Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Makrofajlar bağışıklık sisteminin doğuştan gelen kolundan profesyonel fagositlerdir. Kararlı durumda, sabit makrofajlar erişkin dokularda bulunurlar ve burada enfeksiyon ve doku hasarının ön hatları olarak görev yaparlar. Diğer bağışıklık hücreleri, kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) sürekli olarak yenilenirken, ikamet makrofajları olarak bilinen bir makrofaj serisinin, kemik iliği HSPC'leri girilmeden dokularda kendini idame ettirdiği gösterilmiştir. Bu soydan beyinde mikroglia, karaciğerde Kupffer hücreleri ve epidermide Langerhans hücreleri örneklenmektedir. Bağırsak ve kolon lamina propriası, HSPC'den bağımsız ikamet makrofajlarından yoksun olan tek erişkin dokudur. Yakın tarihli araştırmalar, yerleşik makrofajların, fetal hematopoietik kök hücrelerden (HSC) farklı progenitör (ler) den kaynaklanan ekstra embriyonik yolk kesesi hematopoezlerinden kaynaklandığını tespit etmiştir. Yolk kesesi kesin hematopoezisi arasındaRythromyeloid progenitörler (EMP) hem eritroid hem de myeloid hücrelere, özellikle ikamet makrofajlarına neden olur. ÇYP gelişme E8.5 ve E10.5 günleri arasında yolk kesesi içinde üretilir ve sirkülasyon bağlı olduğu yerde fetal karaciğere göç ederler; burada en azından E16.5'e kadar genişler ve ayırt edilirler. Onların soyları eritrositler, makrofajlar, nötrofiller ve mast hücreleri içerir, ancak sadece EMP'den türeyen makrofajlar dokularda yetişkinliğe kadar ısrarcı kalırlar. ÇÇ gelişinin geçici doğası ve HSC üretimi ile zamansal örtüşme, bu öncüllerin analizini zorlaştırır. Akış sitometrisi vasıtasıyla in vivo olarak EMP ve EMP türevi hücreleri karakterize etmek için makrofaj sitokin reseptörü Csf1r promotörünün ekspresyonuna dayanan bir tamoksifen-uyarılabilir kader eşleme protokolü kurduk.
Giriş
Gelişmekte olan birkaç ardışık ama örtüşen hematopoietik progenitör dalgaları vardır, bunların miyeloid nesli yetişkinliğe kalmaktadır. İlk olarak, tek başlı "ilkel" öncüller , E7.5-E8.25 arasındaki fare yumurta sarısı 1 , 2'de ortaya çıkar ve herhangi bir monositik ara madde olmadan embriyonik makrofajlara yol açar. İlkel progenitörlerden türetilen makrofajların yetişkin beyinde devam edip etmediği, yoksa mikroglia aktif bir sorunun konusudur. İkincisi, Eritrom-Myeloid Öncüleri (EMPs) E8.5'teki yolk kesesinde ortaya çıkarlar, kan dolaşımına girerler ve embriyonu kolonize ederler. EMP'ler, Runx1'e bağımlı endotel-to-hematopoietik geçiş 3 , 4'te yumurta sarısı hemogenik endotelden ortaya çıkar. EMP yolk kesesi içinde makrofajlar ayırt mümkün olmakla birlikte, aynı zamanda, embriyonik gün (E) 9 5 ve ayırıcı fetal karaciğer kolonizeEritrositler, megakaryositler, makrofajlar, monositler granülositleri ve mast hücreleri haline gelin 6 . ÇYP'lerden kaynaklanan makrofajlar gelişimsel ve erişkin dokularda proliferatif kapasite gösterir. EMP'den türeyen makrofajların, farklılaşmanın monosit safhasını bypass edip etmediği, farklılaşma yolları hakkında çok az bilginin olduğu için hala tartışmalıdır. 7 , 8 . Son olarak, Hematopoietik Kök Hücreler (HSC), E10.5'te aorta-gonad-mesonefroz bölgesinden uygun embriyo içerisinde ortaya çıkar ve fetal karaciğere göç eder. Uzun vadeli repopülasyon kapasitesine sahip HSC'ler yalnızca E11'den sonra (42 somite çift aşamasında) algılanır 9 . Orada, genişletmek ve kesin hematopoez doğum sonrası yaşamın 10 süresince kan hücresi üretiminin baskın siteyi olur kemik iliği geçiş başlayana kadar E12.5 ayrılırlar.
SpAtıonal ve temporal örtüşmenin yanı sıra paylaşılan immüno-fenotipik belirteçler, embriyonik hematopoietik progenitörlerin bu dalgalarının spesifik katkılarını ayırt etme kabiliyetimizi engellemiştir. Hem EMP hem de HSC Runx1'e bağımlı bir şekilde üretilirken ve diğerleri arasında Myb ve büyüme faktörü reseptörü Csf1r (Koloni Uyarıcı Faktör 1 Alıcı, ayrıca Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Alıcı olarak da bilinir) ifade ederken, EMP'ler Hem in vitro hem de in vivo olarak lenfoid potansiyellerinin bulunmaması, uzun dönem repopulasyon potansiyelinin olmaması ve soyu markörü Sca- 11'in yüzey ekspresyonunun eksikliği nedeniyle. Genetik kader haritalama modelleri, embriyonik öncüleri bir hücreye spesifik ve zamana özgü biçimde hedeflemeye izin verdiklerinden, makrofaj ontogenezini karakterize etmek için gereklidir. Burada, iki soy arasındaki ayrım yapmak için laboratuvarımızda kullanılan kaderi haritalama protokolünü sunuyoruzYetişkin dokuların çoğunda bulunan makrofajların: HSC kaynaklı sızıntı makrofajları ve HSC'den bağımsız ikamet makrofajları.
Doku ikamet makrofajları, sitokin reseptörü Csf1r 12'yi eksprese eden Myb'den bağımsız öncü hücrelere geri izlenir ve üç tamamlayıcı kader-haritalama stratejisi 6 kullanarak E8.5-E10.5'deki embriyo içerisinde bulunur. Fetal HSC'leri etiketlemeden yolk sac hematopoez araştırmak için, 'geliştirilmiş' Cre rekombinazın tamoksifenle uyarılabilir bir füzyon proteini ve iki fare östrojen reseptörü (Mer-iCre-Mer) kontrolünün altında olan bir transgenik suş Csf1r MeriCreMer kullanıyoruz . Csf1r destekçisi. Dolayısıyla, Cre rekombinaz, sınırlı bir zaman aralığı boyunca CSF1R eksprese eden hücrelerde aktif olacaktır. Bir lox-STOP-lox kasetinin (Rosa26 LSL-eYFP ) aşağı akışta bir flüoresan proteini içeren bir muhabir suşuyla kullanıldığında, kalıcılığa yol açacaktırIndüksiyon zamanında mevcut olan hücrelerin genetik etiketlenmesi ve aynı zamanda soylarının genetik etiketlenmesi. E8.5 aktif formda tamoksifen, 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM) uygulaması, yumurta sarısı unipotent "ilkel" öncüleri veya fetüs HSC'leri etiketlemeden, EMP'leri ve makrofajları etiketlemektedir. Böylece, embriyonik gelişim sırasında EMP'lerin ve bunların yavrularının immünofenotiplerini karakterize ettik ve aynı zamanda sarı kese kaynaklı makrofajların yetişkin makrofaj havuzlarına katkısını de değerlendirdik. İlkel atadan türetilen makrofajların bu yaklaşımı kullanarak da etiketlendiğini ve yetişkin makrofaj havuzlarına katkıda bulunup katkı sağlayamayacaklarını karakterize etmek için daha fazla çalışma gerekmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan prosedürleri Institut Pasteur (CETEA) onaylı kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesine uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embriyolarında Utero Pulse Etiketleme
- Stok solüsyonu 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM, 50 mg / mL) hazırlayın.
- Fümhür altında, 25 mg OH-TAM şişesini açın ve 250 μL etanol (% 100) ekleyin.
- OH-TAM solüsyonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne, kesilmiş uç ve 10 dakika boyunca maksimum hızda girdapla aktarın.
- Sonikatör banyosunda 30 dakika sonikletin.
- 50 mg / mL stok solüsyonu elde etmek için fümhid altında 250 μL PEG-35 hint yağı ekleyin.
NOT: PEG-35 hint yağı, hidrofobik molekülleri bağlayan ve bunları sulu çözücüler içerisinde çözündüren amfifilik özelliklere sahip bir solventtir. - Yaklaşık 5 dakika boyunca girdapBir sonikatör banyosunda 30 dakika sonikasyon yapın.
- Mikro santrifüj tüpü başına 90 μL (4.5 mg) (enjeksiyon başına 1 alikot).
- Daha önce tarif edildiği gibi 1 hafta boyunca 4 ° C'de veya uzun süre -20 ° C'de saklayın 13 .
- Progesteron stok solüsyonu hazırlayın (10 mg / mL)
- Fumefood altında 10 mg / 100 μL süspansiyon hazırlamak için 25 mg progesterona 250 μL% 100 etanol ilave edin. Hafifçe girdap.
- Kaputun altında 10 mg / ml progesteron solüsyonu yapmak için 2250 μL otoklavlanmış ayçiçeği yağı ekleyin.
- Maksimum hızda yaklaşık 5 dakika boyunca girdap, alikot ve 4 ° C'de saklayın. Saklandığında çözümün net olduğunu unutmayın.
- Tamoksifen uygulaması
NOT: Embriyonik gelişim, embriyonik gün (E) 0.5 olarak vajinal fiş oluşum gününü dikkate alarak tahmin edilmiştir. Rekombinasyon, E8.5'deki tek enjeksiyon ile indüklenirGebe Csf1r MeriCreMer dişilere 12 . Tamoksifen uygulamasından sonra kürtaj oranlarını düşürmek için OH-TAM'ı 37.5 μg g Progesteron ile tamamlayın. Saat 13'te enjekte edin (sabah gözlemlenen vajinal tıkaç için).- Enjeksiyon sabahı, OH-TAM solüsyonunun bir alikotunu 10 dakika boyunca sonike (veya tamamen yeniden süspansiyona alınana kadar) sonike hale getirin.
- 10 mg / mL OH-TAM solüsyonu elde etmek için fümehood altında 360 uL NaCl% 0.9 oranında ilave edin ve iyice girdaplayın. Solüsyon berraklaşıncaya ve tamamen yeniden süspansiyona alıncaya kadar sonikasyon yapın (en az 30 dakika).
- Progesteronu oda sıcaklığına ısıtın.
- Bir mikrosantrifüj tüpünde 450 μL OH-TAM ve 225 μL progesteron karıştırın. Girdap.
- En az 10 dakika Sonike edin ve 25G'lik bir iğne ile 1 mL şırıngaya yükleyin.
- Hayvan tesislerinde, hamile kadın ağırlığındadır ( Csf1r MeriCreMer dişiler, yakın bir FVB genetik altyapısına sahiptir ve tipik ağırlığıEn 25 ve 33 g).
- Hesaplanan hacmi fare içine yavaş yavaş enjekte ederek bir intra-peritoneal enjeksiyon uygulayın. İğneyi çektikten sonra, delici yarayı hafifçe bastırın ve karın bölgesine OH-TAM'ı dağıtmak için masaj yaptırın.
NOT: OH-TAM enjeksiyon dozu 75 mg / kg'dır ve Progesteron dozu 37.5 mg / kg'dır. Tablo 1 , hamile dişilere enjekte edilecek hacmi göstermektedir.
| Fare ağırlığı (g) | Karışımdan enjekte edilecek toplam hacim (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 |
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tablo 1: 4-OH-tamoksifenin (OH-TAM) enjeksiyon hacmi. E8.5'de tek bir enjeksiyon için hacim başına 75 μg (vücut ağırlığı) OH-TAM'ın, g progesteron başına 37.5 μg takviye edilmesi için gereken hacim.
2. Yolk Sac (YS) ve Fetal Karaciğerin (FL) Diseksiyonu
NOT: Embriyoları manipüle ederken, uzun vadeli kültür için kullanılacaksa, sert steril teknikler gerekli değildir. Yine de, çalışma alanı temiz ve emici kağıtların altında folyo ile kaplanmalıdır.
- Buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ve sindirim karışımı (1 mg / mL kollajenaz D, 100 U / mL Deoksiribonükleaz I (DNase I) ve% 3 fetal sığır serumu içeren PBS) hazırlayın.
- Hamile dişileri kurbanla öldürmekGerekli gebelik haftasında vikal çıkık ( örn. Embriyonik evre E10.5).
- Cildi sadece cinsel organların üzerine sıkıştırın ve orta hattında makasla küçük bir kesi yapın. Kürk olmaksızın vücut duvarını tamamen ortaya çıkarmak için deriyi başa doğru çekin. İç organları ortaya çıkarmak için karın kaslarını kesin ve iki uterus boynuzunu ortaya çıkarmak için bağırsağa basın.
- Orta büyüklükte künt forseps ile, yumurtalıktaki yağ bandını tutun ve hafifçe uterusu çekin. Uterus boynuzlarının servikal seviyesinden kesin ve boynuzları periton boşluğundan kaldırın. Uterus boynuzlarını tamamen boşaltmak için yağ yastığını çıkarın ve boynuzları her iki yanındaki yumurtalıktan kesin.
- Boynuzları 10 mm'lik bir Petri kabında buz gibi soğuk PBS'ye koyun. Bir ucunda (rahim ağzı) uterus kas katmanlarını hızlı bir şekilde tutun ve embriyoları çevreleyen desidual dokuyla serbest bırakmak için kas tabakası ile desidual doku arasında ince makasları kaydırın.
NOT: Kas hızla daralma eğilimi gösterirR ekstraksiyon, bu nedenle bu adım mümkün olduğunca çabuk olmalı. - Reichert zarı ve plasentayı kesmek için bir çift ince forseps kullanın.
- Yumruk yumurta sarısını çıkarın ve 0.5 mL sindirim karışımı ile 24-iyi bir doku kültürü plakasına yerleştirin.
NOT: Bu aşamada, embriyonik kan toplanabilir.- Göbek ve vitellin damarlarını kestikten hemen sonra embriyo, 10 mM buz soğukluğunda etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 12 yuvalı bir doku kültürü plakasına aktarın. Embriyo keskin ince makas kullanarak dekapitasyon, mümkün olduğunca çok sayıda doku dilatasyonu sınırlamaya çalışıyorum. Buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin ve kan içeren EDTA toplamak.
- Embriyo çevreleyen amniyon kaldırın.
- Aşamalar
- Embriyonun başını kesin.Forseps veya ince makas. Başlığı, 0.5 mL'lik sindirim karışımı ile 24 gözlü bir plakaya aktarın.
NOT: Daha sonraki evrelerde nöroektoderm ve beyin, akış sitometrisi analizi için ayrılmıştır; Çevresindeki vasküler pleksus dikkatle çıkarın. - Embriyonu arka bacağın üstünden kesin ve forelimbleri çıkarın.
- Karaciğerin izolasyonu için ince bir forseps kullanarak toraks açın. Anterior kalbe tutturun ve organları vücuttan kurtarmak için ikinci forsepsi kullanırken nazikçe çekin.
- Fetal karaciğeri kalpten ve bağırsaklardan dikkatlice ayırın. Fetal karaciğeri, 0.5 mL'lik sindirim karışımı ile 24 gözlü bir plakaya aktarın. Diseksiyon mikroskopu altında transferi dikkatle izleyin.
- Polimeraz zincir reaksiyonu tahlili (PCR) ile genotiplendirme için kuyruk bölgesini (veya herhangi bir başka embriyo parçasını) toplayın.
NOT: Diğer doku ve organlar akış sitometrisi kullanılarak benzer bir analiz için E10.5 embriyolarından hasat edilebilir. Kan, kafa kayağıN, aorta-gonad-mesonefros bölgesi (AGM), kalp ve nöroektoderm, E10.5'te toplanabilir. Daha sonraki aşamalarda, akciğer, böbrek, dalak ve pankreas da toplanabilir. AGM'nin farklı gelişim aşamalardaki diseksiyonunun ayrıntılı bir tarifi daha önce 14 açıklanmıştır.
3. Akış Sitometrisi için Embriyonik Dokuların İşlenmesi
- Organları (sindirim karışımına yerleştirilir) 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 6 ml FACS tamponu (1x PBS'de% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) ile dolu bir 6 oyuklu doku kültürü plakasına yerleştirilmiş 100 mikron süzgece doku ve enzimatik solüsyon aktarın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 2 mL'lik şırınganın siyah lastik pistonuyla hafifçe harmanarak mekanik olarak ayırın.
NOT: Bundan böyle, tüm basamaklar 4 ° C'de yapılmalıdır. - Bir Pasteur pipet ile hücre süspansiyonu toplayın ve 15 mL tüp içine aktarın.
- SpiN, 7 dakika süreyle 320 xg'de 4 ° C'de. Süpernatantı özlemle atın.
- Pelet 60 μL Fc-bloke edici tampon (CD16 / CD32, FACS tamponu içinde 1/50 oranında seyreltilmiş antikor engelleme) içinde tekrar süspanse edin.
- Bir yuvarlak tabanlı 96 çok oyuklu plakaya tek tek hücre süspansiyonu başına 50 mcL aktarın. Buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edin.
NOT: Az miktarda numuneyi tutarken boyama 5 mL polistiren FACS tüplerinde de yapılabilir. - Her dokudan alınan örneklerin bir havuzunu elde etmek için geri kalan 10 mcL'yi 5 mL'lik bir polistiren FACS tüpüne aktarın. Bu havuz, kontrol (yani, boyanmamış örnekler ve her florokrom floresan eksi bir (FMO) kontrol) olarak hizmet edecektir. 96 çoklu kuyucuklu plakaya her flüoresan eksi bir (FMO) kontrol için (florokrom başına bir) 50 mcL havuz aktarın.
NOT: Her bir FMO kontrolü, antikor panelindeki tüm florokrom çiftli antikorları içerir;Bu ölçülüyor. FMO'lar kapı sınırlarını tanımlamak ve çok renkli panellerde spektral örtüşmeyi kontrol etmek için kullanılır. Farklı dokulardaki arka plandaki ve otofloresansdaki değişimleri doğru bir şekilde ele almak için, bu kontrolleri her dokudaki örnek havuzundan hazırlamak önemlidir. YFP ifadesi için uygun kontrol, Cre-negatif embriyoların PCR genotiplemesi ile teyit edilen örnekleri olacaktır.
- Bir yuvarlak tabanlı 96 çok oyuklu plakaya tek tek hücre süspansiyonu başına 50 mcL aktarın. Buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edin.
4. Yüzey Antijen Boyaması
- Antikor karışımı FACS tamponunda hazırlayın (Tablo 2). Her numune için 50 uL antikor karışımı hazırlayın.
- Aşağıdaki florokrom bağlı antikorları kullanın: anti-CD45.2 (klon 104); Anti-CD11b (klon M1 / 70); Anti-F4 / 80 (klon BM8); Anti-AA4.1 (klon AA4.1); Anti-Kit (klon 2B8); Ve anti-Ter119 (klon Ter119).
- FACS tamponundaki FMO kontrolleri için altı antikor karışımı hazırlayın. Kontrol numunesi başına antikor karışımı 50 mcL hazırlayın.
YOK HAYIRTE: Antikor karışımındaki antikor seyreltmesi, malzeme tablosunda belirtilen son konsantrasyondan iki kat fazla konsantre. Altı florokroma bağlanmış antikor içeren bir panel için, 6 FMO kontrolü hazırlandı. Tablo 2 , bir tüp için antikor karışımı ve FMO kontrollerinin bileşimini sağlar.
| Antikorun hacmi (μL) (Nihai Hacim 50 uL) | ||||||||
| Antikor | Klon | Antikor Karışımı | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | FMO Kiti | FMO Ter119 |
| Anti-CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-CD 11 b | M1 / 70 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| Anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| Anti-Kit | 2B8 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| Anti-Ter119 | Ter119 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| FACS tamponu | 45,5 | 46.5 | 46 | 46.5 | 46.5 | 46 | 46 | |
Tablo 2: Boyama için kullanılan antikorların hacmi ve Floresan eksi bir (FMO) kontroller. Nihai 50 μL hacim için gereken antikorun hacmi (μL).
- 96-çoklu plaka numunelerine antikor karışımı 50 mcL ekleyin (boyama sırasında son hacim 100 mcL'dir). Yavaşça iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 30 dakika boyunca buzda inkübe edin.
- 96-çoklu plakayı 4 ° C'de 320 xg'de 7 dakika döndürün ve süpernatanı atın. 200 μL FACS tamponuna tekrar süspanse edin.
- Tekrar yıkama prosedürünü (adım 4.3) 150 μL FACS tamponu ile tekrarlayın.
- Numuneleri ve kontrolleri (FMO'lar ve renksiz havuz örnekleri) 70 um'lik süzgeçten geçirerek 5 ml'lik polistiren tüplerine süzün. Kazanıncaya kadar buzda saklayın.
5. ÇYP'lerin ve YS kaynaklı makrofajların Akış Sitometri ile tanımlanması
NOT: Bu protokol, bir 4 lazer akış sitometresi eq405 nm Violet lazer, 488 nm Blue lazer, 562 nm Yellow lazer ve 638 nm Red lazer ile empoze edildi.
- Üreticinin talimatları uyarınca her bir birleştirilmiş antikor için kompozisyon boncukları hazırlayın. Lazer yoğunluklarını optimize etmek için renklendirilmemiş örnekler ve kompozisyon boncukları kullanın.
- Kapı sınırlarını belirlemek için, her bir antikor için FMO (Floresans eksi bir) kontrolleri kullanın.
- Ölü hücreleri dışarıda bırakmak için, edinme işleminden 1 dakika önce tüpe (200 uL boyanmış hücre süspansiyonu içeren) 1 mL'lik DAPI (1 mg / ml) ekleyin. Ölü hücrelerin ve enkazın hariç tutulmasını gerçekleştirmek için güçlü DAPI sinyalini ve ileri dağılmış parametreyi (FSC) kullanın.
NOT: edinme sırasında kapıları çizmek için akış sitometresinden yazılım kullanın. Tazminat matrisi ve analizi, piyasada bulunan diğer yazılımları kullanarak numune alımından sonra gerçekleştirilebilir. - Toplam olaylardan canlı hücre ve ikili ayrımcılık yapmak için ileri ve yan saçılım (FSC vs SSC) kullanın.
- Log-ölçekli eksende floresan nokta çizelgeleri oluşturun ve kızıl kapıları çizin, önce eritrositler hariç tutun (Ter119 + ) ve daha sonra progenitör hücreleri (Kit + ) ve hematopoietik hücreleri (CD45 + Kit negatif ) tanımlayın (Bkz. Şekil 1 ).
- YS ( Şekil 2 ), fetal karaciğer ( Şekil 3 ) ve beyindeki ( Şekil 4 ) farklı tanımlanan popülasyonlar arasında YFP'nin etiketleme verimliliğini ölçmek için floresan histogramları oluşturun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Genetik kader eşleştirmesi, bir Rosa26-LSL-eYFP raportörü taşıyan erkeklerle çiftleştirilen Csf1r-Mer-iCre-Mer dişilerinde E8.5 OH-TAM ile idare edilerek gerçekleştirildi. OH-TAM'ın varlığında, durdurma kasetinin eksizyonu, Csf1r'yi ifade eden hücrelerde YFP'nin kalıcı şekilde eksprese edilmesine yol açar. İki hematopoietik dokuyu topladık: yolk kesesi ve fetal karaciğer ve E10.5 embriyolarından alınan hematopoietik olmayan bir doku, nöroektoderm. Tek hücrel...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hematopoietik prekürsör hücrelerin farklı dalgaları kısa bir zaman çerçevesinde kısmen çakışır; bu da her gelişimsel hematopoetik dalganın katkısını teknik olarak çok zorlayıcı olan bağışıklık hücrelerine analiz eder.
Tamoksifenle indüklenebilen Cre sistemleri, spesifik hücreleri zamansal olarak indüklenebilir bir şekilde etiketleme ve ex vivo veya in vitro kültür veya transplantasyona ihtiyaç duymadan embriyolar veya yetişkinlerde soy analizleri yapma fırsatı sunar. Tamoks...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar fikirli tartışmalar için Prof Frederic Geissmann ve Prof Christian Schulz'a teşekkür ederler; Makale eleştirel okuma Dr Hannah Garner, Xavier Montagutelli ve Dr Jean Jaubert ve fare yetiştirme desteği Institut Pasteur hayvan tesisi personeli; Ve Pascal Dardenne ve Vytaute Boreikaite, bir Amgen Bursiyeri, teknik yardımları için. EGP laboratuarında yapılan araştırmalar, Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM ve Institut Pasteur ve REVIVE konsorsiyumundan bir başlangıç paketi) tarafından finanse edilmektedir.LI, REVIVE konsorsiyumundan bir doktora bursuyla desteklenmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| #5 Düz Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Yaylı Makas | Güzel Bilim Araçları | 15371-92 | |
| 8,5 cm düz makas | Güzel Bilim Araçları | 14090-09 | |
| Anti-Fare Kiti-PE (klon 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | FAC'lerde 1/200 seyreltme Tampon |
| Anti-Fare CD45.2 APC-Cy7 (klon 104) | Sony | 1149120 | FAC'lerde 1/100 seyreltme Tampon |
| Anti-Fare AA4.1-APC (CD93, klon AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | FAC'lerde 1/100 seyreltme Tampon |
| Anti-Fare Ter119 PerCP-Cy5.5 (klon Ter119) | Biolegend | 560512 | FAC'lerde 1/200 seyreltme Tampon |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (klon BM8) | BD Pharmingen | 123137 | FAC'lerde 1/100 seyreltme Tampon |
| Anti-Fare CD11b PE-Cy7 (klon M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | FAC Tamponunda |
| 1/200 seyreltmeAnti-Fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Bloğu, klon 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Sığır Serumu | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Kollajenaz D | Roche | 11088882001 | |
| Deoksiribonükleaz I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6 oyuklu doku kültürü plağı | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12 oyuklu doku kültürü plağı | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24 oyuklu doku kültürü plakası | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 kuyulu U-şekilli alt doku kültürü plaka | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Şırınga Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Naylon ızgara 100 & m hücreli süzgeçler | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Naylon ızgara 70 & mikro; m hücreli süzgeçler | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tüpleri | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtrasyon kiti, 0.2 & mu; m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Sığır Serumu Albümin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z) -4-HİDROKSİTAMOKSİFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Tamoksifen ve türevleri hazırlanırken ve bunlarla çalışırken özel dikkat gösterilmelidir. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın |
| Progesteron | Sigma | P3972 | Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın |
| PEG-35 hint yağı (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Ayçiçek yağı | Sigma | S5007-250ML | |
| Etanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve çeker ocak altında kullanın |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (SUDA 1 MG/ML) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 akış sitometresi | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Günlük QC Florosferler | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antikor Yakalama Boncuk kiti (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | Jackson laboratuvarı | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | Jackson laboratuvarı | 6148 |
Kaynaklar
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
