaziv yaklaşım, diğer analizlerle (örneğin, burada gösterildiği gibi spontan hareket kayıtları) birlikte var olabilir.

Giriş

İn vivo sistemik bileşen analizi, bilim insanlarının hücresel davranışlarını en güvenilir biçimde araştırmalarını sağlar. İncelenen aktivite, membran voltajı değişikliklerinin uyarılabilir hücreler arasındaki iletişimi yönlendirdiği sinir sisteminde olduğu gibi, hücre-hücre etkileşimlerinden (temaslı ve temassız olmak üzere) büyük ölçüde etkilendiğinde, bu durum özellikle geçerlidir. Bu elektrik sinyalleri tarafından kodlanan bilginin anlaşılması, sinir sisteminin hem fizyolojik hem de hastalık hallerinde nasıl çalıştığı anlamanın anahtarıdır.

En invaziv olmayan fizyolojik koşullarda hücre elektriksel özelliklerini incelemek için yakın zamanda birkaç genetik olarak kodlanmış gerilim göstergesi geliştirilmiştir 1 . Önceki nesiller optik voltaj sensörlerinin (özellikle voltaja duyarlı boyalar) 2 aksine, GEVI'ler bozulmamış sinir sisteminin in vivo analizlerine izin verir veIfadeleri, spesifik hücre tipleri veya popülasyonları ile sınırlanabilir.

Zebra balığı embriyo, GEVI'ye atfedilen büyük potansiyelin avantajlarından yararlanmak için seçilen in vivo "substrat" ​​tır. Aslında, optik netliği ve basitleştirilmiş ve evrimsel olarak korunmuş sinir sistemi sayesinde zebra balığı modeli, bir ağdaki her hücresel bileşenin anlaşılır bir şekilde tanımlanmasına ve manipüle edilmesine olanak tanır. Aslında, FRET tabanlı GEVI Mermaid 3'ün istihdamı, amyotrofik lateral skleroz (ALS) 4'ün zebrafish modelinde spinal motor nöron davranışındaki semptomatik önlemlerin tanımlanmasına yol açtı.

Aşağıdaki canlı organizma protokolü, Mermaid'i nörona spesifik bir şekilde ifade eden bozulmamış zebra balığı embriyolarındaki omurilik motor nöronlarının elektriksel özelliklerini nasıl izleyeceğini açıklamaktadır. Dahası, farmakolojik olarak indüklenen chan'ınBu tür elektriksel özelliklerdeki ges, gelişimin çok erken evrelerinde zebra balığı hareket davranışını karakterize eden stereotipik motor aktivite olan embriyonik spontan sargıların frekansındaki değişikliklerle ilişkilendirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. pHuC_Mermaid Plasmid Üretimi

NOT: Denizkızı, Ciona intestinalis'in voltaj algılama alanını (VSD) eşleştirerek geliştirilen bir biyosensördür (şimdi FRET partneri fluorophores Umi-Kinoko Green (mUKG: verici) ve turuncu-yayan floresan protein Kusabira Orange (mKOk: acceptor) monomerik versiyonu ile fosfataz (Ci-VSP) içeren 5 voltaj sensörü. Bu biyolojik sensör için, membranın depolarizasyonu ile uyarılan VSD alanının konformasyonel değişimleri, verici ve alıcı floresan proteinlerin yakınlığını arttırır, böylece aralarındaki enerji transferini arttırır (FRET Oranının arttırılması) 3 . VSD, plazma membranında biyo-sensörün etkin lokalizasyonunu sağlar. Biyosensörün nöronal ifadesi (omurilikte, sinyal hem internöronlarda hem de motor nöronlarda saptanabilir), Deniz Kızı opsiyonunun klonlanmasıyla elde edilirZebra balığı pan-sinir promotörü HuC 6'nın altında bir çerçeve (ORF) okuma.

  1. T3 Universal primerini ve Deniz Kızı Sma I primerini (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile pCS4 + Mermaid plasmid 3'ten Mermaid ORF'yi Pfu (prova okuma) DNA polimeraz ile yükseltin ve böylece yukarıya bir Sma I sınırlama bölgesi yerleştirilir Denizkızı ORF.
    1. Aşağıdaki PCR karışımını kullanın: 0.5 uL Pfu DNA polimeraz, 7.5 uL özgül 10x tampon, 1 uL 10 mM dNTP, 2.5 uL dimetil sülfoksit (DMSO), 0.5 uL (50 ng) plazmid preparatı ve 1 Toplam 50 μL hacimdeki her bir primerin 20 μM stok solüsyonlarının μL'si.
    2. PCR karışımını 95 ° C'de 15 saniye boyunca ısıtın, 50 ° C'de 15 saniye boyunca başlatın ve toplam 35 devir boyunca 72 ° C'de 4 dakika boyunca uzatın.
  2. Belirli küntleri jel-arındırmakPCR ürünü, ticari bir jel arıtma kiti kullanılarak imalatçının protokolünü izleyerek.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek DNA parçasını pCMV-SC künt vektör içine klonlayın.
  4. HuC promoterinin aşağıdaki eklenmesi için Mermaid pozitif plasmidini (pCMV-SC_Mermaid olarak adlandırılır) Sma I restriksiyon enzimi ile lineerize edin.
    1. Restriksiyon reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: Sma I sınır enziminin 0.5 uL'si (10 U), kit 10x tampon maddenin 2 uL'si ve toplam 20 μL hacimdeki plasmid DNA'sının 5 μg'si. Reaksiyonu 25 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  5. Üreticinin protokolünü izleyen ticari bir jel arıtma kiti kullanılarak sindirilmiş plazmiti jel-arındırın.
  6. Bir çift HuC-spesifik primer (HuCprom-forwl_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA ve HuCpro kullanılarak, şablon olarak Pfu DNA polimeraz ve zebrafish genomik DNA'sı ile HuC yükselticisini (pHuC) PCR ile çoğaltınM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) ve ATG'nin akış yukarı akışında 3.150 bp'lik bir bölgeye yayılmıştır.
    1. Aşağıdaki şemayı kullanarak PCR karışımını ayarlayın: Pfu DNA polimerazın 0.5 uL'si, spesifik 10x tamponun 7.5 uL'si, 10 mM dNTP'lerin 1 uL'si, DMSO'nun 2.5 uL'si, genomik DNA'nın 200 ng'si ve 20-μM'lik 1 uL'lik Her primerin stok solüsyonları toplam 50 μL hacimdedir.
    2. 95 ° C'de 2 dakikalık bir başlangıç ​​basamağından sonra, PCR karışımını 95 ° C'de 15 saniye ısıtın, 50 ° C'de 15 saniye süreyle asın ve toplam 35 döngü için 72 ° C'de 4 dakika uzatın .
  7. Üreticinin protokolünü izleyerek ticari bir jel arıtma kiti kullanarak spesifik künt PCR ürününü jel-arındırın.
  8. 1 mcL T4 DNA ligaz ve 10 uL'lik bir toplam hacimde spesifik 10X tamponun 1 uL'si kullanılarak saflaştırılmış pCMV-SC_Mermaid'in (basamak 1.5) ve pHuC DNA'sının (basamak 1.7) eş molar bir miktarı ligatlandırın. Reaksiyonu 16 saat boyunca enkübe edin4 ° C.
  9. Üreticinin talimatlarını izleyen 5 μL ligasyon reaksiyonu ile (adım 1.8) yetkili hücrelerin bir bölümünü dönüştürün.
  10. Bir Sal I- Eco RV çift sindirimiyle (SalI kısıtlama bölgesi adım 1.6'da promoter fragmanının akış aşağısına sokuldu ise Eco RV kısıtlama bölgesi PCMV-SC plazmidinin poliadenilasyon bölgesi olan PolyA'nın akış aşağısında yer alır).
    1. Restriksiyon reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: hem Sal I hem de Eco RV kısıtlama enzimlerinin 0.5 uL'si (10 U), kit10X tamponunun 2 uL'si ve 1 μg pHuC_Mermaid DNA'nın toplam hacmi 20 uL olmalıdır. Reaksiyonu 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Tepkimeleri bir agaroz jel üzerine uygulayın.

2. Embriyo Mikroenjeksiyonu

  1. Döllenen örneği transfer edin(AB türü) ya da Sod1-G93R yetişkin zebra balığı 4'ten plastik bir pipet kullanılarak 10 mm'lik bir Petri kabuğundan elde edilen gs'dir.
  2. Embriyoları soğuk (4 ° C) balık suda durulayın ve bir microinjector kullanarak 200 μg pHuC_Mermaid plazmid ile hemen sarılı içine mikroenjekte edin (mikroenjeksiyon prosedürünün genel ve detaylı bir tarifi için bkz. Referanslar 7 ve 8).
  3. Plastik bir pipet kullanarak embriyoları bir Petri kabına aktarın ve aşağıdaki analizler için istenen gelişim evresine (20-24 saat sonrası dölleme, hpf) ulaşana kadar 28 ° C'de balık suyunda inkübe edin.

3. Spontan Kuyruk Sargısı Analizi

NOT: 20-24 hpf embriyolarında spontan kuyruk sarmalama davranışını riluzole ilaç ilacı olsun veya olmasın değerlendirin.

  1. % 0.2 DMSO (riluzole araç) içeren balık suyuyla doldurulmuş 90 mm'lik yuvarlak bir Petri kabına bir embriyo aktarın ve elle de tw kullanarak kapatıp çıkarınO Kuyumcunun forsepsleri keskin uçlarla. Embriyo 5 dakika inkübe edin.
  2. Bir stereomikroskopta monte edilmiş dijital bir kamera kullanarak 1 dakika video kaydı sırasında kuyruk sargısını RT'de algılayın. 30 karelik / s'lik bir zaman çözünürlüğünde zaman serileri elde edin.
  3. Zaman birimi başına viraj sayısını (hem kontralateral hem de ipsilateral) sayarak spontan kuyruk sargılar sıklığını hesaplayın.
  4. İlaç riluzolunun etkisini değerlendirmek için, 5 μM riluzol içeren balık suyu ile dolu yeni bir 90 mm Petri kabına embriyo aktarmak için hafifçe bir plastik Pasteur pipeti kullanın.
    1. 1 dk. Video kaydetmeden önce davranış analizi uygulayarak embriyo 5 dakika inkübe edin.

4. Yaşayan Embriyolarda Denizkızı Biyosensör Görselleştirme Görüntüleme Kurulumu: Verici ve Alıcı Sinyallerinin Eşzamanlı Tespiti

  1. 20-24 hpf embriyolarını% 1 düşük erime noktalı agarozda balık suyuna37 ° C'de 35 mm'lik cam tabanlı bir görüntüleme çanağının içinde. Embriyoların yanlarını yönlendirin. Agaroz oda sıcaklığında katılaşıncaya kadar bekleyin.
  2. Ters çevrilmiş mikroskopta monte edilmiş ters çevrilmiş bir konfokalın sahnesine görüntüleme çanağını aktarın. 488 nm argon lazer hattı ile mUKG'yi heyecanlandırarak ve 495 ila 525 nm arasındaki emisyonunu kaydeden biyolojik sensörü ifade eden motor nöronları 20X'lik bir objektifle (0,7 sayısal diyafram açıklığı, NA) tanımlayın.
  3. FRET ölçümü için, FRET çifti vericisi olan mUKG'yi 488 nm lazer hattı ile tahrik edin. Çift yönlü modda 8.000 Hz'de çalışan bir rezonant tarayıcı ile donör tarafından yayılan flüoresan (495 ila 525 nm arasında) ve mKOk alıcı tarafından yayılan flüoresan (550 ve 650 nm arasında FRET kanalı) eşzamanlı olarak algılayın. Varsa, 473 nm lazeri kullanın.
    NOT: Donörün uyarılma verimi hafifçe azalacaktır (488 nm'de% 93 yerine% 85), fakat alıcıın çapraz uyarımının(488 nm'de% 17'den 473 nm lazer hattıyla% 9'a) azaltılmalıdır.
  4. Fototoksisite ve florofor ağartmayı azaltmak için lazer hattının gücünü azaltarak (satın alma yazılımının kiriş yol penceresinde ) numunenin aydınlatmasını en aza indirin.
  5. Uyarıyı, denemenin başında belirlenen ve oturum boyunca sabit tutulan kazanç ve ofset parametreleriyle eşleşecek şekilde optimize edin. Ofseti ayarlamak için, görüntünün rengini yoğunluk değerlerine değiştirin (Q arama tablosunu kullanarak) ve lazer kapalıyken tarama yaparken ofset düğmesini çevirin (akıllı ofset), böylece arka plandaki piksellerin hafif yoğunluğa sahip olması gerekir Sıfırdan yüksek. Aynı tarama tablosunda, tarama sırasında lazeri açarak, doymuş pikselleri önlemeye dikkat ederek sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için kazanç düğmesini çevirin (akıllı kazanç).
  6. Açık bir iğne deliği (2 havadar birimi) kullanarak nicel için yeterli dinamik aralık sağlamak için 16 bit görüntüler elde edinE analizleri. Edinme hızını artırmak ve photobleaching'i en aza indirgemek için ortalamalardan kaçının.
  7. Yazılım edinme penceresinde, açılır menüden 512 x 64 piksel (piksel boyutu: 605 nm) boyutundaki bir resim alanını seçin.
  8. Edinme modu penceresinden açılır menüden xyt (tek bir xy düzleminde zaman aşımı) seçin ve tek bir xy düzlemi edinerek embriyo spinal nöron voltajındaki değişiklikleri kaydedin , her bir görüntüyü 30 dakikada bir kaydetmek için edinme parametrelerini ayarlayın Ms 1 dakika boyunca.
  9. Aynı nöronda membran depolarizasyonu üzerine riluzole uygulanmasının etkisini değerlendirmek için, 5 μM riluzol içeren balık suyunun eklenmesinden 5 dakika sonra yeni bir veri kümesi edinin.
  10. FRET analizi için ImageJ makrosu Biosensor_FRET'i kullanın (tek zincirli FRET biyosensörlerini ifade eder.
  11. T1'deki her nöronun bazal membran FRET oranını ((FRET ortalama - FRET arka planı) / (Donör ortalama - Donör arka plan) gibi değerlendirin; burada FRET ve DonVeya ortalama yoğunluk, elde edilen her kanal için hücrenin etrafında çizilmiş olan aynı ilgi alanında (ROI) hesaplanan ortalama floresan yoğunluğudur ve FRET ve Donör arka plan, floresan numunesi olmadan görüş alanının bir ROI'sinde hesaplanan ortalama floresan yoğunluğudur.
    NOT: Eklentinin kullanımıyla ilgili ayrıntılı bir adım adım açıklama www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret web sitesinde bulunabilir.
  12. Farklı deneysel paradigmalar arasındaki depolarizasyon frekansını, amplitüdünü ve süresini karşılaştırmak için bir grafik yazılımı kullanın. Eşlenmemiş bir Öğrencinin t- testi kullanarak iki grubu karşılaştırın ve P <0.05 olduğunda istatistiksel olarak farklı ortalama değerler düşünün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protein sentezini sadece sinir sisteminde yönlendiren pHuC pan-nöronal promotörün kontrolü altında FRET-esaslı Denizkızı biyosensör kodlama sekansını taşıyan bir ifade vektörü, tek hücreli döllenmiş yumurtalara bir mikroenjeksiyon vasıtasıyla Geçici transgenik embriyoların elde edilmesi için sipariş verme ( Şekil 1 , Sol panel). Mikroenjeksiyon tekniğini uyguladıktan sonra, Denizkızı pozitif embriyoların yüzdesi% 100'e yakıntı. Bunlardan FRET anali...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan protokol, zebrafish embriyo omurga motor nöronlarının elektriksel özellikleri ile embriyonik gelişimin yaklaşık 17 hpf'sinde görülen ve 24 hpf 10'a kadar uzanan ilk stereotipik motor aktivite olan spontan sarmal davranış arasındaki ilişkiyi keşfetmemizi sağladı.

Yaklaşımımız araştırmacılara, bozulmamış embriyoların sinir sistemini incelemek için geliştirilmiş bir işlevsel ağdaki hücreler arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını tamamen koruyan b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, FRET görüntüleme analizine paha biçilmez desteği için Simona Rodighiero'ya teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Düşük Erime Noktalı Agaroz Sigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNA polimeraz Agilent Technologies - Stratagene Ürünleri Bölümü600389
T3 Üniversal astar Sigma-Aldrich
Wizard SV Jel ve PCR Temizleme sistemiPromegaA9280
Universal SmaI astarı Eurofins
StrataClone Memeli İfade Vektör Sistemi / pCMV-SC künt vektör Agilent Technologies - Stratagene Ürünleri Bölümü 
SmaI New England BiolabsR0141S
T4 DNA ligazPromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, cam tabanlı görüntüleme kabı ve nbsp;Ibidi81151
forsepsSigma-AldrichF6521
StereomikroskopLeica MicrosystemsM10 F
Dijital kameraLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 yazılımı Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Apple
Konfokal mikroskop (ters)Leica MicrosystemsTCS SP5
Microinjector Eppendorf Femtojet
ImageJ makro Biosensor_FRET 
GraphPad Prizma 6.0c GraphPad Yazılım, Inc
240228

Kaynaklar

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FRET Biyosens rSpinal N ronlarKonfokal MikroskopiFloresan G r nt lemeGenetik KodlamaVoltaj ndikat rleriRiluzol TedavisiKuyruk K vr lma Analizi

İlgili makaleler