Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Summary

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Abstract

Bağışıklık synapse T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) arasındaki iletişimi alanıdır. T hücre yüzey reseptörlerinin ve proteinler istikrarlı bir bağlama temin ve Satım sinyal için bağışıklık synapse doğru kutuplaştırmaya. Klasik confocal, TIRF veya Süper çözünürlük mikroskobu bağışıklık synapse eğitim için kullanılmıştır. El ile resim alma ve zaman alıcı miktar bu yöntemler gerektiren bu yana, nadir olayları görüntüleme meydan okuyor. Burada, on binlerce hücre morfolojik analiz sağlayan bir iş akışı açıklanmaktadır. Bağışıklık sinapslarda pan-lökosit müstahzarları birincil insan T hücreleri ve Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-yüklü Raji hücreleri arasında ZPT indüklenen vardır. Resim alma akış sitometresi özelliklerini barındıran bir akış sitometresi ve floresan mikroskop akış denetimli mikroskobu olarak da bilinir, Imaging ile gerçekleştirilir. T hücre/APC çiftler belirlenmesi ve bağışıklık sinapslarda analiz tam bir perdeleme strateji sağlanır. Bu iş akışı bağışıklık Analizi synapses unpurified pan-lökosit hazırlıkları ve dolayısıyla kan sadece küçük bir birim gerektiriyor verdiğinden (yani, 1 mL), Bu hastalardan örnekleri için uygulanabilir. Önemlisi, çeşitli örnekleri hazır, ölçülebilir ve buna paralel olarak analiz.

Introduction

T hücreleri edinilmiş bağışıklık sisteminin ana düzenleyiciler edilir ve MHC kompleksi (MHC) kapsamında sunulan antijenik peptidler aracılığıyla etkinleştirilir. Tam T Hücre aktivasyonu gerektirir iki sinyal, antijen spesifik T-hücre reseptör (TCR) üzerinden yetkinlik sinyal / CD3 kompleksi ve costimulatory sinyal aksesuar reseptörleri üzerinden. Her iki sinyali antijen sunma ile T hücrelerinin etkileşimi doğrudan aracılığıyla oluşturulan hücreler (ZPT). Olgun ZPT yetkinlik sinyal MHC-peptid kompleksi ile T Hücre aktivasyonu için sağlamak ve costimulatory ligandlar express (örneğin, CD80 veya CD86) T-hücre harekete geçirmek¹ilerlemesin....

Protocol

1. Pan-lökosit hazırlanması

1. 1 mL periferik kan heparinized bir şırıngada bir sağlıklı donör (veya hasta) çizin. Kan bağışı için sorumlu Etik Komitesi tarafından onay emin olun.
2. İnsan periferik Mix 1 mL 30 mL ACK lizis arabellek (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃ve 0,1 mM EDTA, pH 7,0) 50 mL tüp ile kan ve oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya.
3. PBS ve 6 dk. aspiratı süpernatant 300 x g , santrifüj tüpleri doldurun ve Pelet ACK lizis arabellek 30 mL resuspend.
4. Süpernatant temiz 1.2 ve 1.3 tamamlayana dek. Son olarak, PBS, oda sıcaklığında 6 min için 300 x g , santrifüj hücrelerde yıkama ve hücre Pele....

Results

Protein zenginleştirme miktar önemli hedefidir burada açıklanan yöntemi (örneğin, F-aktin) arasında bağışıklık synapse içinde ZPT (Raji hücreleri) ve T hücrelerinin unpurified pan-lökosit düşük hacimli (1 mL) insan kanı örnekleri alınan vekil. Ekran görüntüsü Şekil 1 ' deki kritik gating strateji bu yöntemin genel bir bakış verir. Sol ve sağ (Şekil 1) analiz alanı resim galerisi gösterir. Resim galerisi "Odak" kapıyı gösterir. Görülen başlıca gra.......

Discussion

Burada sunulan iş akışı insan T hücreleri (ex vivo) ve ZPT arasında bağışıklık sinapslarda miktar sağlar. Özellikle, eritrosit lysed pan-lökosit T hücreli arıtma adımları gereksiz yapma T-hücre kaynağı olarak kullanıldı. B hücreli lenfoma hücre kültürünü Raji ZPT vekil olarak görev yaptı. Kan bağış bağışıklık synapse T hücreli tarafı arasında karşılaştırma yapmayı sağlar beri bu önemli avantajları, ayılar. Ayrıca, otolog DCs doğrudan periferik kan grubundan pek mevcuttur. Dendritik hücreler (moDCs) monosit kaynaklı üreti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Polistiren Yuvarlak Alt Boru	Şahin	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Sigma	D8662
Sığır Serumu Albümin	Roth	# 8076.3
Saponin	Sigma	S7900
Paraformaldehit	Sigma Aldrich	# 16005
FACS Yıkama Saponin		PBS% 1 BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Hız Boncuk	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA İşleri	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	# 650101	96U
Enterotoksin SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Moleküler Problar	A22287	1:150
IS100	Amnis		Görüntüleme akış sitometresi
IDEAS	Amnis		Yazılımı
INSPIRE	Amnis		Yazılımı