Yöntem makalesi

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

9.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55364

⸱

13 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences & Iowa Center for Advanced Neurotoxicology, Iowa State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Özet

Mikroglia merkezi sinir sistemi sıvı ataklarında birincil yanıt olarak; Ancak çok nöro-inflamasyonu düzenleyen rolleri hakkında bilinmiyor. Mikroglia inflamatuar stresi ölçme makrofajlar benzer şekilde işlev mezodermal hücrelerdir. Klasik (M1-tipi) ve alternatif (M2-tipi) makrofajlar aktivasyonlar da daha iyi bu fenotipleri böyle Parkinson, Alzheimer ve Huntington Hastalıkları gibi nöro koşullarda sahip altta yatan etkileşimi anlamak için bir çaba mikroglia uzatılmıştır. In vitro deney in vivo ortama uzatılabilir hızlı ve güvenilir sonuçlar birincil mikroglia sunmaktadır kullanılarak. Bu sorun olmuştur uygun saflıkta yeterli verimler elde ederken mikroglia izole in vivo deney üzerinde açık bir avantaj olmasına rağmen. Şu anda kullanımda olan Sık kullanılan yöntemler ya düşük kurtarma, düşük saflık veya her ikisi muzdarip. Bu yazıda, demlenmeyesürenin yarısı miktarda yüksek hücre kurtarma ve gelişmiş saflıkta elde kolonsuz CD11 manyetik ayırma yönteminin bir arıtma onstrate. Biz nöro-inflamasyonu ve nörodejenerasyonu okuyan amacıyla ana mikroglial izolasyonun son derece yararlı bir model olarak bu duruma getirilmiş yöntem önerilmektedir.

Giriş

Mikroglia c-kit + / CD45- ayırt mezodermal kökenli myb bağımsız yerleşik makrofajlar yolk kesesi 1, 2, kan Adaları progenitörleri erythromyeloid bulunmaktadır. Embriyolojik mikroglia merkezi sinir sistemini (CNS) kolonileştiklerinde, bir dallanmış formda 3'e bir amoeboid geçiş. Dinamik yansımaları potansiyel hakaretler 4 için sağlıklı beyin parankimi soruşturma beri Bunlar yetişkin mikroglia surveillant olarak sınıflandırılır. Mikroglia sadece MSS hücre nüfusunun yaklaşık% 10'una katkıda rağmen, kendi aralarında döşemek için yetenekleri parankimindeki 4, 5 maksimal tarama sağlar. Örneğin α-sinüklein 6, 7 ve amiloid-P 8 ya da p tehlikesi ile bağlantılı moleküler yapılar (DAMPS),lipopolisakarid (LPS) ile 9 olarak athogen ilişkili moleküler yapılar (PAMP), klasik amoeboid etkin duruma reversiyon ve nitrik oksit üretimi, tümör nekroz faktörü-α (TNFa), interlökin 1β ile vasıflandırılan enflamatuar bir tepki teşvik etmek mikroglia aktive (IL-1β), IL-6, IL-12 ve kemokin CC motifi ligandı 2 9, 10, 11. Patojenik α-sinüklein birikmiş olan Parkinson hastalığı gibi nöro koşullarında, bir nörodejeneratif döngüsü ayrıca mikroglia 7 klasik aktivasyonunu teşvik, daha birleşik α-sinükleinin serbest dopaminerjik nöronların ölümden oluşturulur. periferal makrofajlar benzer şekilde, mikroglia da alternatif olarak, anti-enflamatuar sitokinlerin IL-4 ve IL-10 varlığında aktive etme yeteneğine sahip onları etkili verecek şekilde olabiliriltihap 2, 11 sinir tamirinin geliştirilmesi ve hafifletme ial. Kenara CNS'de immünolojik rolleri, mikroglia gelişim sırasında sinaps budama nöronal devrenin hayati düzenleyicileri olarak tarif edilmiştir. Örneğin, Cx3cr1- KO fareleri, daha az yoğun mikroglia ve dendritik dikenler, olgunlaşmamış sinaps ve gelişmemiş bir CNS 12 elektrofizyolojik desen bir çok artışına neden düşük sinaptik budama sahiptir. CNS homeostazında bu fizyolojik karmaşıklığını ve mikroglia farklı işlevsel roller anlama nörodejeneratif bozuklukların hedefleyen terapötikler araştırılmasında için çok önemlidir.

Nöroimmünoloji alanında, in vitro deneyler için mekanik çalışmalar için daha fizibilite yüksek ölçüde istenebilecektir, düşük bakım maliyeti, daha az zaman ve emek-yoğun olduğu için. Furthermoyeniden hücre popülasyonlarının izole edilmesi yeteneği öngörülen koşullar altında, bu hedef hücrelerin işlevini tarif etmek önemlidir. Çok sayıda mikrogliyal izolasyon yöntemleri mevcuttur, ancak bunlar geniş bir deney 13, 14, 15 için nispeten yüksek bir sayı ve saflık elde etme kabiliyetleri ile sınırlıdır. Örneğin, farklılaşma 11b, bir küme (CD11), monositler, makrofajlar, ve mikroglia 16 ortak bir yüzey markörüdür. CD11b yararlanarak, manyetik ayırma, bir yöntem, ilk olarak neonatal beyin 17 başına bir sütun tabanlı vermiştir yaklaşım ~% 99.5 saflık ve ~ 1.6 x 10 6 mikroglia olarak tarif edilmiştir. Laboratuvar son zamanlarda fikoerıtrinle konjüge edilmiş bir monoklonal antikor (PE) CD11b etiketleyerek bir polistiren tüp içinde gerçekleştirilen bir kolonsuz CD11 manyetik ayırma yöntemi 15, geliştirdi. Bir bispesifik secondary antikor PE ve PE ile dekstran kompleksleri. Bir kez bağlanmış, dekstran-kaplı manyetik parçacıklar antikor kompleksinin dekstran ucuna bağlama yapan, tanıtılmaktadır. Son olarak, polistiren tüp mikroglial izolasyonu için bir mıknatıs yerleştirilir. Bu yaklaşım için verim iki ~ neonatal beyin başına ancak ~% 97 saflıkta azaltılması pahasına 3.2 x 10 6 mikroglia.

Burada, hızlı ve rafine kolonsuz CD11 manyetik ayırma protokolü (Şekil 1) göstermektedir. CD 11 b manyetik ayırma kiti fiyatı aynı olduğu için bu iyileştirilmiş yöntem orijinal kolonsuz metodu kadar hala mümkün. tamamlanma süresi, hücre hayatta kalması ve verimi maksimize etmek önemli olabilir yarısında, azaltılır. Özellikle, bu optimize yöntemden elde saflık ~>% 99, laboratuvarımızda 15 tarafından geliştirilen özgün kolonsuz yönteminden elde saflık üzerinde belirgin bir düzelme sağlanır. En önemlisi, CD11-PEIşıktan uzak kuluçkaya ihtiyacını ortadan kaldırarak ve floresan mikroskobu için kırmızı kanalının kullanımına izin veren, kullanılmaz. Son olarak, orijinal CD11b yönteminde olduğu gibi, yüksek verim ve saflıkta bir astrositik fraksiyonu, bu geliştirilmiş bir yöntem ile elde edilir. Astrositler onların homeostatik fonksiyonları patofizyolojisi 18 göre vazgeçilmezdir fikrine yol açan, CNS içinde en çok glial hücrelerdir. Bu glial hücreler, glial kendi soruşturma potansiyel örneklendiren, besin desteği sağlayan, kan-beyin bariyeri oluşturan nörotransmiter homeostazın korunması hasarı, nöro-yanıt glial yara izi oluşturma, öğrenme ve hafıza, ve Nöro gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonlarında önemli bir rol oynar biyoloji 19. Morfoloji ve mikroglia ve astrositlerin işlevselliği konfokal mikroskopi, Western kurutma nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT PCR), G aracılığıyla tespit edilmiştirRiess nitrit deneyi, ve Luminex multipleks sitokin deneyi. Bu protokolü tarafından sağlanan arıtma in vitro deneyler için önemli olan, tüm bunların mıkroglıal veya astrositik saflık, kırmızı kanalın kullanılabilirliği ile floresan mikroskobu geniş uygulamasına ilişkin güveni arttı ve zaman tasarrufu sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

hayvan ve protokol prosedürlerinin kullanılması onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Iowa State Üniversitesinde Komitesi (IACUC) (Ames, IA, ABD) tarafından denetlenen edildi

1. Karışık glial Kültürlerin yetiştirilmesi

  1. 5.5 inç işletim makasla 1- 2 günlük bir yavrular hızlı başını kesmek, ve buz üzerinde bir 50 ml tüp içinde hemen kafaları yerleştirin. Bu decapitation ötenazi modu olduğunu unutmayın.
  2. Laminar hava akımı kaput, kafatası ve 4.5 inç düz mikro sistemleri kesme makasları kullanılarak meningeste küçük bir kesi yapmak. Rostral ucunun (burun) kaudal ucundan kesme başlayın. Kafaları kesilmek suretiyle oluşturulan açıklığı kullanarak derinin altına alın.
    1. Kesme işleminden sonra, yan hemisferlerin bir soyun. Daha sonra, bütün beyin kaldırmak için kıvrık ya da çengel cımbız kullanın.
  3. % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacet içeren yeni bir 50 ml tüp içinde beyin (ler) daldırın37 ° C bir su banyosu içinde 15 dakika boyunca asit (EDTA), yedi. beyin başına tripsin-EDTA 2 mL kullanın.
  4. ekleme ve kaldırma taze büyüme ortamı (% 10 FBS, DMEM / F12,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 sodyum piruvat ve% 1 temel olmayan amino asitler) ile beyin (ler) yıkayın medya. Bu 4x tekrarlayın.
  5. Her beyin için, büyüme ortamı içeren iki T-75 balonları plaka. Bu nedenle, boruya beyin başına büyüme ortamının 2 ml. Bu nedenle, bu T-75 şişe başına büyüme ortamının 8-9 mL homojenize beyin 1 mL'lik bir eşdeğer olacaktır.
  6. En küçüğüne amacıyla, açıklık farklı boyutlarda pipetler ile beyin (ler) öğütülerek homojenize edilir. Beyin dokusu, sonraki pipet geçişi küçülüyor olmadığını görünür olduğunda. Toz haline sonunda, süspansiyon hiçbir görünür topakları, açık olmalıdır.
    1. 25 ml pipet, 5 ml pipet ve daha sonra 10 mL'lik bir pipet ardışık kullanım.
  7. Her homog geçirin70 um'lik bir hücre süzgecinden Venöz beyin süspansiyonu tek bir hücre kültürü dönüştürebilmek için.
  8. (T-75 balonuna başına büyüme ortamının 8-9 mL homojenize beyin 1 mL) adım 1.5 de tarif edildiği gibi, her homojenize beyin için, plaka, iki T-75 şişeler, büyüme ortamını ihtiva eden.
  9. 6 günden sonra büyüme ortamı değiştirin ve 16 inci günde tecrit kadar büyür.

Mikroglial Hücreler 2. İzolasyon

  1. 16 gün sonra, şişeden büyüme ortamını çıkarın ve yeni bir 50 mL tüp içine koyun. Her T-75 balonuna 3 mL,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çalkalama cam deney şişesinin.
    1. Santrifüj çıkarıldı büyüme 5 dakika süre ile 0.4 x g'de ortam ve bir sonraki aşamada tripsin-EDTA, reaksiyonu durdurmak için kullanılır.
  2. 5 dakika çalkalandıktan sonra tripsin-EDTA, reaksiyonu durdurmak için büyüme (taze veya 2.1.1 kullanılan ortam) ortam 4 mL, en az ekleyin.
  3. sağlamak için toz haline getirin hepsi carşın müstakil edilmiştir.
  4. ezildikten sonra, tek bir hücre kültürüne yapmak için bir 70 um'lik bir hücre süzgecinden hücrelere geçme bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve daha sonra 5 dakika süre ile 0.4 x g'de hücreleri aşağı döndürün.
  5. Her 100 x 10 6 hücre (kabaca 15 x T-75 şişeler), hücre topağı tekrar süspansiyon için tavsiye edilen ortam (% 2 FBS, DPBS (kalsiyum ve magnezyum klorür içermeyen), 1 mM EDTA) içinde 1 mL kullanın.
    Not: Aşağıdaki bütün işlemler, bir 1 ml ayrılması için tasarlandı.
  6. Bir 5 ml polistiren tüp al Önerilen Medya 1 mL ekleyin ve menisküs olarak işaretlemek. 2.5 mL kadar Önerilen Medya ekle ve de bu işaretleyin. Önerilen Ortam atın ve 5 ml polistiren tüp yeniden süspansiyon haline hücreleri transferi.
  7. asma hücrelerinin her 1 ml sıçan serumu, 50 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  8. bileşen A'nın 25 uL ve bileşen B için 25 uL Bu bileşenler özel olarak karıştırılarak seçimi kokteyli hazırlanır.
  9. 50 ekle1 'dir; hücreleri seçim kokteyl L. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
    NOT: daha saf kültürler için tekrarlayın adım 2.9 (önerilir, ancak zorunlu değil).
  10. 45 saniye boyunca Girdap mıkrokürecikler. örnek 1 mL başına mikrosferler 80 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın.
  11. Önerilen Ortam eklenerek polistiren tüpü içinde 2.5 mL hacim getirin.
  12. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca mıknatıs tüp koyun. saflığını arttırmak için inkübasyon ayarlayın. Yavaş yavaş polistiren tüp içinde hala bir mıknatıs ile bir 15 ml tüp içine Önerilen Ortam dökmek.
  13. Adımı tekrarlayın 2.12 üç kere daha. Ek manyetik inkübasyonlar saflığını arttırmak için gerçekleştirilebilir.
  14. Büyüme ortamının 3 mL ekleyin ve bir hücre sayacı kullanılarak hücre sayısı.
  15. buna göre Poli-D-Lisin (PDL) tedaviler için ıslah edilmiş plakalarda plakası hücreleri. inPDL-kaplanmış plakalar tohumlamadan sonra hücreler 48 saat maruz bırakınız. Bu hücreler ayrılık stresten kurtarmak için izin verir.
    NOT: CheDaha önce tarif edildiği gibi 15 immünsitokimya kullanarak kültür saflığı ck.
  16. Çoğunlukla büyüme aracı madde içinde T-75 şişelerinde, astrositler içeren (15 ml bir tüp içinde toplanmıştır) negatif kısmını, Plate.
  17. 37 ° C inkübatör içinde inkübe en azından 6 saat sonra, orta değiştirmek ve / N O büyümesine izin. tedaviler için ertesi gün astrositler bölün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mikroglia II yüksek saflığa sahip CD11 pozitif seçim kiti kullanılarak izole

Primer fare mikroglia yukarıda belirtilen protokol kullanılarak izole edilmiş ve izolasyon saflığını kontrol etmek için poli-D-lizin kaplı lamelleri kaplandı. On bin hücreleri izole mikroglia saflığı kontrol etmek için mikroglia ve astrositler bir işaretçi olarak glial fibriler asidik protein (GFAP) 'in bir işaretleyici olarak iyonize kalsiyum bağlay...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Eski mikroglial izolasyon yöntemleri, çeşitli protein Western blot analizleri ve RNA QRT-PCR ile analiz için uygun değildir sınırlı geri kazanımları sahiptir. Diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon yöntemler düşük mikroglial verim 13, 14, 15 sahip iki genel yaklaşım vardır. Sütun tabanlı CD11b yaklaşım aynı zamanda düşük bir iyileşme, ancak diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon 13,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

NS088206 ve ES026892: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleriyle desteklenmiştir. W. Eugene ve Linda Lloyd bahşedilmiş Sandalye AGK ve AK Dekanlar Profesörlük da kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EasySep CD11b Ayırma Kiti IIKök Hücre Teknolojileri18970
EasySep MıknatıslıKök Hücre Teknolojileri18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)Yaşam Teknolojileri11330057
Sodyum PiruvatYaşam Teknolojileri11360070
MEM Esansiyel olmayan amino asitler (100x)Yaşam Teknolojileri11140050
L-Glutamin (100x)Life Technologies25030081
EDTAFisher ScientificAM9260G
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma13H469
%0.25 Tripsin-EDTAGibco by Life Technologies25200
Dulbecco'nun PBS'si (DPBS)Gibco by Life Technologies14190250

Kaynaklar

  1. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  2. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
  3. Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
  4. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  5. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  6. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
  7. Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
  8. Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84(2011).
  9. Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
  10. Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
  11. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  13. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  14. Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
  15. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  16. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  17. Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
  18. Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
  19. Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
  20. Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
  21. Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre Ay rmaManyetik BoncuklarH cre SaflH cre VerimiAk SitometrisiWestern Blotmm nositokimyaH cre K lt r

İlgili makaleler