Yöntem makalesi

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

DOI:

10.3791/55381

⸱

7 Eylül 2017

 ,  ,  , 
1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eleştirel ölçekli kemik defektleri yeniden inşası ciddi bir klinik sorun doku Mühendisliği iskele içinde zavallı angiogenez nedeniyle artış yeterli kan akımı eksikliği için verir ve yeni doku nekrozu neden olan onarım sırasında kalır. Hızlı vaskülarizasyon yeni doku hayatta kalma ve varolan ana bilgisayar doku ile tümleştirme için hayati bir önkoşuldur. İskele damarlara de novo nesil kemik rejenerasyon daha verimli bir iskele büyümeye doku onarımı izin yapımında en önemli adımlardan biridir. Bu sorunu çözmek için bir biomaterial iskele genetik değişiklik anjiogenez ve osteogenesis hızlandırmak için kullanılır. Ancak, görselleştirme ve in vivo izleme damar oluşumu içinde gerçek-zaman ve üç boyutlu (3D) İskele veya yeni kemik dokusu hala kemik doku mühendisliği için bir engel olduğunu. Multiphoton mikroskobu (MPM) biyolojik yapıları hacimsel veri yüksek çözünürlüklü ve minimal invaziv bir şekilde elde edebilirsiniz roman bir biyo-görüntüleme yöntemi var. Bu çalışmanın amacı angiogenez multiphoton mikroskobu içinde vivo grefti kritik Kemik defekti tamir için genetik olarak değiştirilmiş bir 3D-PLGA/nHAp iskele ile görselleştirmek için yapıldı. PLGA/nHAp iskele angiogenez kolaylaştırmak amacıyla ve kemik rejenerasyon geliştirmek için lentiviral vektörler (LV -pdgfb) taşıyan bir büyüme faktörü pdgf-b gen sürekli teslimat için functionalized. Fare modeli bir iskele implante grefti kritik kemik içinde defekt, PHp iskele kan damarı alanlarında (BVAs) PH iskele önemli ölçüde daha yüksekti. Buna ek olarak, ifade pdgf-b ve anjiogenezi ilgili genler, vWF ve VEGFR2, buna bağlı olarak arttı. MicroCT analiz yeni kemik oluşumu önemli ölçüde geliştirmek PHp grubunda diğer gruplar karşılaştırıldığında belirtti. Bilgimizi, bu multiphoton mikroskobu angiogenez 3D biyolojik degradable iskele vivo içinde ve gerçek zamanlı olarak araştırmak için kemik doku mühendisliğinde kullanılan ilk seferim.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik bir bireysel1kullanım süresi boyunca yeni model devam ediyor son derece bozukluklarına bir dokudur. Büyük kemik defektleri kaynaklanan travma, sendikasız, tümör rezeksiyonu veya Fasiyal malformasyonlar hızlı ve etkin kemik rejenerasyon fizyolojik karmaşık bir süreçtir. Kemik defekti tamir için kullanılan geleneksel tedavi yaklaşımları otogrefti ve homogreft implantasyon içerir, ancak bunların kullanımı birkaç sorunları ve sınırlı kullanılabilirlik, önemli donör sitesi morbidite, enfeksiyon, yüksek riski gibi sınırlamalar içerir ve bağışıklık ret2,3ev sahipliği. Ancak, yapay Kemik Greftler bu kısıtlamaları hafifletmek için etkili bir alternatif sunuyor. Onlar biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerden yapılmış, uygun gözenek boyutu ile olmak imal etmek kolaydır ve genetiği değiştirilmiş4,5olabilir.

Şu anda, çeşitli doku Mühendisliği iskele kemik doku Mühendisliği6,7gelişiminde istihdam edilmiştir. Kemik onarım ve rejenerasyon daha etkili bir şekilde ikna etmek için tasarlanmış Biyomalzeme büyüme faktörleri ile birlikte ortaya çıktı ve iyi sonuçlar8,9elde. Ne yazık ki, kısa yarılanma, kaybetmek kolay aktivite ve büyüme faktörleri terapötik etkinlik için doz supraphysiological kendi klinik uygulama10sınırlayın. Bu sorunların üstesinden gelmek için büyüme faktörü genler büyüme faktörleri yerine teslim bioactivity kemik defektleri ve hastalıkları11,12tedavisi için sürdürebilmek için etkili bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır. Viral vektörleridir umut verici teslim nedeniyle verimliliği13ifade onların yüksek doku rejenerasyonu için araçlar.

Çünkü bu sadece bir mitojenle ve chemoattractant Mezenkimal ve Osteojenik hücreler için aynı zamanda bir uyarıcı angiogenez14,15 büyüme faktörleri arasında trombosit-türevi büyüme faktörü (PDGF-BB) Bu çalışmada seçildi . Önceki preklinik ve klinik çalışmalarda PDGF-BB güvenli ve etkili kemik onarım periodontal kemik defektleri16,17teşvik gösterdi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda PDGF-BB motive edici endotel hücre göç ve nükleer silahların yayılmasına karşı vivo içinde18,19tarafından angiogenez uyarır saptandı. Ayrıca, PDGF-BB de Mezenkimal Kök hücre (MSCs) endotel hücreleri20ve daha fazla bu vurguları potansiyel rolü MSCs neovaskülarizasyon ayırt yeteneğine işleyebilir. Bu nedenle, damarlara iskele PDGF-BB ile de novo oluşumu inducing iskele kemik doku Mühendisliği büyüdü doku onarımı için önemli bir adım.

Kemik defekti şifa koordine osteogenesis ve anjiogenezi tamir pozisyonlar21gerektiren bir dinamik doku morfogenetik bir süreçtir. Neoangiogenesis içine yerleştirilmiş doku Mühendisliği iskele hücrelere besin ve oksijen gelişim ve hayatta kalma ve metabolik atık ile temini için gerekli bir önceden gerekli olduğunu. Yaygın olarak kullanılan görüntüleme yöntemleri, x-ışını dahil olmak üzere mikro tomografi (microCT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG), tarama elektron mikroskobu (SEM), optik Koherens tomografi (OCT) ve confocal lazer mikroskobu, tarama yerine uygulanan hesaplanan Histolojik inceleme angiogenez bilgi22,23elde etmek için. Ancak, bu yöntemleri görselleştirme ve kemik doku Mühendisliği 3D iskele neovasculature ölçme çeşitli engellerle. Multiphoton mikroskobu (MPM) aynı anda hücreler, hücre dışı Matriks, görselleştirme ve damar ağları çevreleyen farklı avantajı vardır nispeten yeni bir biyo-görüntüleme tekniği olduğunu içinde vivo. Bu derin doku penetrasyon için doğal bir üç boyutlu görüntüleme özelliği sahip ve düşük duyarlilik neden olur. Bu nedenle, son on yılda çok ilgi gibi biyomedikal araştırmalar neuroscience, İmmünoloji ve kök hücre dinamiği dahil24, MPM kazanmıştır. Ancak, bu zar zor ortopedik araştırmalarında kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bakım ve kullanım, laboratuvar hayvanları, Guangdong Eyaleti Kılavuzu ile uyumlu hayvan bakımı yapıldı. Tüm yordamları denetim ve Etik Komitesi hayvan araştırma, Shenzhen İleri Teknoloji Enstitüleri, Çin Bilimler Akademisi için onay altında gerçekleştirilmiştir.

1. lentiviral (LV) üretim

  1. klon pdgf-b cDNA (pLenti6/5-eGFP veya LV-eGFP) lentiviral ifade vektör bir özel çoklu klonlama, içine site aşağı Spe kullanarak Sitomegalovirüs düzenleyicinin ben ve Sal Ben 25 pLenti6/5-PDGFB-eGFP plazmid (LV - pdgfb) oluşturmak için kısıtlama siteleri.
  2. Lentiviral parçacıklar (LV - pdgfb) virüs ambalaj plazmid (pLP1, pLP2 ve pVSV-G) ile birlikte transfecting tarafından HEK - 293 FT hücrelerden üretmek klorokin ile standart Kalsiyum fosfat yöntemiyle (son konsantrasyonu: 25 µM) 25.
  3. transfection 48 saat sonra hasat ve virüs içeren 500 mL filtre filtre (0,45 µm) ile süpernatant. Daha sonra viral parçacıkların ultrasantrifüj 89,000 x g 2 h. Resuspend 200 µL serum (PBS), aliquot fosfat tamponlu için de tarafından konsantre ve depolamak-80 ° C.
  4. Lentivirus titresi belirlemek için 24 h için seri olarak seyreltilmiş lentiviral çözüm HEK293T hücrelerle kuluçkaya ve yukarıda açıklanan 25 olarak lentiviral titresi hesaplamak.

2. PLGA/nHAp iskele 3D baskılı ve LV immobilizasyon imalatı

  1. Dissolve 20 g PLGA (Poli D, L-lactide-co-glycolide) malzeme homojen bir çözüm oluşturmak için 1,4-dioxane 20 ml. Mikro HAp (nano-hydroxyapatide) toz (nHAp) 2 g ekleyin; PLGA: nHAp oranı 10:1 (w/w) olmalıdır.
  2. Karışık çözüm stir şiddetle (hız karıştırma: 1500 devir/dakika) 16 h düzgün bir hamur oluşturmak için bir manyetik karıştırıcı kullanarak için oda sıcaklığında. İçine Yapıştır katman katman, alt üst, mevduat bilgisayarlı bir meme ile 3D düşük sıcaklık yazıcı kullanan gözenekli PLGA/nHAp iskele göre önceden tasarlanmış modeli 26 imal; İskele gözenek boyutları aralığı 200 ile 400 µm.
  3. Vakum için solvent gibi tamamen kaldırmak 48 h iskele şeytanibir. % 75 etanol çözüm sterilizasyon için 1 h iskele ıslatın ve tarafsız, aseptik iskele almak için lyophilize.
    Not: yoğuşma sıcaklığı (° C) ve vakum derecesi (Pa) vakum dağılması için önemli parametreleri içerir. Bir vakum derecesi 45 altında Pa, PLGA/nHAp iskele iyice çözücü kaldırmak 48 h için-78 ° C'de dondurulmuş vakum edildi.
  4. Ekleyin 10 µL LV parçacıkların (4.5 x 10 5) ve her PLGA/nHAp (4 x 4 x 2 mm) İskele yapısı-İskele adsorpsiyon izin vermek için oksijen bir kuluçka 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya.
  5. İskele ilişkisiz LV parçacıkları kaldırmak için iki kez PBS ile immobilizasyon sonra durulayın. Ek-LV parçacık kaplı iskele sıvı azot donma, tekrar lyophilize ve-80 ° c ileride kullanmak üzere saklamak.

3. Vitro Kinetik LV parçacık sürüm iskele ve LV iletim etkinliği tahlil

  1. Incubate 3D İskele (4 x 4 x 2 mm) taşıma LV-yeşil flüoresan protein (LV-eGFP, 4.5 x 10 5 LV parçacıklar) 2.0 ml kriyojenik tam DMEM 1 ml şişeleri 37 ° C'de 5 gün boyunca sallayarak ile.
  2. 120 h sonrası kuluçka 12 h her 12 h 1 mL örnek almak ve orta yerine. Her zaman yere, 1 mL 1 mL kuluçka orta yerine taze orta ekleyin.
  3. HEK293T hücreleri 48 h. GFP pozitif HEK293T belirleyerek tarafından biyoaktif LV parçacıkları sayısı hücreleri tarafından Akış Sitometresi 27 ölçü için ortak tarafından kuluçka transduce için toplanan medya kullanın.
    1. HEK293T hücre transducing önce kültür orta kaldırın ve HEK293T hücrelerle iki kez PBS durulayın. Lentivirus içeren toplanan medya serbest iskele iyi (1 mL/de) eklemek ve bir oksijen kuluçka 37 ° C'de 48 h için HEK293T hücreler kültür.

4. Vitro Kemik iliği türevi MSC (BMSC) geçiş değerlendirilmesi

  1. domates floresan protein (BMSCs-T) ve PDGF-BB protein (BMSCs-P) 28 ifade BMSCs geçiş tahlil önce hazırlayın.
  2. BMSC geçiş tahlil Boyden Odası 8 µm gözenek büyüklüğü ile 24-şey plaka ve Polikarbonat filtreleri kullanarak gerçekleştirmek.
    1. Yer BMSCs 0.5 mL (5 x 10 4) transfected ile domates floresan protein (BMSCs-T) üst odalarında ifade LV. BMSCs 0,5 mL yerleştirin (2 x 10 5) transfected LV PDGF-BB protein (BMSCs-P) daha düşük odalarında ifade ile.
  3. Bu denemeye altı gruba dahil ve 500 µL her şey alt bölüme ekleyin.
    A. Denetim, serum-Alerjik orta sadece boş
    B. FBS denetim, orta % 10 ile desteklenmiş FBS
    C. PDGF-BB kontrolü, 4 ng/mL PDGF-BB serum-Alerjik orta
    ö. PDGF-BB ele geçirmek grup, PDGF-BB (4 ng/mL) ve anti-PDGF-BB (4 ng/mL) poliklonal antikor Serum-Alerjik orta
    E. BMSC grup, 2 x 10 5 BMSCs serum-Alerjik orta
    F. BMSCs-P grubu, 2 x 10 5 BMSCs-P serum özgür ortamda.
  4. % 5 CO 2 ve 37 ° C oksijen kuluçka 48 s kuluçkaya. Daha sonra geçirilen hücre alt odası tarafında kaldırma ve Akış Sitometresi tarafından BMSCs-T sayısı miktar için koleksiyon yapıyorum.
    1. Alt odası üzerinde geçirilen hücrelerin hücre kazıyıcı kullanarak yan ve PBS 2 mL geçirilen hücrelerle resuspend kaldır. Akış Sitometresi 29 tarafından geçirilen BMSCs-T sayısını ölçmek.

5. Kurulması bir fare grefti kritik Kemik defekti modeli ve İskele nakli

Not: erkek BALB/c fare (7 hafta eski) Guangdong tıbbi laboratuvar hayvan Merkezi'nden (Guangdong, Çin) satın.

  1. Kayıt toplam 42 erkek farelerde kemik grefti hatası için denemeler yapın. Rasgele üç gruba, her grupta aşağıdaki tedaviler almak on dört ile fareler bölün: Grup A, hiçbir implantlar; Grup B, PH iskele implante (PLGA/nHAp); ve C grubu, implante PHp İskele (PLGA/nHAp/LV-pdgfb).
  2. Sodyum Fentobarbital (50 mg/kg) mayi yönetim hayvanlarla anestezi. Kürk depilatory yapıştır ile çıkarın ve ilk kesi yapmadan önce baş cilt %75 Alkol çözeltisi ile temizleyin. Hala ameliyat sırasında tutmak için stereotaktik bir enstrüman ile her fare başkanı düzeltmek.
  3. İlk kesik bir neşter ile yapmak ve sonra zekâ büyütmek1-cm doğrusal cilt kesi oluşturmak için s makas. Kafatasının bir steril pamuklu çubukla kullanarak kafatası kemik yüzeyine ortaya çıkarmak için kemikten kapaklarini kazımak.
  4. Trephine burr 30 calvaria sol tarafında bir 4 mm çaplı kritik boyutu kusur oluşturmak için kullanın. İskele Kemik defekti siteye nakli.
    Not: Kritik boyut defektleri (CSDs) ilk olarak tanımlanmış olan " en küçük boyutunu intraosseous yara belirli kemik ve hayvan yaşamı boyunca kendiliğinden sarılmayacak hayvan tür " bu deneyde, 4 mm çaplı kusur bir kritik boyutu kemik kusurdur göre daha önce 31 , 32 çalışma.
  5. Oftalmik forseps kapaklarini geri hafifçe cerrahi sitesi kapsayacak şekilde taşımak için kullanın. Cm başına üç dikiş ile kazıma deri dikiş.
  6. Post-operational bakım gerçekleştirmek. Ağrı gidermek için analjezik buprenorfin (0.1 mg/kg) yönetmek için. Hayvan uyanır kadar bir Isıtma yastığı ile vücut ısısını korumak. Daha sonra yiyecek ve su ile hayvan besleme ve faaliyetlerini her gün test sonuna kadar kayıt. Not: Analjezi yordama bağlı olarak senin yerel hayvan bakımı Komitesi yönergeleri. önce yönetilemez duruma gelir

6. Vivo Angiogenez içinde Kemik defekti MPM ile görüntüleme

Not: FITC Birleşik 250 kD dextran (10 mg/mL) serum fizyolojik içinde intravenöz yüksek-SNR (sinyal-gürültü oranı) görüntü yeni kan damarlarının elde etmek fareler enjekte bir önceki çalışmada 33 göre. Bu bir hayatta kalma yordam. unutmayın ki

  1. İki fotonlu heyecanlı floresan (TPEF) ve ikinci harmonik üretimi sinyal (SHG) görüntüleme için multiphoton mikroskobu (MPM) sistemi montajı.
  2. Fentobarbital sodyum (50 mg/kg) mayi bir enjeksiyon hayvanlarla uyuşturan ve hayvanlar üzerinde deneyler boyunca 37 ° C'de onların vücut ısısını korumak için ısıtma yüzeyi hareketsiz. %3.0 isoflurane gaz % 100 oksijen tatmin edici anestezi ve analjezi görüntüleme işlemi sırasında korumak için kullanın. İntraperitoneally görüntüleme önce su kaybı önlemek için (200 µL/hayvan) serum enjekte.
  3. Tune için 860 Ti-Sapphire femtosecond lazer nm. Bir çift galvo aynalar tarayarak bir 512 x 512 µm örnekleme alanı oluşturmak ve NA1.0 su-daldırma objektif lens focusthe uyarma ışın için örnek içine ve backscattered TPEF/SHG sinyal toplamak için kullanın.
    Not: Görüntüleme bir ev-yapı multiphoton mikroskobik görüntüleme sistemi (MPM) gerçekleştirildi. Görüntüleme sırasında bir Ti-Sapphire femtosecond lazer 860 için ayarlanmıştı nm olarak en uygun uyarma dalga boyu. Lazer ışını bir çift galvanometre aynalar kullanarak örnek uçağa taranan raster yapıldı. 685 bir dikroik aynadan geçtikten sonra nm, ışın bir 20 X NA1.0 hedefi tarafından numune üzerinde duruldu. İndüklenen TPEF ve SHG sinyalleri aynı amaç tarafından toplanmıştır. Sinyalleri uyarma lazer yukarıda belirtilen ve 680 nm kısa geçiren Filtre tarafından arıtılmış dikroik ayna tarafından ayrılmış. TPEF ve SHG sinyalleri bir lif paket tarafından toplanmış ve yürütülen bir spektrograf. Spektrograf üzerinde Dedektör photomultiplier tüp (PMTs) doğrusal bir dizi yapıldı. Spektrograf ve doğrusal dizi PMTs ile birlikte 400 16 üst üste spektral bantlarında sinyal kaydedebilir yeteneği teklif nm 600 nm, 12,5-nm aralıklarla. Bu nedenle, TPEF ve SHG sinyalleri aynı zamanda tespit ve spektral etki alanlarına ayrılmış. Ayrıca, 3D görüntüleme için görüntüleme derinliğini kontrol etmek için bir Aksiyel motor kullanıldı. Her resmin 512 x 512 µm için kuruldu ve derinlik aralığı 2 µm (kontrol grubu, 5 mikron) kuruldu. Özellikle, her kusur 5 sitelerinde istatistiksel olarak anlamlı veri toplamak için yansıma ve seçilen görüntü siteleri kusur eşit ve rastgele dağıtıldı.
  4. Damar oluşumu ölçmek için istatistiksel olarak anlamlı veri toplamak üzere her kusur sitelerinde tarama 5.
    1. Kullanımı tarama siteleri kusur eşit ve rastgele dağıtılmış. Kontrol grubu için orijinal kemik alan ve defekt kenarından (FOV) kapak görüntüleme alanında sahip ama PH ve PHp grubu için FOV implante iskele üzerinde olan.
    2. Bir neşter kullanarak bir 1 cm doğrusal cilt kesi yapmak ve açık cilt nakli site ortaya çıkarmak için fiksasyon için dikiş. Bir damla su daldırma objektif ve su bardağı oluşturmak üzere nakli arasında yerleştirmek için bir şırınga kullanın.
  5. Edinme resmi yığar her 12 dönem Imaging bir 2s bitti. Görüntülemek ve özel bir MATLAB programı kullanarak hacimsel veri analiz ve ImageJ yazılım 34 , 35 ile kan damarı alanları ölçmek.

7. Gen ifade analizi pdgf-b ve anjiogenezi ilgili genler tarafından RT-qPCR

Not: PCR gerçekleştirilen her zamanki adımları takip: 30 95 ° C s, 40 devredir 5 95 ° c s ve 30 s. Post-PCR erime için 60 ° C tek hedef amplifikasyon özgüllük eğrileri doğruladı ve β-aktin göre faiz gen kat değişikliği tespit edildi. Tepki her örnek için üç kez test edildi.

  1. Hasat implante iskele ve deneysel fareler 2, 4 ve 8 hafta sonrası işlemi 36 dokulardan; grup örnekleri kontrol (n = 4), aynı zaman zamanlarda alınan, bitişik kemik dokusundan olmalıdır.
    Not: her zaman noktası (2, 4 ve 8 hafta), CO 2 inhalasyon ile fareler euthanized. Calvaria incelemek ve, daha sonra kaldırmak ve calvaria dan implante iskele hasat.
  2. Her örnek üreticiye göre toplam RNA ayıklamak için ticari bir reaktif kullanın ' s protokolü. Tersine çevirmek için ters transkripsiyon seti kullanın-RNA üretici takip cDNA uyarlamak ' s protokolü.
  3. SYBR yeşil algılama sistemi; kullanarak gerçekleştir nicel gerçek zamanlı PCR astar Tablo 1 ' de listelenen.
Primer(5'–3')
Gen İleri ters
pdgfb CATCCGCTCCTTTGATGATCTT GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT
vWF CTCTTTGGGGACGACTTCATC TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC
VEGFR2 GAAATGACACTGGAGCCTACA AG TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G
β-aktin GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT

Tablo 1: Pimer kümeleri.

8. kemik rejenerasyon analizini MicroCT

  1. 8 hafta sonrası operasyonda CO 2 inhalasyon ile Euthanize fareler. İyi havalandırılmış bir ortamda, yavaşça her fare temiz fare kafesin içine yerleştirin ve ötenazi önce fareler uyuşturan kafes içine CO 2 gaz pompa.
  2. Kafatası kemik defekti bölgesinin microCT görüntüleme için incelemek. Kullanıcı aşağıdaki tarama parametrelerini deneylerde: 9 µm çözünürlük, Al 0,5 mm filtre, 50 kV gerilim ve 142 µA geçerli.
  3. ReconYapı ticari yazılım kullanarak tüm görüntüleme verileri şirket tarafından sağlanan. CTAn yazılım kalibrasyon işlevini kullanarak tarar kalibre.
    Not: her taramada Hounsfield birim (HU) fareler altında yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silindirik gözenekli PLGA/nHAp 0.6 mm içinde yükseklik iskele ve 4 mm çapında bir 3D printerlere harcama maddeler ile fabrikasyon. İskele türleri Morfoloji elektron mikroskobu ve microCT tarama yolu ile analiz edildi. Şekil 1A implante iskele fotoğrafı gösterir. MicroCT tarama fazla % 85 gözenekleri 200 ile 400 µm (şekil 1B) bedenleri vardı ortaya koydu. SEM görüntüleme iskele yüzeyinin İskele (şekil 1 D-F) içinde birbiri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik sürekli iyileştirmek ve bir bireysel1ömür boyu yeni model için benzersiz bir kapasite ile son derece bozukluklarına bir dokudur. Vaskülarizasyon düzeyini osteogenesis ve arıza onarım için önemlidir. Düşük vaskülarizasyon kemik doku Mühendisliği geniş klinik uygulama sınırlar. Son derece bozukluklarına doku Mühendisliği kemik Biyomimetik teorisine göre inşa büyük kesimi kemik kusurları onarmak için bir araç haline gelmiştir. İskele çeşitli nispeten küçük kemik defektleri onarmayı başarıyla uy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Shenzhen tavus kuşu Program tarafından Çin (No. 110811003586331), Shenzhen temel araştırma programı (No desteklenmiştir JCYJ20150401150223631, No. JCYJ20150401145529020 ve No JCYJ20160331190714896), Guangdong ortak araştırma ve kapasite geliştirme özel Program (No. 2015A020212030), Çin (No. 81501893) Ulusal Doğa Bilimleri temeli, Çin (2013CB945503), ulusal Major Basic araştırma programı ve Mükemmel genç araştırmacılar (Y5G010) için SIAT yenilik Program.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Poli (D, L-laktid-ko-glikolid) (PLGA)SigmaP1941L / G oranı 75:25, MW 66000-107000
Hidroksiapatit nanopartiküllerSigma702153Ortalama çap < 200 nm
Klorokin difosfat tuzuSigmaC6628
FITC-konjuge 250-kD dekstranSigmaFD250S
1,4-dioksanlingfeng, Şangay0.45 mikron
Stericup filtreleriMerck Millipore CorporationSLHV033RB
PDGF-BB Cdna SinoBiological, IncMZ50801-G
Anti-PDGF-BB fare poliklonal antikoru& nbsp; BioVision, Inc5489-30T
PDGF-BB rekombinant protein4489-50
Kalsiyum-fosfat transfeksiyon çözeltisiPromega CorporationE1200
L-DMEMHidroklonSH30021.01
DPBSHidroklonSH30028.01
Penisilin-Streptomisin, SıvıThermo Fisher Scientific
FBSThermo Fisher Scientific10099-141
Transwell Corning3422
Erkek BALB / c fareleriGuangdong Tıbbi Laboratuvar Hayvan Merkezi 
sodyum pentobarbital Merck1063180500
multifoton mikroskobuİki foton uyarılmış floresan (TPEF) ve ikinci harmonik üretim sinyalini (SHG) tespit etmek için Shenzhen İleri Teknoloji Enstitülerinde bir ev yapımı.
izofluranKeyuan, Shandong401750169
TRIzol reaktifiInvitrogen15596018
PrimeScript RT Master Mix (Mükemmel Gerçek Zamanlı)TakaraRR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)TakaraRR036B
Hematoksilen ve eozinBeyotimeC0105
ParafinLeica & nbsp;RM2235
Ultrasantrifüj OPtima L-100XPBeckman CoulterL-100XP
Düşük sıcaklık yazıcısı Tsinghua üniversitesiTsinghua üniversitesinde ev yapımı
bir LightCycler 480 enstrümanı Roche5815916001
microCTBruker1176
ticari yazılımıBruker
Buprenorfin
15140122

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
  2. Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
  3. Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
  4. Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
  5. Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
  6. Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  7. Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
  8. Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
  9. Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
  10. Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
  11. Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
  12. Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
  13. Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
  14. Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
  15. Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
  16. Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
  17. Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
  18. Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
  19. Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
  20. Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
  21. Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
  22. Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
  23. Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
  24. Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
  25. Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348(2011).
  26. Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
  27. Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
  28. Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
  29. Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
  30. Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
  31. Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
  32. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
  33. Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
  34. Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4(2015).
  35. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  36. Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
  37. Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
  38. Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
  39. Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
  40. Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multiphoton MicroscopyAngiogenesis VisualizationPLGA nHAp ScaffoldCalvarial Bone DefectLentiviral Vector DeliveryIn Vivo ImagingBlood Vessel AreaFlow Cytometry AnalysisMicroCT Bone FormationGenetic Scaffold Modification

İlgili makaleler