Yöntem makalesi

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

DOI:

10.3791/55344

⸱

28 Ocak 2017

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas, besinlerin sindirimi ve kan şekerinin düzenlenmesi için gerekli olan epitel hücrelerinden oluşur. Endotelyal, nöronal ve mezenkimal hücreler dahil olmak üzere pankreas mikroçevresinin hücrelerinin, embriyonik pankreasta hücre farklılaşmasını ve proliferasyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Yetişkinlerde, insülin üreten hücrelerin işlevi ve kütlesinin, perisit, bağışıklık, endotel ve nöronal hücreler dahil olmak üzere mikro çevrelerindeki hücrelere bağlı olduğu gösterilmiştir. Son olarak, pankreas mikroçevresindeki değişikliklerin pankreas tümörigenezini düzenlediği gösterilmiştir. Ancak, bu süreçlerin altında yatan ipuçları tam olarak tanımlanmamıştır. Bu nedenle, pankreas mikroçevresini oluşturan farklı hücre tiplerini karakterize etmek ve gen ekspresyonlarını profillemek, normal ve hastalıklı durumlar altında doku gelişimini ve işlevini tanımlamak için çok önemlidir. Burada, mezenkimal hücrelerin embriyonik, yenidoğan ve yetişkin farelerin pankreasından izole edilmesine izin veren bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, fare pankreas dokusunun enzimatik sindirimini ve ardından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını (FACS) veya etiketli hücrelerin akış-sitometrik analizini kullanır. Hücreler, yüzey belirteçleri için immün boyama veya floresan proteinlerin ekspresyonu ile etiketlenebilir. Hücre izolasyonu, pankreas mezenşiminin hücrelerinde eksprese edilen genlerin ve proteinlerin karakterizasyonunu kolaylaştırabilir. Bu protokol, embriyonik, yenidoğan ve yetişkin fare pankreasından yüksek oranda zenginleştirilmiş mezenkimal hücre popülasyonlarını izole etmede ve kültürlemede başarılı olmuştur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enerji homeostasis ve memelilerde gıda sindirim düzgün pankreas fonksiyonuna bağlıdır. ekzokrin ve endokrin: yetişkin pankreas iki hücre bölümlerinde oluşmaktadır. Üreten ve salgılayan sindirim enzimleri ve gut, bu enzimleri taşıma kanalı hücreleri, toplam pankreas kütlesinin 1% 80'den fazlasını kapsayacak asiner hücreleri de dahil olmak üzere dış salgı hücreleri. Insülin üreten beta hücrelerini ve glukagon üreten alfa hücreleri bulunur endokrin hücreleri, ekzokrin dokusunda gömülü ve kan şekeri düzeylerini 2 düzenleyen hormonlar salgılar vardır Langerhans adacıkları düzenlenmektedir.

Pankreas hücreleri yüksek regüle, çok aşamalı süreç 3 aracılığıyla farklılaşmış kaderini kazanır. Kanıt nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler tarafından sağlanan dış ipuçları t pankreatik hücre farklılaşması ve çoğalması yol olduğunu göstermektedirEmbriyonun 3, 4, 5. Bir örnek erken pankreas öncüleri 6 özellikleri için aort gerekliliktir. Daha sonra bir gelişme olarak, endotel hücreleri, hem de pankreas salgı ve ekzokrin hücreleri gelişiminde önemli bir rol oynar ve beta hücre farklılaşması, 4, 6, 7 teşvik ettikleri gösterilmiştir. Mezenkimal hücreler esas büyüme faktörü FGF10 8, 9 salgılanması yoluyla, hayatta kalma ve ortak pankreas atalarıdır genişlemesini desteklemek gösterilmiştir. Biz ayrıca, bu hücreler, embriyonik pankreas 5 endokrin ve ekzokrin öncülerinin proliferasyonunu, hem de bir (asinar ve beta hücreleri dahil) farklılaşmış hücreleri destek göstermiştir. Son zamanlarda, mezenkimal hücreler, daha vardıendokrin hücreleri farklılaşmasını 10 düzenleyen gösterilmiştir.

Yetişkinde, beta hücresi işlevi ve kütle bağışıklık nöronal, ve endotelyal hücreler gibi perisitlerin 11, 12, 13 dahil olmak üzere, mikro-hücre bağlıdır gösterildi. Yaralanma sırasında endotel hücreleri beta hücresi çoğalmasını 13 desteklemek için pankreas bağışıklık hücreleri iyileştirme gösterildi. Endotel hücreleri daha insülin ekspresyonu ve beta hücresi fonksiyonunu 14 desteklemek için hücre dışı matris (ECM) bileşenleri üretmek için gösterildi. Biz son zamanlarda beta hücre fonksiyonu 11 adacık perisitlerin gereksinimi gösterdi. Son olarak, pankreas stroma hücreleri, pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) 15, 16 ve ilerlemesini düzenleyen gösterildi. Bununla birlikte, kimlikPankreas geliştirme, fonksiyon ve tümörogenez rehberlik dışsal ipuçlarını işletmenin büyük ölçüde bilinmemektedir.

pankreas mikro-hücreleri tarafından sağlanan ipuçları belirlenmesi, bu hücreler tarafından ifade edilen genleri ve proteinleri karakterize gerektirir. Bu ve / veya hücre hatları kurma gen ekspresyonunu ve proteomik analizlerini gerçekleştirmek için pankreastan bu hücrelerin izole edilmesi bağlıdır. Burada, floresan proteinleri ifade immunofluorescently-işaretli hücrelerin veya hücre ya sıralama doku, enzimatik sindirim ve floresans ile aktive edilmiş hücre (FACS) kullanılarak pankreas mikro mezenşimsel hücrelerde izole etmek için bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, başarılı bir şekilde, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas 5, 17, mezenkimal hücreler izole ve sarı floresan protein (YFP) -expressing analiz gerçekleştirilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneyler Tel Aviv Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir.

Fare gelen Pankreas Doku 1. İzolasyonu

  1. Yetişkin fareler için:
    1. 0.4 mg / ml kollajenaz P ve 0.1 ng / I Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözüldü ml DNaz: sindirim tamponu hazırlayın. Taze 15 ml konik tüpler fare başına tampon 5 ml hazırlamak ve kullanılana kadar buz üzerinde saklayın.
    2. kurumsal kılavuzuna göre fareler Euthanize.
    3. pankreas kaldırmak için her fare teşrih (öğretim için Reference 18 bakınız); HBSS içeren bir kültür kabı içine koyun. 4 adet - Bir stereomikroskop altında bu aşamada gerçekleştirmek için, ve sindirim etkinliğinin artırılması 2 doku kesmek mümkündür.
    4. (Adım 1.1.1 hazırlandı) sindirim tamponu ihtiva eden bir tüpe pankreas dokusu yerleştirin. Tüm fareler disseke ve pankreas dokuları kadar buz üzerinde tüpler tutuntoplanmış.
    5. Kalan fareler ile 1.1.4 - Tekrar 1.1.2 adımları.
  2. Embriyolar ve neonatal fareler için:
    1. 0.4 mg / ml kollajenaz P ve 0.1 ng / I HBSS içinde eritilmiş ml DNAz: sindirim tamponu hazırlayın. 15 ml konik tüp fare başına tampon 2 ml - doğum sonrası 7. günde (P7) ya da daha genç embriyo ve yavruların için, taze 1,5 hazırlamak. 15 ml konik bir tüp içinde, fare başına 4 ml tampon - P7 veya daha büyük yavrular için, 3 hazırlayın. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin.
    2. kurumsal kılavuzuna göre fareler Euthanize. embriyolar için, annelerinin rahmine tüm embriyolar kaldırmak ve PBS içeren 10 mm'lik kültür kaplarına koyun. her seferinde bir embriyo teşrih.
    3. başını uzak araştırmacı dan bakacak, sırtında fare yatıyordu. Ince forseps kullanarak, fare diyafram 18 kadar karın boşluğuna maruz orta hatta karın cildi ve açık yukarı çekin.
    4. Ince forseps kullanarak, karaciğer fr ayırmakarka karın duvarı om. Fare kuyruğu doğru sürekli bir hareket ile, (karaciğer, mide, dalak, bağırsaklar, böbrek ve pankreas dahil) iç organları dışarı kepçe ve HBSS içeren bir kültür tabağına yerleştirin.
    5. Bir stereomikroskop altında, karaciğer ve pankreası maruz böbrekleri (Şekil 1) çıkartın. Ince forseps kullanarak, dalak, nihayet mide, duodenum gelen pankreas ayırmak ve.
    6. (Adım 1.2.1 hazırlandı) sindirim tamponu ihtiva eden bir tüpe pankreas dokusu yerleştirin. p14 veya daha büyük yavrular için, sindirim verimliliği artırmak için 2 adet doku kesmek. Tüm fareler disseke ve pankreas dokuları toplanana kadar buz üzerinde tüpler tutun.
    7. Kalan fareler ile 1.2.6 - Tekrar 1.2.2 adımları.

2. Pankreas Sindirim

  1. agitat ile 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir ısıtma bloğu (sindirim tamponu içinde) pankreas dokusu ihtiva eden tüpler inkübe700 rpm'de ve iyon. 15 dakika sonra, elle onları 3 ters çevrilerek tüpleri sallamak - 4 kez ve geri ısıtma bloğu koyun.
    Ajitasyon yetenekleri olmayan bir ısıtma bloğu kullanıyorsanız, boruları her 5 ters - 10 dk: NOT. Doku düzgün sindirilir olduğundan emin olun. Değilse, inkübasyondan önce küçük parçalar halinde doku kesme ya da ajitasyon artar.
  2. Doku sindirim durdurmak buz üzerinde tüpler yerleştirin ve her tüpe soğuk HBSS 10 ml ekleyin. 4 ° C'de tüpler santrifüj ve 5 dakika boyunca 300 x g ve süpernatan aspire.
  3. Yeniden süspansiyon:
    1. Yetişkin fare ve P14 veya daha büyük yavrular için, PBS 6 mL pelet yeniden askıya ve yeni bir 15 mL konik toplama polipropilen tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgecinden geçirin. maksimal hücre iyileşme sağlamak için, PBS ilave 6 ml orijinal tüp yıkayın ve toplama tüpüne hücre süzgecinden süzün.
    2. Embriyolar ve yavrular genç tHan P14, 2 mL PBS ile pelet yeniden askıya ve 5 mL'lik yuvarlak dipli bir polistiren toplama tüpü (FACS tüpü) üstüne yerleştirilmiş bir 35 mikron hücre süzgecinden geçirin. Maksimal hücre iyileşme sağlamak için, PBS ek olarak 2 mL orijinal tüp yıkama, toplama tüpünün üzerine hücre süzgecinden geçirin.
  4. 4 ° C'de tüpler santrifüj ve 5 dakika boyunca 300 x g ve süpernatan aspire. Hücreler gevşek polistiren tüpüne bağlı olarak, dikkatli bir şekilde sıvı çıkarın.

3. Tek Hücreleri Etiketli Hazırlanması

  1. Tampon hazırlanması: FACS hücre izolasyonu için,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mM EDTA (kalsiyum klorür ve magnezyum klorür) olmadan PBS karıştırılarak tampon sıralama hazırlar. Akışkan sitometri analizi için,% 0.05 sodyum azid ile ayırma tamponu ilave ile analiz tamponu hazırlayın. Her iki tampon maddesi en fazla 2 ay boyunca 4-8 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. sıralama veya Ana hücrelerin yeniden askıyaliziz tamponu. P8 ve 1.5 mL eski bir ay arasında yavrularından embriyolar ve 1 mL P7 daha genç yavruların izole her pankreas, yeniden askıya ve 3 mL bir ay farelerden daha büyük. Yuvarlak dipli bir polistiren tüp (FACS tüpü) üstüne yerleştirilmiş bir 35 mikron hücre süzgecinden hücreleri süzün.
  3. kontrolleri boyanması için, önceki adımda (toplam örnek hacmi en fazla% 5) yapılan örneklerden 100 mcL alikotları için 50- çıkar ve yeni FACS tüpler içine yerleştirin; DAPI floresan proteinleri de dahil olmak üzere, kullanılan her bir fluorofor için bir tüp, ve aynı zamanda bir lekesiz kontrolü bulunmaktadır.
    Not: bir flüoresan proteini eksprese eden hücrelerle transgenik fareler kullanılarak, hücre sayısı sınırlı olduğunda, ya da bir boyama kontrol olarak transgenik olmayan bir doku içerir. Bir floresan proteini eksprese eden hücreler bundan başka boyama kullanıldı ise, 3.8 adım geçin.
  4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı Spin ve süpernatant aspire.
  5. bloğunKing, (keçi IgG 1 uL ile takviye sıralama 100 uL veya analiz tamponu) bloke etme çözeltisi ile hücrelerin yeniden askıya alma ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir.
  6. hücre yüzeyi işaretçileri leke için, numune başına 100 uL bir hacimde, istenen tüm florofor-konjuge antikor içeren bir karışımın hazırlanması. Ayırma veya analiz tamponu içinde 2x antikor dilüe (yani, çift gerekli konsantrasyon elde etmek için bir antikor seyreltilmiş 1; nihai seyreltme: 100: 200 istenirse, antikor 1 seyreltilmiş). Engelleme solüsyonun olmadan, 200 uL nihai boyama hacmi elde etmek örnek hücreleri karışımın 100 uL ilave edin. Buz üzerinde 30-60 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
  7. tek (boyama kontrolü) kullanılan antikorların içeren ek tüpler hazırlamak, analiz veya sıralama parametreleri (adımlarını 4.3 ve 5.2) ayarlamak için kullanılır. (Adım 3.6 açıklandığı gibi) sıralama veya analiz tamponu 2x antikor dilüsyonları hazırlayın. Yap si eklemeyi unutmayınkullanılan her florofor, hem de lekelenmemiş kontrol ngle boyama kontrol seyreltme. Engelleme solüsyonun olmadan, 200 uL nihai boyama hacmi elde etmek (adım 3.3 hazırlandı) hücrelere antikor karışımı, 100 uL ilave edin. Buz üzerinde ve karanlıkta 60 dakika - 30 inkübe edin.
  8. analizi ile her tüp doldurma ya da 4 ml'lik bir maksimum hacme kadar tampon sıralayarak yıkayın. (Adım 3.2 de tarif edildiği gibi), isteğe bağlı olarak, 35 mikron hücre süzgecinden hücreleri yeniden süzün.
  9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve dikkatli bir şekilde supernatant çıkarın.
  10. analiz veya tampon sıralama örnekleri yeniden askıya. 2 mL eski 3 ay ve 3 3 ay ml daha eski farelerden alınan - 1, 1 mL bir ay daha genç yavruların, 500 uL embriyoların izole hücrelerin yeniden askıya. Boyama kontrol tampon maddesi 300 uL içinde yeniden süspanse edilebilir.
  11. 200 ng ekle / DAPI mL ölü hücreleri tanımlamak için hücreler yeniden askıya için. Make a tüp co eklemeyi unutmayınsitometresinin ayarları için DAPI olmadan lekesiz hücreleri ntaining. hücre sıralama (aşama 4) ya da analiz (aşama 5) 'e geçin.

4. Hücre Ayırma

  1. hazırlıklar:
    1. RNase ile RNA ekstre önce, kaplama bir 1.5 ml toplama tüpü hücre sıralama için önleyicisi hemen sıralamadan önce. Bu amaçla steril bir 1.5 ml toplama tüpüne, 0.01 U / ml RNaz inhibitörü içeren tampon sıralama 1 ml. 5 dakika sonra, tüp vorteks ve sıvıyı ayırın.
    2. Hücre kültürü önce hücre sıralama için, steril bir kültür ortamının 3 ml ilave edilir, steril bir 15 ml toplama tüpüne (Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM)% 20 FBS,% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş, ve penisilin-streptomisin,% 1) .
  2. FACS sıralayıcı içine bir tüp yüklemeden önce, girdap kısaca hücrelerin yeniden askıya. Buz üzerinde kalan tüpler tutun.
  3. (Örn sıralama parametreleri belirlemek için boyama kontrolleri analiz ederek başlayın, Gerilim ve telafisi) ve sıralama kapıları (örneğin, toplam hücre popülasyonu, canlı DAPI-negatif hücreler ve hücre popülasyonları) sıralanacak.
  4. sıralama parametreleri ve kapıları yukarı ayarlandıktan sonra, örnekler yüklemek ve toplama tüpleri içine sıralama hücreyi başlatın.
    NOT: Sıralama koşulları alet üzerinde son derece bağlıdır. Bu 100 um meme genişlik, 23.1 psi'lik bir basınç ve 5 maksimum ayırma hızı kullanır.
  5. RNA ekstraksiyonu veya sıralanmış hücrelerin kültürlenmesi geçin.
    Not: RNA ekstraksiyonu için, 5 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüj hücreleri ve standart bir ekstraksiyon protokolü ile devam etmeden önce, fazla sıvının çıkması. Hücreler, steril olmayan koşullarda kriteri eğer, hücrelerin kültürlenmesi için, kültür ortamı ile tüp doldurma ve kirlenmeyi en aza indirmek için kültür önceki 7 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj bunu iki kez yıkayın.

Akış Sitometrisi ile 5. Hücre Analizi

  1. l öncesitometre girdabına her tüp oading kısaca hücrelerin yeniden askıya. Buz üzerinde kalan tüpler tutun.
  2. Analiz parametrelerini (örneğin, gerilim ve telafisi) belirlemek amacıyla lekesiz ve tek boyanmış numunelerin analiz ederek başlayın.
  3. analiz parametreleri ayarlandıktan sonra, boyama kontrolü de dahil olmak üzere her örnek yüklemek ve sonuçları kaydedin. analiz yazılımı flow sitometri kullanılarak elde edilen sonuçlar analiz edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas mezenşimin gelişimi ve yetişkinlik döneminde gereklidir. Burada anlatılan yöntemi embriyonik, yenidoğan ve yetişkin pankreastan mezenkimal hücrelerin izolasyonu sağlar. Mezenkimal hücreler, ancak başka bir hücre tipi, Nkx3.2 -Cre pankreaslarında sarı floresan protein (YFP) ifade; R26R -YFP fareleri 5, 11, 17, 19. Gelişimi sırasında, (aynı zamanda BapX1 olarak da bilinir) Nkx3.2 embriyonik pankreas, mide ve bağırsak mezenşimin, hem de iskelet somitlerinden 19, 20, 21 bir alt kümesi ile ifade edilir. Bu gen, E9.5 5'ten Nkx3.2 -Cre kontrolü altında gen ekspresyonunu sağlayan, E11.5 kadar E9.5 pankreatik mezenşimin ifade edildi 19, 20. Bu etiketleme göre, hücreler, akış sitometrik kullanarak toplu pankreas dokusundan saflaştırılabilir. Şekil 2, burada açıklandığı gibi izole edilmiş, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas dokularından tek hücreler bir akış sitometri analizini göstermektedir. Transgenik olmayan pankreas dokuları floresan hücreleri içermiyordu Oysa, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP tüm analiz yaştan pankreas dokusu ayrı bir YFP etiketli hücre popülasyonu (; kapıları ile işaretlenmiş Şekil 2) içerir.

Burada tarif edilen yöntem izlenerek, floresan proteinleri ifade eden hücreler, saflaştırılmış ya da ya da fazla immün olmaksızın akış sitometrisi ile analiz olabilir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, örneğin, floresan etiketleme göre sıralama sonra, mezenkimal hücreler, (en az beş geçişleri için) hücre hattı oluşturmak için kültürlenebilir. Not t O mezenkimal hücreler tipik kültürlü hücrelerin morfolojisi fibrocytic. Buna ek olarak, bu sistem kriteri hücrelerin gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. Bu amaçla, RNA, cDNA sentezlemek için kriteri mezenkimal hücrelerden ekstre edildi, ve gen ekspresyon düzeyleri, QPCR kullanılarak analiz edilmiştir. Böyle bir analiz sıralı hücrelerin pan-mezenkimal işaretleyici vimentin (Şekil 3B) ifade ortaya koymuştur. Son olarak, pankreas hücrelerinin yüzey markör ifade akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Örneğin, Nkx3.2 -Cre pankreas dokusundan izole edilen hücreler; R26R -YFP burada açıklanan ve fibroblastların 22 ile ifade olduğu bildirilmiştir CD9 glikoproteini hücre yüzeyi, ile boyanmış yöntemi kullanılarak yetişkin fareler. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, tüm Nkx3.2 -Cre hücreler floresan etiketli; R26R -YFP pankreas BS9 ifade eder.

tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/>
Şekil 1: Embriyonik ve yenidoğan pankreas dokusu. Bir E15.5 embriyo (A) ve P4 pup (B), mide, dalak, bağırsak ve pankreas da dahil olmak üzere izole bütün mide-bağırsak sistemi,. pankreas dokusu mavi çizgi ile çizilmiş olan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-1
Şekil 2: Mezenkimal hücreler floresan Nkx3.2 -Cre etiketlenmiştir; R26R -YFP pankreas dokusudur. Transgenik olmayan (paneller sol) ve Nkx3.2 -Cre izole pankreas hücrelerinin akış sitometri analizi; R26R -YFP çeşitli yaşlarda transgenik (sağ paneller) fareler: embriyonik (A), neonatal (B), ve reklamULT (C). Hücreler, yan dağılım (y-ekseni) ve sarı floresan (x-ekseni) için analiz edilmiştir. ( "D" işaretli) Kapı transjenik olmayan kontrol transjenik farelerde bir YFP + hücre popülasyonunun varlığı değil göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3: İzole pankreas hücrelerinin Analizleri. Nkx3.2 -Cre pankreas dokusundan kriteri (A) hücreleri; R26R -YFP (Şekil 2B'de tarif edildiği gibi), neonatal farelerde hücre hattı oluşturmak için kültürlendi. (; Sağ ve sol paneller yeşil) ve faz kontrast kültürlü hücreler floresan görüntülendi (gri; sağ panel). (B) Vimentin1 (Vim1) gösteren Bar şemasıNkx3.2 -Cre pankreas dokusundan YFP + -sorted hücreler tarafından ifade seviyeleri; Sıralanmamış pankreas dokusu (siyah) ile karşılaştırıldığında, R26R -YFP yetişkin fare (yeşil Şekil 1C'de tarif edildiği gibi). RNA ekstre edildi ve gen ekspresyonu qPCR ile analiz edilmiştir; ifadesi siklofiline normalize edildi. K = 4 *** p <0.001. Veriler ± SD ortalamasını temsil etmektedir. (C) Nkx3.2 -Cre dağılmış pankreas hücrelerinin akış sitometri analizi; R26R -YFP yetişkin farenin bağışıklık lekeli allofikosiyanin (APC), anti-CD9 antikoru ile konjüge edilmiş ve APC (y-ekseni) ve sarı floresan (x-ekseni) için analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biz izole etmek ve pankreas mikroçevresinin hücreleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, embriyonik ve yetişkin pankreas dokusundan mezenkimal hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde yetişkin ve yeni doğan pankreas 5, 17 endotel hücreleri izole etmek için bu protokolü kullanılmıştır. Bununla birlikte, (alternatif protokoller 24 Kaynaklar 18, 23 tarif edilen ve edilmiştir) pankreas epitel hücreleri tekrar üretilebilir bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için uygun olmayabilir. Bu yöntem, floresan etiketli hücreler kullanılarak ya floresan proteinleri ifade eden ya da yüzey belirteçleri için boyanmış, FACS ile saflaştınldı ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA gen sentezleme modelini profil saflaştırılmış hücrelerinden elde edilebilir. Alternatif olarak, saflaştırılmış hücreler, daha sonra proteomik analizi için bir hücre çizgisi oluşturmak için kültürlenebilir. Bu yöntem, faktör D karakterizasyonu sağlayacaktıronun organogenesis, fizyoloji ve patofizyolojisi yöneten pankreas mikro-tarafından xpressed.

Pankreatik mezenşimin öncüleri ve farklı hücreler 5, 9 çoğalmasını teşvik doku organogenez destekler. Bu hücreler, insan embriyonik kök hücre büyümesini desteklemek gösterilmiştir (hESC) pankreas atalarıdır 17, 25, 26 -türevlenmiş. Bu nedenle, embriyonik mezenşimal faktörleri kimliğini belirleyen HESC ve diyabet için potansiyel bir tedavi olarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) insülin üreten beta hücrelerinin üretilmesi için mevcut çabalar kolaylaştıracaktır. Fare genetik çalışmalar pankreas gelişiminin erken evrelerinde pankreas epitel genişleme teşvik etmek mezenşimin tarafından üretilen gibi FGF10 gibi büyüme faktörleri, tanımlanmasını izin3, 9. Embriyonik mezenşimin ifade ek faktörlerin belirlenmesi amacıyla, biz, lazer yakalanan mikrodiseksiyon kullanarak bu hücrelerin izole onların RNA ayıklanır ve gen ifadesi analizi 26 seslendirdi. Bununla birlikte, emek-yoğun bir olmanın yanı sıra, bu yöntem, önceden çevre mezenşim (yani, E12.5) içerisine epitel dallanma gelişim aşamalarına kullanımını kısıtlar morfolojik özellikleri, temel hücrelerin belirlenmesi dayanır. Daha sonra gelişim aşamalarında mezenkimal hücreler karakterize etmek için, biz burada 5, 17 açıklanan yöntemi kullanılmıştır.

Biz yenidoğan pankreas mezenşimin 5 yüzey işaretleyici ifade analiz etmek için bu yöntem kullanılır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler, Nkx3.2 -Cre embriyonik ve neonatal pankreas dokusundan izole edilmiştir; R26-EYFP fareler görefluoresan bu fare hattı etiketleme ve hücre çizgileri 17 kurmak için kültürlendi. HESC türetilen pankreas progenitörlerin 17 desteklemek için yeteneği ile pankreas mezenşimin salgılanan faktörlerin tanımlanması için izin verilen bu hücrelerin proteomik analizi. Biz daha RNA ekstraksiyon ve gen ekspresyon analizi 17 yetişkin pankreas dokulardan mezenkimal hücreler arındırmak için bu hücre izolasyon yöntemi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu yöntem, pankreatik hücre gelişimini desteklemek için yeteneği, pankreas mezenşim ile ifade edilen genleri ve proteinleri tanımlamak için kullanılabilir.

Pankreas mezenkimal hücreler daha pankreas tümörü oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir. PDAC fibroblastlar, bağışıklık hücreleri içeren bir fibroblast zengin desmoplastik stroma oluşumu ve ECM 27 ile karakterize edilir. Stroma çok gelişmesini teşvik etmek düşünce ikenkanser türleri, o PDAC ilerlemesini 15, 16, 28 sınırlamaya gösterilmiştir. Bu pankreas stroma bileşenleri tümörogenez inhibe eden faktörleri salgılar düşündürmektedir. Ayrıca, stroma hücre bileşimin hem de hücre fenotipinde bir değişiklik epitel hücreleri 15, 16, 28 üzerindeki etkisinin altında olabilir. Burada tarif edilen yöntem, bu nedenle, sağlıklı pankreas dokusu ile karşılaştırıldığında PDAC stroma oluşturan farklı hücre tipleri karakterize yardımcı olabilir. Bundan başka, farklı bir stromal hücre tiplerinin saflaştırma PDAC ilerlemesi sırasında gen ekspresyon profillerinin potansiyel karakterize etmek izin verir. Ancak, tümörogenez 27 sırasında pankreas ECM bileşimindeki değişikliklere, bu tür addit dahil olarak doku sindirim parametrelerinin ayarlamaları,uğratarak kollajenaz tip ya da kuluçka süresini arttırmak gerekli olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik yardım için Adi Sasson'a ve el yazmasının eleştirel okuması için Helen Guez'e teşekkür eder. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi'nin 336204 no'lu hibesini başlatarak desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajenaz PRoche11213865001
DNaseSigma-AldrichD5025-15KUEtkili birimler en az 2.000 unitz/mL protein
olmalıdır. Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS)Sigma-AldrichH6648
Fetal Sığır Serumu (FBS)Biyolojik Endüstriler04-127-1A
EDTABiyolojik Endüstriler01-862-1A
Sodyum AzidSigma-AldrichS2002
Keçi IgG serumuSigma-AldrichG9023
DAPISigma-AldrichD9542
RNAse inhibitörüInvitrogenN8080119
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)İnvitrojen
03-020-1B
Penisilin-streptomisinBiyolojik Endüstrileri03-031-1B
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Sigma-AldrichD8537Kalsiyum Klorür ve Magnezyum Klorür İçermez
1.5 mL tüplerSarstedt72 690
15 mL konik tüpCorning430052
Yuvarlak Alt Polistiren 5 mL tüpCorning352008FACS tüpü. Tüpün kullanılacak akış simülatörü ile uyumlu olduğundan emin olun, çünkü 5
mL'lik 35 mL'lik tüp markaları arasında gerekli tüplerde küçük farklılıklar vardır; m hücreli süzgeç Snap CapCorning352235FACS tüp
70 & mu; M hücre süzgeci Miltenyi Biotec130-098-462
Çalkalama ile ısıtma bloğu EppendorfThermoMixer C
SantrifüjThermoFisherHeraeus Megafuge 40R
SteromikroskopNikonSMZ 745
Hücre sıralayıcıBD BiosciencesFACSAria IIu
akış sitometresiBeckman CoulterGallios 
L-Glutamin Biyolojik Endüstrileri 11965092

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
  2. Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  3. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).
  4. Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. , 1-8 (2012).
  5. Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), e1001143(2011).
  6. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  7. Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).
  8. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
  9. Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).
  10. Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).
  11. Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).
  12. Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).
  13. Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).
  14. Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).
  15. Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  16. Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  17. Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562(2016).
  18. Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514(2013).
  19. Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).
  20. Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).
  21. Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).
  22. Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).
  23. Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9 (5), 95486(2014).
  24. Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).
  25. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  26. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  27. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  28. Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre zolasyonuDoku SindirimiFloresan ProteinlerY zey MarkerlarRNA EkstraksiyonuH cre Ay klamaMezenkimal H crelerPankreas Dokusu

İlgili makaleler