Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

8.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

24 Şubat 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Bu makalede

Özet

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Özet

Bir endojen rejenerasyon programı nöronal hasar ve ölümünden sonra (Danio rerio) retina yetişkin zebrafish Müller glia tarafından başlatılır. Müller glia hücre döngüsünü tekrar girin ve hücre bölünmeleri daha sonraki mermi geçmesi ve kayıp nöronal hücre tiplerine ayırt nöronal progenitör hücreler üretmek. Hem Müller glia ve nöronal progenitör hücre çekirdekleri kendi DNA'sını çoğaltmak ve Interkinetic olarak tanımlanan bir süreç içinde retinanın, yani sırasıyla, bazal İç Nükleer Katmanı (INL) ve (onl) Dış Nükleer Katman arasında göç ayrı yerlerde mitoz geçiren nükleer Göç (INM). INM ağırlıklı gelişmekte olan retinada incelenmiştir. detaylı Zebra balığı retina rejenere erişkin INM dinamiklerini incelemek için, floresan etiketli Müller glia / nöronal progenitör hücrelerin canlı hücre görüntüleme gereklidir. Burada, biz izole etmek için koşullar ve kültür dorsal retina sağlamakTg dan [GFAP: nGFP] 35 saat süreyle sürekli yoğun ışığa maruz bırakıldı mi2004 zebra balığı. Biz de bu retina kültürleri sürekli olarak GFAP göç davranışlarını izlemek için multiphoton mikroskopi kullanılarak en fazla 8 saat retina eksplant kalınlığı boyunca z-yığın görüntüleri elde, canlı hücre görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için geçerli olduğunu göstermektedir: nGFP pozitif hücreler . Ayrıca, apikal ve bazal INM hızını belirlemek için post-görüntüleme analizi gerçekleştirmek ayrıntıları açıklar. Özetlemek gerekirse, biz nöronal rejenerasyon bir yetişkin modelinde INM dinamiklerini incelemek için koşulları oluşturmuştur. Bu, bu çok önemli hücresel sürecin anlayışımızı ilerletmek ve bize INM kontrol mekanizmaları belirlemek için izin verecektir.

Giriş

Insanlarda farklı olarak, zebra balığı (Danio rerio) sergiler retina nöronlarının, 1, 2, 3, 4, hücre ölümü üzerine sağlam bir rejenerasyon yanıt. Tümör nekroz faktörü α, retina nöronlarının ölen salınan bir sinyal molekülü nöronal hücre ayırma yöntemi önce çoğalmaya devam nöronal progenitör hücreler 5 çoğalır ve üretilmesi için taban iç nükleer tabaka retinanın (INL) ikamet Müller glia indüklemektedir 2 ölen türleri, 3, 4. Yenilenmesi tepkisinin çoğalma fazı sırasında, Müller glia çekirdekleri ve elde edilen nöronal progenitör hücreler, hücre siklüsü (Interkinetic Nükleer Göç, INM) 6 aşamasında tekrar eden göç desen geçmesi > 7. bazal INL konumlandırılmış Çekirdekler çıkan çekirdekleri INL için dorsalde dönmeden önce onlar bölmek Dış Nükleer Layer (onl) göç önce DNA çoğaltırlar. Canlı hücre görüntüleme teknikleri, daha sonra Sauer 8, 9, 10, 11, 12 ile bir yorum teyit Bu süreç ilk olarak, histolojik yöntemlerle nöroepitelyal gelişimi sırasında açıklanmıştır. Hem histokimyasal ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları İNM ve retina 9, 11, 12, 13 olmak üzere neuroepithelia gelişmekte işlevini altında yatan mekanizmaları belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, retina yenileyici yetişkin İNM yöneten mekanizmalar çok ayrıntılı olarak araştırılmamıştırxref "> 6, 7. Canlı hücre görüntüleme yetişkin yenileyici retina İNM kontrol sinyal yollarının bilgimizi ilerletmek için paha biçilmez bir yaklaşım olacaktır.

Yakın zamana kadar, retina INM canlı hücre görüntüleme canlı zebra balığı embriyolar ya ya da piliç embriyonik veya postnatal fare retinal eksplantlar 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 ile sınırlı kalmıştır. Fare, sıçan ve zebrabalıkları içeren türlerin çeşitli yetişkin hayvanların retina eksplantlar, farklı hücre biyolojik yaklaşımlar 17, 18, 19, 20 için kullanılmış olmakla birlikte, canlı hücre görüntüleme deneyleri retina eksplantlar ha kullanılarakziyaretinde sürelerde bilgilendirmek kısıtlandı ve birkaç saat 21, 22 üzerinde sürekli olarak gerçekleştirilir edilmemiştir. Burada, çoklu foton mikroskopi 6 kullanarak canlı hücre görüntüleme deneyleri izleme İNM gerçekleştirmek için kültür ışık hasarlı yetişkin zebrabalıkları retina için ayrıntılı bir protokol açıklar. INM dinamikleri olarak, örneğin, hızlar oldukça potansiyel immünsitokimya kullanılarak tespit olmaz mitoz konumu, daha etkilenebilir, INM kontrol mekanizmaları araştırılırken Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları immünohistokimyasal yöntemlere göre avantajlıdır.

Gelecekte, bu yöntem aynı zamanda bir potansiyele sahip gibi Müller glia ya da mikroglia davranışları ile fotoreseptör ölme fagositoz gibi retinal rejenerasyon sırasında diğer dinamik süreçleri incelemek için modifiye edilmesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Zebra balığı kaldırdı ve Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi'nde Notre Dame Zebra balığı tesiste muhafaza edildi. Bu yazıda anlatılan yöntemleri Notre Dame Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği tarafından görme araştırma hayvanların kullanımı için deyimi ile uyum içindedir vardır.

1. Çözümler

  1. doku kültürü kaput ve herhangi bir ekipman / doku kültürü kaputu aktarılır reaktif sterilize etmek için% 70 etanol hazırlayın.
  2. (: 500 2-fenoksietanol 1) sistem 1 L su, 2-fenoksietanol 2 mL ekleyin.
  3. 0.1 mM NaHCO 3, pH 8.0 hazırlanır. steril doku kültürü kaputu çözüm sterilize etmek 10 ml şırınga ve bir 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi kullanın.
    NOT: NaHCO 3 verimli fluorodishes bir lamel yüzeyi boyunca hücre ve doku yapıştırıcı yaymak için kullanılır (bkz) 3.2 adım.
  4. Hazırlama 1.0 M CaCl2 ve 1.0 M MgCI2. steril doku kültürü kaputu 10 ml şırınga ve 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi ile sterilize edin.
  5. Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlamak için, 1 mM, her bir son konsantrasyonda fenol kırmızısı olmadan Ca2 + / Mg2 + olmaksızın 1x HBSS için MgCl2 CaCl2 steril ve steril ekleyin. Steril bir ortamda çalışın.
  6. % 50 fenol kırmızısı olmaksızın 1x en az temel ortam (MEM),% 25 CaCl2 ve MgCl2 içeren HBSS (bölüm 1.4),% 25 at serumu (HS), 10 birim / ml penisilin ve 10 karışımı, kültür ortamı hazırlamak ug / ml streptomisin. Steril bir ortamda çalışın.
    NOT: bu suretle gürültü oranı sinyali etkileyen autofluoresces olarak fenol kırmızısı içeren orta kaçının. 23
  7. fenol kırmızısı olmadan 1x MEM içinde% 1 düşük erime noktalı agaroz 10 ml hazırlayın. agaroz / 1x MEM bir Mikrodalga fırın kullanarak eritinave. Sıvı buharlaşmaya bağlı iyonu konsantrasyonları değiştirecek tekrar tekrar ısıtma agaroz (örneğin, 10 mL) arasında küçük hacimli hazırlayın.
  8. kültür önce, otoklav 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri sterilize edin.

2. Işık hasar Paradigma

  1. Koyu-adaptasyon
    1. 2 koyun - 3 Tg [GFAP: nGFP] 6'da mi2004 zebrabalıkları (ya da diğer ilgi transgenik zebrafish) - 14 gün boyunca ışık yoksun bir ortama yaşı 14 ay. Daha ayrıntılı bilgi için referans 2, 6, 24, 25 bkz.
  2. 2800 lux 2, 6, 24, 25 ışık yayarlar iki floresan lamba arasındaki sistem suda 3 koyu adapte transgenik zebrafish - 2 içeren tankı yerleştirin.
  3. 35 saat boyunca sabit yoğun ışığa zebrafish Açığa. 33 ° C - ışık pozlama sırasında, su sıcaklığı 31 arasında muhafaza edilmektedir emin.

Kültür için 3. Hazırlık (Retina İzolasyon gününde)

  1. % 70 etanol kullanılarak, doku kültürü kaputu ve bileşenleri sterilize / doku kültürü kaputu aktarılır araçlar (örneğin, MEM ve HBSS, pipet, steril pipet uçları, vb içeren şişeler.).
  2. fluorodishes hazırlanması
    1. Hücre ve doku yapıştırıcı ile her retina için Coat bir fluorodish (Malzeme Tablo).
    2. 70 ug / ml bir son konsantrasyona kadar 0.1 mM NaHCO 3 hücre ve doku yapıştırıcı seyreltilir Her fluorodish 50 uL ekleyin ve 200 uL pipet ile fluorodish merkezi boyunca çözeltisi yayılır (yaklaşık 1-1,2 cm çapında ).
    3. Oda sıcaklığında 3 saat - 1 kaplı fluorodishes inkübe(Alternatif olarak, 4 ° C'de O / N inkübe).
    4. çözüm çıkarın ve her yıkama için 1x MEM 500 uL ile 3x yıkayın. retina eksplantlar monte kadar kurumasını kaplanmış fluorodishes önlemek için, MEM onları korumak.
  3. Adım 1.6 açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kültür ortamı 1 haftaya kadar 4 ° C saklanabilir.

Retina Eksplantlarından 4. İzolasyon ve Kültürleme

Not: Aşağıda belirtilen protokol ağırlıklı tarif edilen ışık hasarı paradigmasının lezyonlu retinal bölgedir dorsal retina, izolasyonu içindir. Bu nedenle, hasar kaynaklı çoğalması ve interkinetic nükleer göç ilişkili olay dorsal retinada meydana gelir. Ancak, izolasyon prosedürü araştırmacı / araştırma sorusunun özel ihtiyaçlarına göre retina bölgeleri elde etmek için ayarlanabilir.

  1. Bir ışık hasarlı transgenik zebrafish a euthanize1'de ta süresi: 500 2-fenoksietanol.
  2. 1000 uL pipet ile bir fluorodish gelen MEM Kaldır sıvı kalıntılarının sadece ince bir film böylece.
  3. Kuru bir kağıt havlu üzerine zebrafish aktarın Dumont forseps (forseps # 5, 45 ° açı) bir eğri çifti ile göz çıkarmak ve fluorodish aktarabilirsiniz.
  4. Optik sinir ile gözün arka görünecek şekilde bir stereomikroskop kullanılarak, (Şekil 1D) fluorodish kapak kayma üzerine öğrenci ile göz yönlendirmek.
  5. McPherson-Vannas bir makas ile gözün arka yakın kesim, optik sinir çıkarın. Buna ek olarak, gözün dışında astar bağ dokusu kaldırmak.
  6. Lamina cribrosa aracılığıyla bir makas bıçağı ile piercing ve nazal ve gözün zamansal taraflarında boyunca keserek optik sap bir kesi yaparken 5. forseps bir çift ile nazal ve temporal tarafı arasındaki göz tutun (Şekil 1E bkz , parçalı line).
  7. retina dorsal yüzü ve dorsal retina ventral ayrı doku çekmek için diğer çifti tutmak için # 5 forseps iki çift, bir kullanma.
    NOT: sklera yukarı bakacak iken objektif ve ganglion hücre tabakası lamel karşı karşıya böylece dorsal retina yönlendirmek için tavsiye edilir.
  8. 5. forseps (Şekil 1 H, I) 'in ikinci bir çift retina bağlı lens tutarken, 5. forseps bir çift dorsal retinadan sklera çıkarın.
  9. Merceği çıkarmak için, McPherson-Vannas makas kullanın ve retina (Şekil 1I, J) zarar vermeden merceğin arkasında kesti. Bazen, objektif adım 4.7 ayırır. Bu durumda, 5. forseps ikinci bir çift ile bir kesim kenarında retina tutarak forseps ile dikkatlice sklera çıkarın.
  10. retina zarar vermeden lensi çıkarırken vitrözü çıkarın. kapak kayma bakan ganglion hücre tabakası ile retina düzleştirmekfluorodish (Resim 1L, M).
  11. % 1 düşük erime noktası agaroz 10 uL ile retina Surround ve agaroz katılaşmaya edelim.
  12. Hatta hafif bir yükseklik dokusuna derinlemesine odaklanma yeteneğini etkileyebilir sıvı agaroz retina asansör olmadığını izleyin. Kaldırma görülürse, agaroz kaldırmak için bir pipet kullanın. daha eklemek denemeden önce kalan agaroz seti olsun.
  13. tüm fluorodish kapsayacak şekilde% 1 düşük erime noktası agaroz eklemeden önce birkaç kez adımı yineleyin 4.12. Agaroz katılaşmış sonra, 1.5 ml kültür ortamı ilave edin.
  14. Retina izolasyon prosedürü ile, oluşan stres kurtarmak sağlamak için yaklaşık 12 saat boyunca 32 ° C'de ayarlanmış bir% 5 CO2 / hava ortamında retina eksplant kültürünü koruyun. Işık ile muamele zebrabalıkları aynı sıcaklıkta retina korumak için 32 ° C sıcaklık ayarlama (adım 2.3).

5. multiphoton Mikroskopi

NOT: Bu yazının yapılan deneyler kızılötesi lazer (Malzeme Tabloya bakınız), 40X Apo uzun mesafe suya daldırma hedefi (1.15 NA) ile donatılmış bir multiphoton mikroskop, bir galvanometre tarayıcı ve bir için optimize edildi dört adet 35 mm Petri kapları için bir ekleme içeren çevresel odası. görüntüleri olmayan bir descanned detektörü (R-NDD) ile elde edildi.

  1. Görüntüleme önce, bir% 5 CO 2 / hava atmosferi elde etmek için çevresel odasını dengelenmesi. Boş Petri kapları odasına gaz sızıntısını önlemek için tutucu takılı olduğundan emin olun.
  2. mikroskopi sistemi açın.
  3. Çevre odası dengelenmiş sonra, 40X Apo uzun mesafe suya daldırma hedefi (NA 1.15) üzerine kırılma endeksi sıvı ekleyin.
    Not: suya benzer optik özelliklere sahip kırılma endeksi sıvı uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için kullanılır.
  4. Yeri gribiodasına retina eksplant ile orodishes. aydınlık ışığını kullanarak, ışık yoluna örnek konumlandırmak ve odak düzlemi içine dorsal retinanın midregion getirmek.
  5. GFAP odaklanmak GFP epifluorescent ışığı kullanın: nGFP Müller glia çekirdekleri (Şekil 2A, C) pozitif.
    NOT: nGFP pozitif çekirdekler ya da loş floresan olacaktır: eksplantlar düz veya agaroz eksplant altında biriken monte değilseniz, bu GFAP üzerine odaklanmak zor olacaktır.
    1. Aynı retina eksplant içinde farklı bir bölgeye hareket odaklama sorunu aşmak olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde farklı bir retina eksplant taşıyın.
  6. görüntü elde etme yazılımı olarak, 'A1 Milletvekili GUI', 'TiPad', 'A1 Kompakt GUI' ve 'ND edinme' pencereleri açın. multiphoton görüntüleme için, 'IR NDD' seçeneği 'A1 Kompakt GUI' seçilen olduğundan emin olun.
  7. 'Batan içindegın 'alanına, 1. dikroik ayna IR-DM seçin ve GFP floresan elde etmek 525/50 bant geçiren filtre seçin.
  8. 'A1MP GUI' etiketli bir pencerede IR lazer açın. Lazer hazır olmak için bir kaç dakika sürer. GFP floresan heyecanlandırmak ve 'A1 Milletvekili GUI' penceresinde 'Otomatik hizalama' butonuna tıklayarak lazer hizalama için 910 nm dalga boyu ayarlayın.
  9. Oda ve ekipmanları ışıkları photomultiplier tüpünün aşırı pozlamayı önlemek için 'A1 Milletvekili GUI' deklanşör açmadan önce kapalı veya örtülü olduğundan emin olun. gürültü seviyelerini azaltmak için, karanlık bir ortamda mikroskop ev.
  10. ikisinin bir zoom ve 4.8 us / piksel piksel konut anda 300 x 300 piksel, görüş alanı görüntülerini elde edin. Kabaca 'A1MP GUI' ve 'A1 Kompakt GUI' penceresindeki kazanç 'satın alan' değiştirerek lazer gücünü kurdu.
  11. z-yığını ayarlama
    1. ND edinme 'penceresinde' içinde Z'-altpencere 'z-yığınının üst odak düzlemini ayarlamak için ganglion hücre tabakası odaklanın. Bazı GFAP: nGFP pozitif hücreler tipik olarak retina (Şekil 2A, D) taban sınırı belirlemeye yardımcı olur ganglion hücre tabakası, yer almaktadır.
    2. Onl düzeyi ile odak düzlemi hareket ettirin (Şekil 2A, B), loş etiketli GFAP varlığı ile karakterize edilir: INL (Şekil 2A, C) muadilleriyle yuvarlak ve genişlemiş göreli nGFP pozitif hücreler .
    3. z-yığının altında bu uçağı ayarlayın. Tüm onl (Şekil 2A, B) yansıması olacaktır emin olun.
    4. Görüntüleme döneminde yeniden ayarlama gerektiren odak düzlemi vardiya, yaşıyor yaparken 'ev' pozisyon olarak atamak için 'z' altpencere orta konumda çift tıklayın. değişiklik 'simetrik mod tanımlanan've 'göreli' tıklayın.
    5. 1 mikron 0.7 arasında z-adım boyutunu ayarlamak.
  12. Z-yoğunluk düzeltmesi:
    1. nedeniyle ışık saçılması piksel yoğunluğu kaybını telafi etmek için z-yoğunluk düzeltmeleri yaparken dokusunun derin katmanlarında görüntüleme.
    2. düzeltme kurmak için, 'z-yoğunluk düzeltme' penceresini açın. 'Z-yığın aralığı', 'ND Kimden' seçin ayarlamak için.
    3. ve kazanç (A1 Kompakt GUI ( 'A1MP GUI' in 'edinim alan') lazer yoğunluğu (bu durumda, ganglion hücre tabakası karşılık gelir) 'z-yoğunluk düzeltme' penceresinde alt odak düzlemi üzerine tıklayın ve set ).
    4. sonradan seçilen odak düzlemi için 'z-yoğunluk düzeltme' penceresinde 'cihaz ayarları' başlığı altında gösterilen ayarları onaylamak için 'z-yoğunluk düzeltme' penceresinde 'z-değerleri' yanındaki oku tıklayın.
    5. Orta a için işlemi tekrarlayınlazer gücü ve kazancı artan nd üst düzlemler. Gerekirse ek odak düzlemi eklenebilir. 4 - Şekil 2 deneyler için özel lazer ve kazanç ayarları için Tablo 1'e bakınız.
    6. 'A1 Milletvekili GUI' penceresindeki 'satın alan' olarak ayarlayın. 15 daha büyük bir kazanç alanı ve photobleaching atlatmak için görüntüleme başında bir kazanç daha yüksek 126 seçmekten kaçınmak ve gürültü seviyeleri arttı.
      NOT: lazerler ve photomultiplier tüpleri photobleaching kaçınarak kurmak mikroskop için en uygun görüntüleme koşulları elde etmek mikroskopi sistemleri, deney lazer ve kazanç ayarları arasında farklılık gösterdiğinden.
    7. 'Z-yoğunluk düzeltme' penceresinde 'nispi yoğunluk düzeltme' seçin.
  13. 'ND edinme' penceresinde 'timeseries' altpencere içinde, 8 saat süre ile 'hayır gecikme' için aralığını ayarlayın. Ardından, t 'Run z-düzeltme' tıklayın emin olun'ND edinme' penceresi düğmesini o z yığın 'alt pencere 3-D timeseries elde etmek.
  14. görüntü alımı süresince 29 ° C - 27 arasındaki bir sıcaklıkta retina eksplantlar koruyun.
  15. görüntü elde etme dönemi boyunca, gerekirse, post-görüntüleme analizi için görüntü kalitesini korumak için güç seviyesini ve kazanç yeniden ayarlayın. 5.11.4 - ayarlamaları için adımları 5.11.2 gerçekleştirin.
  16. odak düzlemi kayarsa, duraklatmak veya akışını durdurur ve yeniden adımı 5.11 gerçekleştirin.
    NOT: 'göreli z-düzeltme' adım 5.12.7 seçildi ve adım 5.11.4 gerçekleştirildi Eğer geniş photobleaching oluştu sürece, güç ve kazanç düzeylerini yeniden ayarlamak için gerekli olmamalıdır.

Hız 6. Analizi

  1. görüntüde 'faiz bölgeyi' ayarı, zaman ayıklayın. 'Zaman ölçümü' aracını kullanın ve bir elektronik tabloya zaman değerleri ihracat.
  2. DI içeren bir bölgeyi kırpmaviding GFAP: nGFP pozitif çekirdeği.
  3. o sonradan bölme çekirdeği bazal INL ile ilgili olarak göç mesafeleri ölçmek için bir referans noktası ayarlamak için İNM uğramayan en az bir çekirdeğin içerecek şekilde kırpılmış bölgenizi seçin. Not: Bazal INL kalan bir çekirdek seçmek için, bu timeseries bir 3-D yeniden hazırlanması için yardımcı olur.
  4. Bir GFAP Alternatif olarak,: nGFP pozitif hücre elde etme süresi boyunca ONL gözlenir, bir referans noktası belirlemek için, bazal INL için onl çekirdekten yayılan sabit uzunluktaki dikey bir çizgi kullanın.
  5. 'Gösteri dilimleri görünümü' fonksiyonunu kullanarak, dik projeksiyonlar oluşturabilir. Daha sonra, 'maksimum intensite projeksiyonu' ile 'dilim' dan modunu değiştirmek.
  6. dik maksimum projeksiyon 'xy' görünümü kapatın. göç / bölme çekirdeği, en iyi görünür hangi yönüne bağlı olarakLSO 'xz'- ya da' yz'-görünüm ya da kapatın.
  7. farenin sağ tuşu ile kalan resmin üzerine tıklayın ve bu görünümden yeni belge oluşturma 'fonksiyonu' xz 'veya' ile yz' görüntü serisi 'ayıklayın. Gerekirse, görüntüyü döndürmek.
  8. 'Manuel ölçüm' fonksiyonunu kullanarak, bazal INL kalır ve İNM uğramayan çekirdeğin alt düzeyde görüntü boyunca yatay bir çizgi çizin (= referans noktası Şekil 4A - E, kırmızı yatay çizgi).
  9. Referans çizgisi ve analiz yazılımı 'hat ölçümü' aracını (- E Şekil 4A) kullanarak timeseries için göç çekirdeğin bazal noktası arasındaki mesafeyi ölçün.
  10. nükleer zarf ayırır kez tüm hücreye GFP difüzyon aşağıdaki tanımlanabilir ise, soma bazal konumunu ölçmek.
  11. Bir tablo yazılımı kullanarak, mesafeyi bir nu arsaçekirdeğinde (Şekil 4F) geçen zamana karşı göç.
    1. Oluşur (v), grafik mesafeler nükleer zarf arıza öncesi dönem için gitti apikal göç hızı (Şekil 4G) belirlemek.
    2. grafik içinde veri serisini seçin, fare sağ tıklayın ve ilgili fonksiyon 'y = mx + c' dahil bir lineer regresyon eğrisini yerleştirin. Işlevinde eğimi 'm' hızı temsil v (Şekil 4G).
    3. Tekrarlayın bazal göç hızı, v b (Şekil 4H) belirlemek için hızlı bazal göç birinci faz için 6.11.1 ve 6.11.2 adımları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 'de şematik olarak tarif edilen prosedüre göre retina izolasyonu hafif zarar görmüş yetişkin Tg'sinden yassılaştırılmış dorsal retinanın kültürlenmesini sağlar [GFAP: nGFP]% 5 CO en az 24 saatlik bir süre boyunca mi2004 zebra balığı 2 / hava ortamı. Bu düz monte retina eksplantlar derin doku seviyelerinde görüntü odak düzlemleri için kullanılabilir. Bir örnek olarak Müller glia / hafif zarar görmüş retinada...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hasarlı yetişkin Zebra balığı retinanın ağırlıklı kullanılan immünositokimyasal yöntemler 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30 yenilenmesini düzenleyen mekanizmaları araştıran çalışmalar. kültür retina eksplantlar koşulları oluşturulması ve bu tür INM olarak fenomenler, canlı hücre görüntüleme gerçekl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

William Archer ve Notre Dame Entegre Görüntüleme Tesisi tarafından sağlanan destek için teşekkür ederiz. Özel teşekkür onların sürekli yardım ve onların bakım ve zebrafish hayvancılık için Freimann Yaşam Bilimleri teknisyenleri yönlendirilir. Bu çalışma DRH için NIH Ulusal Göz Enstitüsü (R01-EY018417, R01-EY024519) ve Zebra balığı Araştırma Merkezi, Notre Dame Üniversitesi, Notre Dame, IN hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dumont forseps #5Dünya hassas aletleri14098
Dumont forseps #5, 45& derece açıDünya hassas aletleri14101
McPherson-Vannas makasDünyası hassas aletler501233
FlorresimlerDünya hassas aletleriFD35-100
StereomikroskopNikon SMZ-1Bbenzer tip diseksiyon stereomikroskobu çalışacak
Biyolojik Güvenlik Kabini sınıfı A2Labconcomuadili tip
doku kültürü inkübatörüTermobilimselHEPA sınıfı 100eşdeğeri tip çalışacak
Sylvania floresan lambalar OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 & mikro; m gözenek boyutu Acrodisc şırınga filtresiVWR4192
10 mL Luer-lok şırıngaVWRBD309604
60 mL Luer-lok şırıngaVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS, Ca2+/Mg2+, fenol kırmızısı olmadan, GibcoThermoScientific14175-095
MEM, fenol kırmızısı olmadan, GibcoThermoScientific5100-038
At serumu, ısıyla etkisiz hale getirilmişThermoScientific26050-070
penisilin/streptomisinVWR16777-164
Ultra saf düşük erime noktalı agarozThermoScientific16520-100
etanol, mutlakThermoScientificBP2818-4
2-fenoksietanolSigma77699
Corning Cell-Tak hücresi ve doku yapıştırıcısı VWR354240
kırılma indisi sıvısı Cargille Lab1803Y
Nikon A1 multifoton mikroskobuNikoneşdeğer sistemi
çalışacaktır 40X Apo uzun mesafeli suya daldırma objektifi (NA 1.15)
35 mm petrikaplar için ek ile donatılmış çevre odasıOkolabeşdeğer sistemi NIS analiz yazılımı
çalışacakNikon
, tipi, çalışacak, , MaiTai kızılötesi lazer ile donatılmış

Kaynaklar

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnterkinetik Nükleer MigrasyonRetinal Eksplant KültürüZebrafish RetinasıGFAP:nGFP EtiketlemeZ-yığın KazanımıFluoroDish MontajıAgaroz GömmeHız Ölçümü
Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.