Yöntem makalesi

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi İn Vitro İnsan Kan-beyin bariyeri Model

DOI:

10.3791/55390

⸱

5 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, lenfositlerin merkezi sinir sistemine in vitro göçünü araştırmayı sağlayan bir insan kan-beyin bariyeri modelini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içine Lenfosit ekstravazasyon immün gözetim için kritiktir. lenfosit ekstravazasyon hastalığa ilgili değişiklikler CNS'de patofizyolojik değişikliklere neden olabilir. Böylece, CNS içine lenfosit göç soruşturma inflamatuar CNS hastalıkları anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek önemlidir. Burada lenfosit ekstravazasyonu çalışma insan kan-beyin engelinin bir in vitro model sunmaktadır. İnsan beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (HBMEC) confluently, kan-beyin bariyerinin endotelyumu taklit etmek için eklemek Transwell gözenekli polietilen tereftalat yetiştirilmektedir. Bariyer fonksiyonu zonula occludens immünohistokimya, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri olarak Evans mavisi nüfuz analizi ile doğrulanır. NK hücrelerini - Bu model, / dim CD56 parlak CD16 gibi nadir lenfosit alt grupları diyapedezin soruşturma sağlar. Furthermcevher, diğer hücrelerin, sitokinler ve kemokinlerin, hastalıkla ilişkili değişiklikler ve lenfosit göç kapasitesine belirgin bir tedavi yönteminin etkinliği incelenebilir. Son olarak, endotel bariyere üzerinde iltihabı etkiler etkisi yanı sıra, farklı tedavi rejimleri analiz edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dokulara kan lenfosit göçü immün gözetim için çok önemlidir. Özel molekül etkileşimleri sonunda bir dizi ince bağırsak, deri, lenf düğümleri, merkezi sinir sistemi (CNS) ve diğer dokular 1 içine alana özgü ekstravazasyonu sağlamaktadır. Lenfosit göçü değişiklikler yaygın hastalıklar 2 bir dizi patofizyolojisinde rol oynamaktadır. Immün öncelikli CNS'ye Geçiş sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve buna göre bu işlemin değişiklikler ensefalomiyelit 3, neuromyelitis optica, inme ve multipl skleroz (MS) 2, 4, 5, 6, 7 gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar dahil olmaktadır. Nedenle, daha iyi hastalık patofizyolojisinin ve araçları geliştirmeye lenfosit ekstravazasyondan incelemek için önemlidir hastalık yükü 8, 9, 10, 11, 12 ıslah.

Lenfositler farklı yollardan CNS içine göç ederler. Kan-beyin bariyeri koroid pleksus içinde ve boyunca, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyer subaraknoid boşluk içine postkapiler venüllerde yoluyla damar dışına 1, 13, 14, 15 tarif edilmiştir. Kan-beyin bariyeri boyunca geçiş endotel hücreleri 14 lenfositlerin etkileşimi ile yürütülür. periferde endotelyal hücrelere aksine, merkezi sinir sisteminin endotel hücreleri, böylece sıkı bir kan-beyin bariyerini geçme kabiliyetine sahip olan hücreleri ve protein miktarının sınırlandırılması, sıkı bağlantı moleküllerinin yüksek miktarda ekspreselass = "xref"> 16. sıkı bağlantıları gevşemesine iltihabı sonuçları ve yapışma moleküllerinin ifadesini indükler; Bu şekilde, merkezi sinir sistemi 1, 17, 18 içine lenfosit göçünü artar.

Kan-beyin bariyeri üzerinden damar dışına çok aşamalı bir süreçtir. Endotel hücreleri için ipi lenfositler ve daha sonra esas olarak selektinler 1, 15 kaynaklı bir işlemde endotel boyunca rulo. Daha sonra, lenfositler üzerinde ifade edilen endotel tarafından salgılanan kemokinlerin ve ilgili kemokin reseptörlerinin arasındaki etkileşimler endotel hücreleri 1 yapışmasını teşvik integrinlerin uyumsal değişiklikleri başlatır. Son olarak, perivasküler boşluğa transmigrating önce kan akışına karşı endotelyal engeli boyunca her iki taramayı lenfositler ya da hemen ve doğrudan doğruya şanzıman durakfirması yapışma 1, 19, 20 bölgesinde igrate. Lenfosit ekstravazasyon Tüm bu olaylar farklı teknikler 21 kullanılarak in vitro analiz edilebilir. Zaman atlamalı video mikroskopi başlangıç tethering'i ve 15 haddeleme incelemek için kullanılır. Adezyon tahliller engelleri 22 endotel firma tutuklama ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Burada gösterildiği gibi transmigrasyon tahlilleri, bağışıklık-hücre göçüne 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 analizini sağlar.

In vitro kan beyin bariyeri modelinde insan kullanarak, daha yüksek bir MIGR olduğunu göstermektedir geçenlerde olabilirCD56 parlak CD16 arasında atory kapasitesi / dim - NK hücrelerini CD16 + muadilleri intratekal bölme 21 bu NK hücresi alt-kümesinin bir ağırlığı tarafından yansıyan dim bunların CD56 ile karşılaştırıldığında. Böylece, bizim deney düzeneği in vitro durumu taklit etmek uygun görünmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre İnsan Beyin mikrovasküler endotel hücreleri Kültürü (HBMEC)

  1. hücre kültürü şişelerinde kaplanması
    1. Fibronektin, bir çözelti hazırlamak bir 15 mL santrifüj tüpüne 10 ml PBS ekleyin. 150 ul fibronektin ekleyin ve iyice karıştırın.
    2. alt kapak için bir T-25 hücre kültür şişesi fibronektin çözeltisi 2 ml. kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de en az 3 saat boyunca hücre kültür şişesi inkübe edin. Fibronektin kaplanmış şişeler 37 ° C /% 5 CO2 ile 2 hafta boyunca depolanabilir.
  2. Tohumlama ve HBMEC hücre kültürü
    1. Hücre kültür şişesi altından aspire fibronektin çözeltisi. 6 ml ECM-b ortamda süspansiyon haline getirilmiş 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² ekle (= ECM-b,% 5 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ile takviye edilmiştir). 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. Bir mikroskop kullanılarak günlük hücre büyümesini kontrol edin.
    2. 3 günde ortamı değiştirin.Hasat veya HBMEC yaklaşık% 80 konfluansa ulaşmalarına bölünmüş hücreleri. HBMEC fizyolojik özellikleri kaybını önlemek için geçit 1 ile 15 arasında kullanılmalıdır.
  3. Hasat HBMEC.
    1. 1 oranında PBS ile Accutase (1x) ile muamele Accutase çözelti hazırlayın: 1 arasındadır. sonraki kullanıma kadar bir su banyosu içinde 37 ° C 'de Accutase çözüm tutun.
    2. 15 ml santrifüj tüpüne hücre kültür şişesi ECM-b ortamı aktarın. Hücre kültür şişesinin dibinde 5 ml PBS ilave edilerek HBMEC yıkayın. PBS aspire ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın.
    3. 2 mL Accutase önceden ısıtılmış solüsyonu ekleyin. 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Sonrasında HBMEC sıkıca hücre kültürü şişesi birkaç kez dokunarak yeniden askıya alınır. Hücre kopması, bir mikroskop kullanılarak kontrol edilir
    4. Daha önce, bir 15 ml tüp içinde saklanan ECM-b-orta kısa HBMEC ayırmak için başlangıç ​​olarak geri hücre kültür şişesi içine ilave edilir. En HBMEC kadar tekrar tekrar şişenin alt durulayınyeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
    5. 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 mL ECM-b ortamda hücrelerin yeniden askıya. Hücre sayımı ve ml ECM-b ortamı başına 3 x 10 5 HBMEC bir son konsantrasyon elde etmek için bir hücre süspansiyonu seyreltin.

Hücre Kültürü ekler 2. hazırlanması

  1. hücre kültürü ekler kaplanması
    Önemli not: hücre kültürü ekler zarını dokunmaktan kaçının.
    1. Her bir hücre kültürü eki 100 uL fibronektin çözeltisi (1.1.1 bakınız) (Şekil 1A) ve bir 96-gözlü düz tabanlı plakanın bir kuyu (optik kontrol çukur) ekleyin. 37 ° C'de en az 3 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon aspirat fibronektin çözeltisi sonra.
    2. 100 uL HBMEC hücre kültürü ekler süspansiyonun ve iyi optik kontrol ekleyin. Hücrenin alt bölmeye 600 ul ECM-b orta ekleyinkültür ekleri. , 37 ° C / 5 bariyer bütünlüğünü (Şekil 1B) kadar% CO2 ulaşıldığında 4 gün de optik kontrol HBMEC mikroskopik değerlendirme hücre büyümesini kontrol - 3 inkübe edin. Not: Dört gün ötesinde Hücre büyümesi önerilmez.
    3. İsteğe bağlı: enflamatuvar koşulları taklit etmek için alt bölmeden orta aspire ve 24 saat göç deneyi öncesinde 500 U / ml IFN-γ / TNF-a ile takviye ECM-b ortamı ile değiştirin.

Hicret Testinin gününde Evans Blue ile 3. Kalite Kontrolü

  1. Evans mavisi çözeltisinin hazırlanması
    1. 15 ml santrifüj tüpü kullanılarak 200 ul B27 eki ile, PBS / B27 çözeltisi karışımı 10 ml PBS hazırlamak. Evans mavi stok çözeltisi ile seyreltilir (20 mg / ml PBS) 1: PBS / B27 1.000.
  2. Evans mavisi geçirgenlik deneyi
    1. Üst bölme, ardından alt bölmeden orta aspirekonfluent tek tabaka HBMEC ihtiva eden bir hücre kültürü ucun. hücre kültürü eki 100 mcL Evans mavisi solüsyonu ekleyin.
    2. Alt bölmeye 600 uL PBS / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Dikkatle forseps kullanarak hücre kültürü eki çıkarın.
  3. Evans mavisi ölçüm
    1. alt bölme PBS / B27 çıkarın ve siyah bir polistirol 96-gözlü düz dipli levhanın iki oyuklarına 100 uL her aktarın. bir Tecan Sonsuz M200 Pro plaka okuyucuda plaka yerleştirin ve optimal z konumunu belirler.
    2. (Örneğin: eksitasyon: 620 nm, emisyon: 680 nm, bant genişliği eksitasyon: 9 nm, emisyon bant genişliği: 20 nm, 175x geliştirme, 25 yanıp söner, entegrasyon süresi: 20 us) Evans mavisi kullanılarak ilgili ayarlar Ölçü uyarım.
    3. HBMEC bariyer fonksiyonu tohum sonra farklı zaman noktalarında HBMEC boyunca Evans mavi geçirgenliğini tasvir eden bir standart eğriye elde edilen veriler karşılaştırma belirlemek içining hücreler (sağ Şekil 1B).

4. Yer değiştirme tahlili

  1. periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) hazırlanması.
    1. 15 ml lik santrifüj tüpüne 10 ml RPMI ekleyin ve 200 uL B27 ek ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'de PBMC ve santrifüj hücreleri sayın. 5 x 10 6 hücre / ml RPMI / B27 bir nihai konsantrasyona kadar PBMC yeniden askıya.
  2. göç deneyi kunnak
    1. Konfluent HBMEC mono tabakalar (Şekil 1A) ihtiva eden hücre kültürü eklerin üst bölme ve ardından alt bölmeden orta aspire. Donör başına başına 24 oyuklu plakanın bir oyuk (in vitro kontrol), hücre kültürü ekler 100 uL PBMC süspansiyonu, her ekleme ve.
    2. In vitro kontrol ait PBMC hücre kültürü ekler ve 500 uL alt bölmeye 600 uL RPMI / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 de 6 saat inkübe edilir.
  3. Taşınan PBMC'nin Hasat
    1. forseps kullanılarak hücre kültürü eki çıkarın ve dikkatli bir şekilde membran dokunmadan 400 uL PBS ile alt yıkayın. Hücre kültürü eki atın.
    2. 20 uL akış sayısı flüoro ekleme hücre kültürünün alt bölüme (yaklaşık 1.000 boncuk / uL) in vitro kontrol için hem de eklemek ve iyice karıştırın. borular akış sitometrisi PBMC süspansiyonun devri 1 ml.

5. Akış Sitometri

  1. örnek hazırlama
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin PBMC.
    2. 100 ul florokrom-eşlenik antikorlar ekleyerek antikor çözeltisi hazırlayın numune başına (PBS /% 1 BSA / 2 mM EDTA) içinde tampon akış sitometrisi. 1 uL CD4-FITC aşağıdaki sonuçları elde etmek için, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5 @, 1 uL, CD56-PY7, 1 uL CD8-A700 ve 1 uL CD16-A750 numune başına kullanılmıştır.
    3. PB Re-askıyaAntikor çözeltisinin 100 uL MC ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
    4. 250 uL, 5 dakika boyunca 300 x g'de tampon ve santrifüj akış sitometrisi ekleyin.
  2. Numune toplama
    1. gereken miktarda PBMC askıya yeniden akış sitometrisi tampon maddesiyle (kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişir).
    2. akış sayısı flüoro tespit etmek için 525 ile 700 nm dalga boyunda arasında aktif detektörü ile akış sitometresiyle lekeli PBMC Edinme (eksitasyon 488 nm, emisyon 525-700 nm).
      (Aşağıdaki adımlar Kaluza G yazılımı ile çalışan sitometresi Gallios akış kullanıldığında bir örnektir. (1) başlatın işletim sistem tamamen dolu olduğu zaman (2), renkli "sitometresinde" tuşuna basarak akış sitometresi başlangıç . (3) "açık protokol" düğmesine basarak ilgili edinim protokolünü yükleyin. (4) gerekli protokolü seçin ve "açık" seçeneğini seçin. (5) sağ ile tıklayarak her numune için protokol çoğaltınSanal atlıkarınca ve "yinelenen" sahada sol klik görünür protokolüne fare düğmesi. (6) örnek bir liste her bir örnek olarak etiketleyin. (7) döner piramit belirtilen pozisyonlarında örnekleri aktarın ve satın alma başlar.)
  3. Numune analizi
    1. İlgili yazılım kullanarak veri sitometrisi Açık çıkan akışı. In vitro kontrol gözlerinden elde transmigrant PBMC ilgi olarak hücre alt popülasyonlarının sayısını belirler ve ilgili analiz yazılımı kullanılarak sayım flüoro akar.
      (Yolluk stratejinin bir örneği (Şekil sonuç bölümünde 1 C verilmiştir: İleri saçılma kanalı (FSC) grafiği yana doğru bir dağılım kanalı (SSC) içerisinde lenfositleri seçmek için, ilk, NK-hücre alt setlerinin bir transmigrasyonu, analiz etmek lenfositlerdir. daha sonra bir CD56 grafiği CD3 ve CD56 +, CD3 görüntülenen -. NK hücreleri seçilmektedir NK-hücre alt kümeleri arasında ayrım yapmak için, NK hücreleri de gösterildiBir CD56 CD16 karşı grafiğidir ve CD56 parlak CD16 / dim - hem de CD56 loş CD16 + NK hücreleri seçilmektedir. Buna ek olarak, akış sayısı florosferler bunların sayısını belirlemek için zamana karşı 525 ila 700 nm arasında bir emisyon ile bir kanalın bir arsa görüntülenen daha sonra FSC SSC karşı grafiğinden seçilir ve.)
    2. Her numunenin toplam hücre sayısını hesaplamak için, akış sayısı flüoro kullanarak hücrelerin tespit sayısını normalize:
      figure-protocol-1
    3. Toplam geçen hücre ve in vitro kontrol toplam hücrelerin arasındaki oran olarak yayılan hücrelerin yüzdesini belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NK-hücresi ve insan kan-beyin bariyeri modeli (Şekil 1A) kullanılarak T-hücresi alt kümelerinin bir transmigrasyonu, Örnek teşkil eden sonuçlar gösterilmektedir. HBMEC tek tabaka bütünlüğü sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçülmesi, ve Evans mavisi geçirgenlik (Şekil 1B) lekelenmesi ile doğrulandı. 3 sonra - 4 gün kültür HBMEC sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1 (sol Şekil 1B,) olarak ifade edilmiştir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada insan kan-beyin bariyeri üzerinden lenfositlerin tenasüh araştırmak için bir teknik sunar. CNS'ye lenfosit göçü in vitro analizleri, lenfosit ekstravazasyonu, potansiyel hastalıkla ilgili değişiklikler ve yeni terapötik yaklaşımlar temel işlemlerini incelemek için önemlidir.

Kan-beyin bariyeri modelinin çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Örneğin, üst bölmeden hücreleri göç-hücre populasyonunun bileşimini incelemek için analiz edilebilir. Bundan başka, 24 saat önce deney, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar(lar), bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili olarak aşağıdaki potansiyel çıkar çatışmalarını beyan etmişlerdir: A.S.-M. ve U.B.'nin herhangi bir mali açıklaması yoktur. T. S.-H. Biogen'den seyahat ve konferans masraflarını aldı. NS, Biogen ve Novartis Pharma'dan konuşmacı ve danışma kurulu ücretlerinin yanı sıra Biogen'den seyahat masraflarını aldı. HW, Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis ve Sanofi-Genzyme'ın Bilimsel Danışma Kurullarında/Yönlendirme Komitelerinde görev yaptığı için tazminat aldı. Ayrıca Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis ve Sanofi-Genzyme'den konuşmacı fahri ve seyahat desteği aldı. Biogen, Merck Serono, Novartis ve Sanofi-Genzyme'den danışman olarak tazminat aldı. H.W. Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Almanya ve Sanofi ABD'den araştırma desteği aldı. CCG, Genzyme, Novartis Pharma GmbH ve Bayer Health Care'den toplantılara katılmak için konuşmacı ücreti ve seyahat masrafları aldı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, "Multipl Sklerozda Düzenleyici Mekanizmalara Karşı Başlatıcı/Efektör-Hastalıkla Mücadeleye Doğru İlerleme" İşbirlikçi Araştırma Merkezi CRC TR128 tarafından desteklenmiştir (Proje A9'dan H.W. ve C.C.G.'ye, proje B1'den N.S.'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PBSGibco14190-094CaCl 2 < / sub> veya MgCl < sub > <2 / sub >
Sığır plazmasından1 mg / mLSigmaF1141-5MG
T-25 hücre kültürü şişesiGreiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBS ScienCell1001-b
Penisilin / StreptomisinScienCell1001-b
Endotel hücre büyümetakviyesi ScienCell1001-b
TranswellCorning3472şeffaf, 6.5 mm çap, 3.0 & mikro; m gözenek boyutu
96 oyuklu düz alt plakaCorning3596
Evans blueSigmaE2129-10Gstok çözümü: 1 g/50 mL PBS
B27Gibco17504-04450x konsantre
Infinite M200ProTecan
96 oyuklu siyah düz tabanlı plakaGreiner BioOne675086
48 oyuklu plakaCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Akış Sayısı FlorosferlerBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios 10 renkli akış sitometresiBeckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-&alfa;Peprotech300-01A
IFN-&gama;Peprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430klonu UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692klonu N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330klonu 3G8
CD4-FITCBiolegend300506klonu RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332klonu B9.11
olmayan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24(2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160(2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Beyin Mikrodamar Endotelyal H creleriTransendotelyal Elektriksel DirenEvans Blue Ge irgenli iAk Sitometrisi AnaliziCD56bright CD16dim NK H crelerinterferon Gama TNF AlfaStromal Vask ler Fraksiyon zolasyonuH cre K lt r nserti Haz rlama

İlgili makaleler