Bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinlerini kullanarak gecikmeli iplik başlatmanın kinetiğini incelemek için hassas, jel bazlı süreksiz tahlilleri tanımlıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Burada, bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinleri tarafından in vitro olarak gecikmeli iplikli DNA sentezinin kinetik incelemesi için protokoller sunuyoruz. T7 replizomu, biyokimyasal deneyler için çekici bir özellik olan sadece dört proteinden oluşan, bilinen en basit replikasyon sistemlerinden biridir. DNA polimeraz tarafından DNA sentezini başlatmak için kullanılan T7 primaz-helikaz tarafından ribonükleotid primerlerinin sentezine özel önem verilir. DNA replikasyon mekanizmaları evrim boyunca korunduğundan, bu protokoller diğer model sistemlerini kullanan araştırmacılara uygulanabilir veya kavramsal bir sıçrama tahtası olarak yararlı olmalıdır. Burada açıklanan protokoller oldukça hassastır ve deneyimli bir araştırmacı bu deneyleri gerçekleştirebilir ve yaklaşık bir gün içinde analiz için veri elde edebilir. Gerekli olan tek özel ekipman parçası, hızlı bir söndürme akış cihazıdır, ancak bu ekipman parçası nispeten yaygındır ve çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir. Bununla birlikte, bu tahlillerin en büyük dezavantajları, radyoaktivite kullanımını ve göreceli düşük verimi içerir.
Giriş
DNA replikasyon bütün hücresel yaşam korunmuş bir özelliğidir. Çoğaltma bileşenlerinin kimlik ve sayısı çok çeşitlilik gösterirken, genel mekanizmalar evrim 1 arasında paylaşılır. Burada, T7 replizom bileşenleri ile in vitro koşullarında geri kalmış iplikli DNA sentezinin kinetik anlamaya yönelik radyoaktif substratlar kullanılarak jel bazlı, sürekli olmayan kinetik deneyler tarif eder. Bakteriyofaj T7 çoğaltma makineleri sadece dört protein (DNA polimeraz, GP5, ve processivity faktörü, E coli tiyoredoksin, iki fonksiyonlu primaz-sarmal GP4, ve tek sarmallı DNA bağlama proteini, GP2 oluşan çok basittir. 5) 2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: dahil ancak, eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve uygun akrilik kalkan olarak, sınırlı kişisel koruyucu ekipman kullanımı değil, radyoaktif malzemenin güvenli kullanımı ve bertarafı ile ilgili tüm kurumsal düzenlemelere uyun.
Not: standart tampon 40 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM potasyum glutamat, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA (Bu tampon 5x konsantrasyonda önceden yapılır) ve her dNTP 0.3 mM oluşur. T7 kopyalama proteinleri, 10 9, 8 tarif edildiği gibi saflaştırılır. Tek bir T7 primaz tanıma sitesi (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3'....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
El ile birden fazla devir koşulları altında GP4 tarafından katalize edilen bir primer sentezi reaksiyonu örnekleme ile, örneğin, bir protokol aşama 1 'de tarif edildiği gibi, şekil 1A'da gösterilen sonuçlar elde edilmiştir. Burada, jel elektroforezinden sonra bir ürün yelpazesi primer sentezi reaksiyonlarının (Şekil 1A) α-konumunda 32 P ile etiketlenmiş CTP kullanılarak gözlemlenebilir. işaretli ön madde, CTP .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu deneyler en önemli faktör son derece aktif saflaştırılmış enzim mevcudiyetidir. GP4 ile çalışma sırasında, örneğin, -20 ° C'de% 50 gliserol ihtiva eden tampon maddesi içinde saflaştırılmış enzim depolama (20 mM potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde bulunan bir azalmaya yol açar birkaç ay boyunca preparatın spesifik aktivitesi. Bu nedenle, şu anda, saflaştırılmış 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM TCEP içinde GP4 ve% 10 gliserol flaş dondurma, küçük numuneleri, sıvı azot kullanı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yorumları için C.C.R. laboratuvar üyelerine ve şekil hazırlığı için S. Moskowitz'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe Enstitüleri F32GM101761 (AJH) ve GM54397 (CCR) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tris önceden ayarlanmış kristaller pH 7.5 | SIGMA | T4128 | |
| Tris bazı | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat | SIGMA | G1501 ve nbsp; | |
| Magnezyum klorür hekzahidrat | Mallinckrodt Kimyasalları | 5958-04 | |
| 1,4-Ditiyotreitol | JT Baker | F780-02 | |
| Sodyum Dodesil Sülfat | MP Biyomedikaller | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraasetik asit, disodyum tuzu, dihidrat | Mallinckrodt Kimyasalları | 4931-04 | |
| [α -32< / sup>P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radyoaktif, koruyucu önlemler alın |
| [γ-32< / sup>P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radyoaktif, koruyucu önlemler alın |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | dört dNTP, |
| setin bir parçası 100 mM, ATP ve CTP | Epicentre | , RN02825 | NTP setinin bir parçası |
| , ssDNA yapıları, | Entegre DNA Teknolojileri | N/A | , özel diziler |
| metanol ve nbsp; | Macron İnce Kimyasallar | 3017-08 | |
| formamid | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromofenol mavisi | SIGMA | B8026 ve nbsp; | |
| Silen, ksiyanol | SIGMA | X4126 | |
| akrilamid | SIGMA | A9099 | Toksik |
| N, N′ -Metilenbisakrilamid | SIGMA | M7279 | zehirli |
| Üre | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Borik asit | Mallinckrodt Kimyasalları | 2549 | |
| Hızlı Söndürme-Akış Cihazı | Kintek A.Ş. | RQF-3 | |
| Kintek Kaşif | Kintek A.Ş. | N/A | |
| Kaleidagraph | Sinerji Yazılımı | N/A |
Kaynaklar
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
