Method Article

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

DOI:

10.3791/55369

⸱

October 2nd, 2017

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aydınlatma proteinleri Kromatin hedefleme bağlama özellikleri Kromatin karmaşık doğası ve en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri türdeş olmayan doğası nedeniyle çok zor olabilir. Bu engelleri aşmak için Kromatin-bağlı kompleksleri göreli bağlama benzeşim değerlendirmek için bir sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil adapte olması. Bu kolay ve basit tahlil sigara-uzmanlar tarafından benzeşme iki ilgili kompleksleri, benzeşim bir kompleks bir alt birim kaybolur veya bir etki alanı denetleyicisindeki inaktive değişimler ve değişikliği bağlama göreli farkı değerlendirmek için kullanılabilir bağlama benzeşme Kromatin manzara için değişiklik sonra. Sırayla tuz miktarda artan toplu Kromatin yeniden askıya tarafından biz Kromatin belirli bir protein elüsyon profil edebiliyoruz. Bu profilleri kullanarak, biz değişiklikler Kromatin değiştirme karmaşık veya değişiklikler Kromatin ortamına bağlama etkileşimleri etkilemesi tespit edebiliyoruz. SSE diğer içinde in vitro ve in vivo deneyleri ile kaplin, biz bireysel etki alanları ve proteinleri Kromatin ortamlarda çeşitli bir kompleks işlevselliğinin rolleri belirleyebilirsiniz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA düzenlemesi ökaryotik hücrelerde hücre içi ve hücre dışı uyaranlara yanıt koordine proteinler bir ürün yelpazesine tarafından sıkı bir şekilde kontrol karmaşık ve sofistike bir sistemdir. DNA Histon octamers gevşek DNA dağıtılmış veya sıkı bobinleri1sıkıştırılmış form oluşturarlar için etrafında sarılır. Bu Yapısal düzenleme DNA ve Histon okumanıza, yazmanıza ve sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTM) Histon2silmek proteinlerin bir ağ tarafından düzenlenen Kromatin olarak bilinir. Asetilasyon gibi bazı Histon PTMs, amino asit onlar, Histon ve DNA2arasındaki etkileşim değiştiren yatırılan ücret değiştirin. Histon PTMs aynı zamanda transkripsiyon regülatör, Kromatin remodelers, DNA hasar onarım makineleri ve DNA çoğaltma makineleri genom3özel bölgeler için recruit hizmet.

Kromatin etkileşimleri çalışmak için pek çok yöntem küçük ölçekli etkileşimleri soruşturma veya büyük genom çapında analizleri dahil. Vitro bağlama çalışmalar genellikle bireysel rekombinant etki alanlarında Histon peptidler veya DNA deneyleri Elektroforez hareketlilik shift deneyleri (EMSAN), izotermal titrasyon Kalorimetre, Floresans polarizasyon ve peptid pulldowns gibi kullanmak. Bu deneyleri genellikle bir bireysel protein etki alanında odaklanmak çünkü onlar bulmaca küçük bir parça anlayış kolaylaştırmak, ama çok protein rollerini bırak, birden çok etki alanı proteinler kooperatif doğasını anlamak için bize izin verme kompleksleri. Başka tabaka-in karışıklık en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri heterojen bileşimi tarafından eklenir. Bu protein heterojenite Kromatin peyzaj dinamik yapısı ile birlikte bu etkileşimleri Kromatin proteinleri Kromatin içinde vitroiçin bağlama vivo özetlemek için zor yapar.

Vivo yöntemler önemli gelişmeler yaptık; Ancak, pahalı, zaman alıcı ve teknik olarak zor çoğu zaman. Önemli optimizasyon4gerektirir ancak Kromatin immunoprecipitation (ChIP-seq) sıralama tarafından takip çok arasında soykırım, proteinler ve Histon değişiklikleri yerelleştirilmesini belirlemek için kullanışlıdır. Proteinler çoğu kez çapraz Kromatin etkileşimleri korumak için; Ancak, bu yapay etkileşimler oluşturabilir ve5maskeleme epitope neden olabilir. Ayrıca, immunoprecipitations (IP) çok özel antikorlar ve DNA kesme ve ChIP-qPCR genellikle kullanılabilir bir temanındeğildir bilinen bağlama sitesini kullanarak IP koşulları geniş optimizasyonu gerektirir. Optimizasyon çip koşullardan sonra işleme örnekleri maliyetlidir ve ay sıra ve analiz için birkaç hafta gerektirir. Bu yöntem çok değerli olmasına rağmen Kromatin lokalizasyonu tanımlamak için proteinler bağlı genom maliyet ve süre taahhüdü engelleyici küçük değişiklikler küresel bağlama özellikleri etkilemesi hakkında hipotezler oluşturmak için bu yöntemi kullanmak için yapmak .

Bu yazıda, sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil küresel bağlama profilleri Kromatin bağlı proteinlerin incelemek ve bir protein, karmaşık veya genel PTM profil değişiklikleri etkileşimleri nasıl değiştirebilir ayırt etmek için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Tuz çekimi geniş ve yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen nasıl sıralı bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve çok yönlü olduğunu göstermektedir. SSE için toplu Kromatin kompleksi'nın genel ilgi nasıl bir kompleks veya hatta tek bir etki alanında tek bir alt birim katkıda karakterize için bize izin verir. SSE bağlama bir protein Kromatin ortamındaki değişikliklerden ChIP-seq ve diğer genom geniş çalışmaları kullanarak doğruladı Histon işareti hedefleme için ilginç hipotezler sağlayan etkilenir eğer belirlemek için de kullanılabilir.

Aslında bu yöntem--dan Wu Polybromo1 işlevinin incelemek için vd., uyarlanmış (PBRM1) bağlama PBAF Kromatin remodeler6,7. Bu tekniği kullanarak, biz PBRM1 rolü için karmaşık remodeling PBAF Kromatin içinde Kromatin bağlamasını belirlenir ve bu işlev7altı bireysel bromodomains göreli katkısını belirledi.

Burada nasıl bir protein Kromatin çıkarılması bir kimyasal inhibitörü incelemek için benzer Kromatin kompleksleri, değiştirme göreli bağlama benzeşme değerlendirmek için farklı hücre tipleri bağlamasında Kromatin keşfetmek için bu yöntem en iyi duruma getirmek için açıklamak ve Kromatin bağlama Kromatin manzara için değişiklik sonra etkilerini belirlemek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlıklar

  1. Hipotonik eriyik arabellek A: 0,3 M hazırlamak 100 mL sukroz, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA ve % 0,5 NP-40. 4 ºC mağaza.
    Not: HEK293T gibi bazı hücre hatları daha az sıkı lysing koşullar gereklidir. Çekirdeği kolayca parçalayıcı, değiştirilme tarihi arabellek A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, % 0,1 NP-40 ve %10 gliserol kullanın.
  2. 2 x mRIPA çözüm 250 mL stok çözeltisi hazırlamak: 100 mM Tris pH 8.0, % 2 NP-40 ve %0,5 sodyum deoxycholate.
  3. 100 mL stok 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak.
  4. 2 x mRIPA ve 5 M NaCl çözümleri, kullanarak hazırlamak 50 mL 1 x mRIPA çözeltisi her altı tuz konsantrasyonu için: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM ve 500 mM NaCl. Denemeyi başlatmadan önce serin buz üzerinde tüm çözümler
  5. Grow hücre satırları istenen koşullar altında.
    Not: bir protein vurma etkilerini belirlerken, SSE devirme satırı için wildtype hücrelere kıyasla gerekir. Bu SSE yan yana gerçekleştirilmelidir. Kimyasal inhibitörleri ya da bir çekim gücü kullanan örnekler için 3-5 bölümlerine bakın.

2. Temel sıralı tuz çıkarımı

her
  1. hasat 8 milyon hücre durumu ve yıkama buz soğuk PBS ile iki kez 5 mL.
    Not: Eşit eşdeğer protein konsantrasyonları için hücre sayısı için önemlidir. Sayısına sahip hücreleri tek hücre satırları veya belirli proteinler için optimize edilmiş olması gerekir. Yok ki çok fazla protein konsantrasyonları artış gözlem denge bağlama üzerinde bağlıdır elüsyon eğrinin engeller gibi. Ancak, çok az hücrelerle olabilir eğri algılamak için yeterli protein ve Kromatin Pelet için zordur yalıtmak ve kesirler arasında kaybolabilir.
  2. Hücreleri arabelleği A 1 mL + proteaz inhibitörleri yeniden askıya alma, 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri ve 10 dakika süreyle 4 ° C'nin altındaki döndürme üstünden içine transfer
  3. Tarafından Santrifüjü 6000 x g 4 ºC, 5 min için de çekirdeklerin yalıtmak.
    Not: bu adımdan sonra nükleer zarf hala bozulmamış olması gerekir. Nükleer zarf sağlamsa, pelet tamamen yeniden askıya alacak; Ancak, zaman zarfı lysed ve Kromatin yayımlanır, pelet yeniden askıya alacak değil. Nükleer zarf arabellek A kuluçka sonra sağlam değilse, modifiye tampon A. kullanmak
    4. Her hücre çekirdeği pelet pelet yeniden askıya almadan önce için
  4. eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + proteaz inhibitörleri. Her örnek 1 mL pipet ile 15 kez pipetting tarafından lunaparkçı. Pelet kolayca yeniden askıya, ancak, çekirdekleri gibi bu pipetted ve örnek olacak kalın ve yapışkan ve pipet zor koşullar.
      Kadar Pelet ucunu çekmek, pipet ucu santrifüj tüpü dibine karşı sonuna dokunun için
    1. . Pelet tam olarak bir kez DNA çekirdeklerin serbest, ama pipetting kıracak o yukarıya eriyecektir değil
  5. Ne zaman tüm örnekleri homojenize, kuluçkaya buz 3 dakika süreyle tüm örnekleri
    Not: Kuluçka zaman faiz protein bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş gerekebilir.
  6. Örnekleri için 4 ºC de 6500 x g, 3 dk centrifuging tarafından ayrı tut moduyla Kromatin Pelet.
  7. Transfer süpernatant temiz 1.5 mL santrifüj için tüp. Bu 0 mM kesir olacak. Bu 0 mM mRIPA çözüm çekirdeklerin lizis bir yıkama adım olarak hareket edebilir ve herhangi bir gevşek proteinleri Kromatin ile ilişkili olmayan kaldırmak.
  8. Eklemek 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + proteaz inhibitörleri her Kromatin pelet pelet yeniden askıya almadan önce için. Kromatin pelet pelet yukarı ve aşağı 15 kez pipetting tarafından kırmak.
    Not: Bu kaç kez Pelet içinde pipetted ile tutarlı olacak şekilde önemlidir.
  9. Incubate 3 dakika buzda. Bu kuluçka adım ne zaman birden çok örnekleri var özellikle önemli olan bir denge durumu ulaşmak tüm örneklerini sağlar.
  10. 3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.
  11. Tekrar 2.6-2,10 için kalan tuz konsantrasyonları.
    Not: 400 mM NaCl sonra mRIPA Pelet aptallar ve açık olmalı ve tüp alt kısmında kalmak olmaz. Pelet santrifüj tüpü izole süpernatant süre kapağı yerleştirilebilir.
  12. 4 protein yükleme x 70 eklemek µL boya her bölümü için ve her kesir bir SDS Akrilamid jel western blot analizi için üzerine 30 µL yük.
    Not: bağlama profil protein belirlemek için bu lysate yerine, yükleme eşit protein konsantrasyonları eşdeğer miktarda yüklemek için önemlidir.
  13. Standart bir western blot bir membran transfer ederek gerçekleştirmek ve faiz proteinler için birincil antikorlar kullanın.
    14. Kromatin eluted protein quantitate
  14. kuluçkaya kızılötesi floresan IRDye ikincil antikorlar blot ve görüntü leke bir Görüntüleyici ile. Diğer yöntemleri geliştirme kullanılabilir ise, doğada daha nicel olarak floresan veya kızılötesi görüntüleme öneririz.
  15. Kullanım ImageJ veya benzer yazılım yoğunluğu her tuz konsantrasyonu eluted protein için hesaplamak için. Grup yoğunluğu tuz konsantrasyonu karşı grafiklerini çizerek, elüsyon desen senin protein ilgi belirlenebilir.

3. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir " okuyucu " inhibitörü

  1. iki hücre (4 milyon) hasat ve çekirdeklerin olduğu gibi standart bir SSE yalıtmak.
  2. Her iki mRIPA 0 mM NaCl 200 µL içinde yeniden askıya alma ve kuluçkaya 3 dakikadır. Bu çekirdeklerin ücretsiz herhangi bir protein kaldırılması için sağlayacaktır.
  3. Eklemek 200 µL mRIPA 0 mM NaCl her Pelet için. İnhibitörü (1 mm (+) JQ1 2 µL) bir örnek ve DMSO denetim kümesine ekleme.
  4. Propaganda pelet tarafından 15 kez pipetting ve 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
  5. 3 dk 4 ºC ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp transferi için 6500 x g, santrifüj.
  6. 3.3-4 için tuz konsantrasyonları tekrarlayın ve standart Batı leke gerçekleştirmek.

4. Sıralı tuz çıkarımı varlığı bir " yazar " inhibitörü

  1. tedavi inhibitörü (10 µM SAHA) içeren hücreleri veya DMSO 3 h. için
  2. Her tedavi için 4 milyon hücre hasat.
  3. İçin tüm arabellekleri eklendi inhibitörü ile örnekleri için standart bir SSE gerçekleştirmek.

5. Sıralı tuz ayıklama aşağıdaki DNA hasar

  1. 1 µM doksorubisin 1 h. için hücrelerle tedavi
  2. Hücreleri medyada değiştirmek ve onları için 3 h. kurtarmak izin
  3. 8 milyon hücre hasat ve temel SSE gerçekleştirmek.

6. Sigara sıralı tuz çıkarma

  1. 12 milyon hücre hasat ve yıkama PBS ile.
  2. Bölmek hücreleri böylece mikro santrifüj tüpü başına 2 milyon hücre.
  3. Arabellek A 500 µL içinde yeniden askıya alma ve 10 dk. için kuluçkaya
  4. Çekirdeklerin Santrifüjü 6000 x g. adlı tarafından izole
  5. Yeniden askıya 200 bir µL her mRIPA arabellekleri + NaCl unsurlardandır.
  6. 1 mL pipet ucu ile 15 kez pipetting tarafından her örnek lunaparkçı.
  7. Incubate on Ice 3 dakika süreyle
  8. Tarafından Santrifüjü 6500 x g, Kromatin yalıtmak ve tüpler temizlemek için süpernatant aktarın. Boya yükleme 70 µL ekleyin ve western blot analizi için SDS-sayfa jel 30 µL çalıştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, avantajları ve uygulamaları edebiyat6adapte olması sık kullanılan sıralı tuz ayıklama (SSE) yöntemi göstermektedir. Şekil 1' de, biz proteinler ardışık olarak sigara ARID1a ve PBRM1 elüsyon şekillerinin algılayarak ayıklama SSE tekrarlanabilirlik karşılaştırın. Biz sürekli olarak ARID1a, BAF alt birimi, öncelikle 200 mM NaCl ve PBRM1, bir özel PBAF alt birim elutes, öncelikle 300 mM NaCl elutes görmekteyiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein ve Kromatin etkileşimleri aracılığıyla tuz çekimi karakterizasyonu istihdam edilmiş bir ortak için onlarca yıl14,15yöntemidir; Ancak, bu sistematik olarak daha önce nedeniyle ortaya çıkarmak için optimize edilmiştir değil. Biz göstermek ne kadar hızlı ve ucuz bir şekilde protein veya çevre değiştirildiğinde Kromatin bağlama değişiklikleri ayırt etmek için sıralı bu yöntemi sağlar. Son derece uyumlu ve en iyi hale getirilebilen SSE ve önemlisi, bu teknik o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser kanser için bir V bilim adamı Ödülü (V2014-004) ve V bilim adamı artı Ödülü (D2016-030) kanser araştırmaları için V Vakfı ve bir Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma bursu (ACS IRG Grant 58-006-53) Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından desteklenmiştir Araştırma. E. G. s. Borch lisansüstü Bağış Ödülü Purdue Üniversitesi tıbbi kimya ve moleküler Farmakoloji bölümü tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sodyum Klorür, Kristal 2,5 kg AR (ACS)Avantor/Macron7581-06
Sükroz, Kristal 500 g AR¨ (ACS)Avantor/Macron8360-04
potasyum klorür, granül 500 g AR¨ (ACS)Avantor/Macron6858-04
Trizma(R) tabanı, Birincil Standart ve Tampon, >=%99,9 (titrasyon), kristalSigma-AldrichT1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraasetik Asit, Disodyum Tuzu, Dihidrat 125 G AR (ACS)Avantor / Macron4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRAT, 100mL UN3082AmrescoE109-100ML
HEPES Tamponu Çözelti (1M)Gibco15630-080
Magnezyum Klorür, 6-Hidrat, Kristal 500 g AR¨ (ACS)Avantor/Macron5958-04
GLİSEROL, 1LAmresco0854-1L
DEOKSIKOLIK ASIT SODYUM TUZU, 100gAmresco0613-100G
Eppendorf Research plus pipetFisher Scientific13-690-032
Eppendorf 5424 R soğutmalı mikrosantrifüjEppendorf5424 R
İkincil fare IgG HRP bağlantılıHücre Sinyali7076
İkincil tavşan IgG HRP'ye bağlıHücre Sinyali7074
BMI-1 antikoruMillipore
PBRM1 antikoruBethylA301-591A
ARID1a antikoruSanta Cruzsc-32761
BRD4 antikoruBethylA301-9852a
(+) JQ1Cayman Kimya Şirketi11187
SAHACayman Kimya Şirketi10009929
DoksorubisinAK Bilimsel25316-40-9
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Macron4948-02
Mini Trans-Blot HücresiBioRad1703930
Mini Jel TankıThermoFisherA25977
Albümin, Sığır (BSA)Amresco0332-100gWestern blotları için bloklama çözeltisi olarak PBS-T'de %5'lik bir çözelti olarak kullanılır
Bolt MOPS SDS Koşu Tamponu (20x)Life TechnologiesB0001
Bolt LDS Numune Tamponu (4x)Life TechnologiesB0007
PageRuler Plus Boyalı Protein Merdiveni, 10 ila 250 kDaThermoFisher26619
Metil Alkol, SusuzMacron3041-10
Tripsin kEDTA, 1XCellgro25-053-CI
SODYUM AZID, 250g UN1687Amresco0639-250G
SODYUM DODESIL SÜLFAT (SDS) 500g UN1325Amresco0227-500G
Glisin, elektroforez için, >=% 99Sigma-AldrichG8898-1kg
BigTop Mikrosantrifüj Tüpleri, PolipropilenVWR20170-333
1000 ve mikro; L Pipet UçlarıVWR83007-382
NuPAGE Bis-Tris Prekast Jeller %4-12İnvitrojenNW04125BOX
Leupeptin Hemisülfat, 5 MGRPI Araştırma Ürünleri22035-0.005Proteaz inhibitörü çözeltisi için kullanılır.
APROTININ, 10 MGRPI Araştırma Ürünleri20550-0.01Proteaz inhibitör çözeltisi için kullanılır.
PEPSTATIN A, 5 MGRPI Araştırma Ürünleri30100-0.005Proteaz inhibitör çözeltisi için kullanılır.
OVCA429 hücreleriKaren Cowden Dahl'dan Hediye Ph.D.
HEK293TATCCCRL-3216
HeLa hücreleriATCCCCL-2
McCoy'un 5A ortamıCorning Mediatech10-050-CV
DMEMCorning Mediatech10-013-CV
Minimum Temel Orta (MEM), TozCorning Mediatech50-011-PC
MEM NEAA (100X) esansiyel olmayan amino asitGibco11140-050
FB-11: Fetal Sığır Serumu, ABD KaynakOmega ScientificFB-11
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiYaşam Teknolojileri15140-122
GlutamaxYaşam Teknolojileri35050-061
sodyum piruvatYaşam Teknolojileri11360070
VWR Gücü Kaynak:VWR13-690-032

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
  2. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
  3. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  4. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  5. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
  6. Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
  7. Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
  8. Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
  9. Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
  10. Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
  11. Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
  12. Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
  13. Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
  14. Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
  15. Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sequential Salt ExtractionChromatin BindingProtein ElutionSalt ConcentrationWestern BlotSDS PAGE GelHypotonic BufferModified RIPAProtein Loading DyeImage Analysis

Related Articles