İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model
Bu makalede
Özet
Özet
Karmaşık insan beyninin gelişimini güvenilir bir şekilde temsil edebilen uygun in vitro modellerin kısıtlı mevcudiyeti, temel beyin araştırmalarının klinik uygulamaya geçişini sınırlayan önemli bir darboğazdır. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) etik açıdan sorgulanabilir insan embriyonik kök hücrelerinin yerini almış olsa da, iPSC tabanlı nöronal farklılaşma çalışmaları hücresel düzeyde tanımlayıcı olmaya devam etmektedir, ancak karmaşık, 3D insan beyin dokusundan türetilebilecek ayrıntıları yeterince sağlayamamaktadır.
Bu boşluk şimdi, karmaşık insan beyni gelişiminin birçok özelliğini modelleyen iPSC'den türetilmiş, 3D beyin organoidleri, "Bir tabaktaki beyinler" uygulamasıyla dolduruluyor. Burada, iPSC'den türetilmiş, 3D beyin organoidleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Organoidler, nadir görülen bir insan nörogelişimsel bozukluğu olan otozomal resesif primer mikrosefali (MCPH) modellenmesine yardımcı olabilir. MCPH'deki beyin malformasyonu için yaygın olarak kabul edilen bir açıklama, insan beyninin gelişiminin erken aşamalarında nöral kök hücre havuzunun tükenmesi, in vitro olarak yeniden yaratılması veya kanıtlanması zor olan gelişimsel bir kusurdur.
MCPH'yi incelemek için, sentrosomal protein CPAP'ta bir mutasyon taşıyan hasta kaynaklı fibroblastlardan iPSC'ler ürettik. Mikrosefali 3D beyin organoidlerinin ventriküler bölgesini analiz ederek, nöral progenitörlerin erken farklılaşmasını gösterdik. Bu 3D beyin organoidleri, nörotoksik kimyasallar, nörotrofik viral enfeksiyonlar veya kalıtsal genetik mutasyonların neden olduğu konjenital beyin bozukluklarının modellenmesinde etkili olacak güçlü bir in vitro sistemdir.
Giriş
Böyle mikrosefali gibi İnsan nörogelişimsel bozukluklar, sadece kötü nedeniyle insan beyni uzun bir kortikal yüzeye, insan olmayan hayvanlardan farklı benzersiz bir özelliğe sahip olması nedeniyle hayvan modellerinde incelenebilir.
Bu özellik, insan beyin gelişimi yeterli in vitro hücre kültürü sisteminde, bir 2D incelenecek bir karmaşık işlemi yapar. Gelişmekte olan 3D kültür teknikleri uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doku benzeri organoids üretilmesini sağlar. 3B süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerinin in vitro farklılaşma organize, tabakalı doku, 1,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Beyin Organoids 1. Nesil (23 gün)
- Nöroektoderm başlatılması (5 gün)
NOT: Aşağıdaki noktalar farklılaşma başlamadan önce düşünülmelidir. İnsan iPSCs elde etmek üzere yeniden programlama yöntemi (lentiviral- sendai-virüs- epizomal-, veya mikroRNA bazlı vs.), ideal hastada için aynı ve iPSC hatları kontrol edilmelidir. Çeşitli yeniden programlama kitleri ve yayınlanmış protokollere göre talimatları 15, 16, 17, 18 mevcuttur. İnsan iPSC hatlarının kalite optimal farklılaşma gerçekleştirmek için bir ana....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Beyin organoids üretilmesi, sürekli kültürleme (Şekil 1A), en az üç hafta gerekir. tekrarlanabilir sonuçlar başarmak için araştırmacı her adımda belgeleyen ve daha da önemlisi, orta bileşenleri, zaman noktaları ve baz muameleleri ile ilgili herhangi bir değişiklik önler öneririz. Burada, kritik kilometre taşları deney sonunda yeterli kalitede organoids elde etmek için ulaşılır eğer nasıl değerlendirileceğini bir özetini verir. 96 oyuklu bir plaka içerisinde neurospheres .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MCPH in vivo ya da insan hücre kültürü, in vitro olarak yaklaşımlar hayvan modellerinde değinmeyecek edilemez bir karmaşık insan nöro hastalıktır. MCPH klinik tezahürü erken nöron başladığında, ilk trimesterde görünmeye başlar. Böylece, 3D beyin organoids MCPH gelişimini modellemek için güvenilir deneysel sistemi temsil etmektedir. Buna ek olarak, 3D insan beyni organoids önemlisi, iii) çeşitli farklılaşma i) çeşitli genetik arka planı olan hasta numunelerinin spektrumu uyarlanması için izin ii) farklı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (Az.10.14.2.152) tarafından desteklenmiştir. Biz doku gömme tesisi ve CMMC mikroskop çekirdek tesisine minnettarız. Biz Sentrozom ve Sitoiskelet Biyoloji Laboratuvarı üyeleri tarafından sunulan tartışmalar ve teknik destek için müteşekkiriz. Yazıları ve düzeltilmesi için Li Ming Gooi teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-fare 488 | Invitrogen | A-11001 | Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 |
| Anti-tavşan 647 | Invitrogen | A-21245 | Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B tavşan poliklonal antikoru & nbsp; |
| CELLSPIN sistemi | IBS Integra Biyobilim | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, ABD | 32670 | 4 ve asal;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür; birden fazla tedarikçi |
| DMEM/F-12 | Gibco, ABD | 31331093 | Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı: Besin Karışımı F-12 |
| Dorsomorfin | Sigma-Aldrich, ABD | P5499 | Bileşik C; birden fazla tedarikçi |
| Gömme ortamı | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; gömme ortamı; çoklu tedarikçiler |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrisi | Corning | 354277 | Matrigel hESC nitelikli matris; önemli: hESC nitelikli |
| Balık jelatini | Sigma-Aldrich, ABD | G7765-250ML | Soğuk su balık derisinden elde edilen jelatin; birden fazla tedarikçi; çözmek ve sterilize etmek için PBS'ye ekledikten sonra otoklav, 4 ° C'de saklayın; C |
| Glisin | AppliChem | A1067,1000 | Moleküler biyoloji için glisin; çoklu tedarikçiler ve nbsp; |
| İğne ile aşılama döngüsü, tek kullanımlık (1 & mikro; L) | Sigma Aldrich, ABD | BR452201-1000EA | çoklu tedarikçiler ve nbsp; |
| İnsülin | Sigma-Aldrich, ABD | I3536-100MG | çoklu tedarikçiler |
| L-glutamin | Gibco, ABD | 25030081 | L-glutamin (200 mM) |
| Orta A | Kök hücre teknolojileri | #05850 | mTeSR1 (hiPSC orta) |
| Orta B | Kök hücre teknolojileri | #05835 | Nöral indüksiyon ortamı (NIM); nöral farklılaşma ortamı |
| Orta C | Gibco, ABD | 21103049 | Nöral Bazal Ortam |
| MEM | Gibco, ABD | 11140035 | MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (100x) |
| MycoAlert Mikoplazma Tespit Kiti | Lonza, İsviçre | #LT07-218 | Mikoplazma tespit kiti; çoklu tedarikçiler |
| Nestin | Novus biyolojikleri | NBP1-92717 | Nestin fare monoklonal antikoru (4D11) |
| Paraformaldehit (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | PBS'de %4, mağaza çözümü -20 ° C'de; C; DİKKAT: CİLT VE GÖZ KORUMASI GİYİN VE KAPÜŞON ALTINDA ÇALIŞIN |
| PBS tabletleri | Gibco, ABD | 18912014 | Bkz. üretici&akut; S talimatları; çoklu tedarikçiler |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Gibco, ABD | 15140122 | Çoklu tedarikçiler |
| Poli-L-lizin çözeltisi (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Çoklu tedarikçiler |
| pVim | MBL | D076-3S | Fosfo-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reaktifi A | Kök hücre teknolojileri | # 05872 | Protokol 1.1.1.2 Notu; ReLSR (Enzim içermeyen insan ES ve iPS hücre seçimi ve pasaj reaktifi); Lütfen üretici ve akut'u takip edin; S protokolü; birden fazla tedarikçiden alternatif ürünler mevcuttur |
| Reaktif B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solüsyonu, tek hücre ayrışması için enzimatik bir çözeltidir; çoklu tedarikçiler; Protokol 1.1.2 "Enzimatik hücre ayrışma çözümü" |
| Araştırma Kriyostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Çoklu tedarikçiler |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Çoklu tedarikçiler |
| Eğirici şişe 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sükroz | AppliChem | A4734, 1000 | Birden fazla tedarikçi |
| Superfrost ultra plus mikroskop slaytları | Thermo scientific, ABD | J3800AMNZ | Slaytlar "+" ve pozitif yüklü ile etiketlenmelidir |
| Ek 1 | Gibco, ABD | 17502048 | N-2 takviyesi (100x) |
| A Vitamini içermeyen Ek 2 | Gibco, ABD | 12587010 | B-27 takviyesi (50x), eksi A vitamini; birden fazla tedarikçi |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Çoklu tedarikçiler |
| Tissue-Tek O.C.T. bileşiği | Sakura, NL | 4583 | Çoklu tedarikçiler |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Çoklu tedarikçiler |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (tavşan poliklonal) |
| TUNEL testi | Promega, US | G3250 | DeadEnd Florometrik TUNEL sistemi; moleküler biyoloji için birden fazla tedarikçi |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Birden çok tedarikçi |
| su geçirmez levha | BEMIS şirketi, inc. | PM996 | Parafilm " M”; çoklu tedarikçiler |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | KAYA inhibitörü (Y-27632 2HCL); çoklu tedarikçiler |
| ve beta;-merkaptoetanol | Gibco, ABD | 31350010 | 2-merkaptoetanol (50 mM); çoklu tedarikçiler |
Kaynaklar
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Na....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
