Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

12.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55396

⸱

15 Şubat 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The MARCS Institute, Western Sydney University, 2School of Medicine, Western Sydney University

Bu makalede

Özet

8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde> 24 saat boyunca uzatılabilir.

Özet

Diseksiyon Aşağıdaki 8 saat - nöronal doku preparatları, beyin kesitleri ve retina wholemount akut, genellikle 6 korunabilir. Bu deneysel zaman sınırlar ve çalışmanın başına kullanılan hayvanların sayısını artırır. Bu tür banyo uygulanan boyalar ile uzun süreli ön inkübasyon gerektiren kalsiyum görüntüleme gibi Bu sınırlama, özellikle etkiler protokolleri. 3 içinde Üstel bakteri üremesi - dilimleme sonra 4 saat sıkı doku sağlığı bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışma, büyüme faktörlerini içeren antibiyotiklere steril prosedürleri ya da doku kültürü ortamı gerek kalmadan zaman uzun süreli (> 24 saat) için geçerli nöronal doku sağlamak için, akut preparasyonlarda bakterilerin üremesini sınırlamak için bir yöntem tarif eder. UV ışınlaması yoluyla dışı sıvıyı bisiklet ve 15 özel tutma odasında doku tutarak - 16 ° C, doku elektrofizyolojik özellikleri, veya kalsiyum si fark gösterir> 24 saat postdissection hücre içi kalsiyum boyalar ile gnaling. Bu yöntemler akut nöronal doku kullananlar için deneysel süresini uzatmak kalmayacak, ama deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvanların sayısını azaltacak ve akut nöronal doku inkübasyon için bir altın standart ayarlar.

Giriş

Elektrofizyoloji ve fonksiyonel görüntüleme (kalsiyum, gerilim duyarlı boyalar) nörobilim alanında en sık kullanılan deneysel teknikler ikisidir. Beyin dilim hazırlıkları ve burada ele alınacaktır retina wholemount, anestezik veya kas gevşeticiler gelen kirlenme olmadan elektrofizyolojik özellikleri ve sinaptik bağlantı inceleme olanağını sağlamaktadır. Beyin dilimleri ve retina belli devreler ve beyin ağları 1 çalışma sağlayan kültürlerin veya hücre homojenatları farklı olarak, yapısal bütünlüğünü muhafaza wholemount. İzole doku Kayıtlar kalp atışı ve solunum ile ilişkili hareketler olarak in vivo kayıtları üzerinde avantajları ortadan kalkar var. Ayrıca, doğrudan görselleştirme hedef hücre spesifik sınıfları ve farmakolojik araçlar 2, 3 lokal uygulamaya izin verir.

Patch-kelepçe kayıtları ve kalkyum-yükleme boyası retina wholemount Retina Ganglion Hücre (RGC) katmanı kapsar ve hücrelere doğrudan erişimi engeller Membran (ILM), Sınırlama İç varlığı ile karmaşık. Tipik haliyle, bu membran, tek bir hücre üzerindeki bir gigaohm contanın bir yama pipet ve oluşum doğrudan uygulamaya izin vermek için bir cam pipet ile kazınarak. Buna ek olarak, küvet uygulanan kalsiyum boyalar ILM geçmez ve ya retrograd optik sinir 5 aşağıdaki enjeksiyon taşınan veya dokuya 6 boyunca elektroporasyon, bu zarın 4 altından enjekte edilmelidir. Retinitis pigmentosa kemirgen modeli kullanılırken Dahası, rd / rd fare, ILM daha kalın ve daha aşılmaz olduğunu. Burada, yama-kelepçe recordi için retina ganglion hücrelerinin her yerde kalsiyum boya yükleme ve doğrudan erişim hem de izin vermek, enzimatik sindirim 7 ile ILM kaldırmak için bir tekniği kullanırNGS 8.

beyin dilimleri veya retina wholemount birinden başarılı kayıtları diseksiyon ve canlı nöronal doku inkübasyon bağlıdır. Tipik olarak, doku, deney sabahı ekstre edilir ve kayıt için kullanılana kadar yapay serebrospinal akışkan (CSF) 'de inkübe edilmiştir. Bu zaman penceresinde aşağıdaki önemli ölçüde bozulma ile, 8 saat - Genellikle, doku 6 canlı kalır. Ancak, beyin dilimleri ve wholemount retinae hazırlıkları hem genelde bu kısa süre içinde kaydedilebilir daha fazla doku üretir. Sonuç olarak, bağ, genellikle gün sonunda atılır ve diseksiyon sonraki günlerde daha tamamlanır. Bu, başka bir hayvan kullanılmıştır ve kurulum ve diseksiyon / tekrarlanan boyama ~ 2 saat demektir. Aşağıdaki protokol kullanılmaktadır daha az hayvan anlamına fazla 24 saat boyunca, nöronal dokuda ömrünü uzatmak için bir yöntem tarif eder, ve daha çok deneysel kez mevcuttur. Doku canlılığını Welektrofizyolojik özellikleri ve kalsiyum dinamikleri kayıt yoluyla değerlendirilir ve bu özellikleri <4 saat ve> 24 saat postdissection arasındaki ayırt olduğu gibi.

Bu sonuçlar, uzun inkübasyondan sonra tek hücre özellikleri bozulmamış ve işlevsel değil sadece gösteriyor, ancak kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar ile değerlendirilen ağ etkinliği, 24> değişmeden saat postdissection olduğunu. Ayrıca, kalsiyum boyalar herhangi bir zararlı etkiye neden olmadan uzun süreli dönemler için hücrelerde kalır olduğunu göstermektedir. Bu protokolün uygulanması dış çevre yüksek düzenlenir sonra akut nöronal dokuda nöronların fonksiyonel aktivitesi, uzun süreler boyunca muhafaza edilebileceğini göstermektedir. Doku canlılığı nedeniyle farklı inkübasyon protokolleri laboratuarlar arasında büyük farklılıklar Dahası, bu yöntem akut neu sağlığı değişkenliği azaltmak için uygulanması gereken ideal bir parametre için bir altın standardı belirlerronal dokusu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

protokol aşağıda C57BL / 6 ve C3H / He (retinally dejenere) Fare nöronal doku hazırlanmasını tarif, ancak benzer teknikler diğer türlere uygulanabilir. Bütün hayvanlar, sağlıklı ve standart sıcaklık koşulları, nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde, yiyecek ve suya serbest erişim ile ele ve herhangi bir amacıyla güç uyaran olmadan. Bütün deneyler onaylanmış ve Batı Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik komitesi göre yapılan ve hayvan kullanımı ve bakımı ana hatları (Hayvancılık Araştırma Kurumu # A9452, # A10396 ve # A8967) göre edildi.

1. Beyin Dilim Hazırlık

  1. izofluran (% 5) inhalasyon yoluyla hayvan anestezisi ve bir kemirgen giyotin kullanarak başını kesmek. Daha önce 9 tarif edildiği gibi hızlı bir şekilde beyin çıkarın ve buz gibi soğuk fizyolojik çözelti (ACSF) (mM olarak) içine yerleştirin: 125 NaCl, MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25 2.5 KCI, 1NaHCO 3, 25 dekstroz ve karbojen ile doyurulmuş (% 95 O 2/5% CO2 karışımı 310 mOsm, pH 7.4).
  2. titreşimli mikrotom ile 300 mikron kalınlığında, ilgilenilen bölgede, beyin dilimleri kesin.
  3. Daha önce 10, 11 açıklandığı gibi, carbogen akışı ve sıcaklık - yakından izler ve pH düzeyini (7.4 pH 7.2) kontrol eden bir özel inşa kuluçka sistemi dilim aktarın.
  4. 15 ila 35 ° C, ilk reaktör sıcaklığı ayarlama - 30 dakika, ve daha sonra yavaş yavaş 15 azaltmak - Şekil 1C'de gösterildiği gibi, 16 ° C. kadar gerekli sonra ya elektrofizyoloji veya görüntüleme için, kuluçka sisteminin dilimleri kuluçkaya yatmaktadır.
    NOT: dilimleri kalsiyum görüntüleme için kullanılacak ise, RT altında doku soğutmadan önce aşağıdaki adımları izleyin.

2. Retina Wholemount Hazırlama ve İç Limitan Membran Soyulması

  1. Ya normal koşullarda retina wholemounts hazırlayınlaboratuvar aydınlatma koşulları veya loş kırmızı / kızıl ötesi ışık.
  2. servikal dislokasyon ve hemen aydınlatmak gözler hayvan Euthanize. Ames ortam veya ACSF içeren ya küçük ora serrata'dan boyunca kesilmiş ve yer (mM) sağlayın: 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukoz, 0.5 L-glutamin ve karbojen ile doyurun (2/5,% CO2 karışımı% 95 O, ~ 300 mOsm, pH 7.4) ilave edilir.
  3. Hemen küçük bir makas ile ora serrata boyunca kesme ve forseps ile lens ve vitrözü ile kornea, lens ve vitrözü çıkarın. Oda sıcaklığında inkübasyon sistemi doku yerleştirin.
    Not: retinal doku 15 yavaş sıcaklık azaltma sonra, göz fincan korunabilir - ihtiyaç kadar inkübasyon sistemine> 24 saat boyunca, 16 ° C.
  4. Earl's- 30 U / ml papain, 1 mM L-sistin, 0.5 mM EDTA ve% 0.005 DNaz içeren küçük bir cam kavanoza retina içeren göz fincan transfer ILM kaldırmak için20 dakika için 37 ° C 'de dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS). Kapaktan çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 uygulayın, ancak kabarcık yok. Genç hayvanların (<6 hafta) doku kullanılırsa, yarı gücü seyreltilir.
    1. Earl BSS 10 dakika süreyle bir ovomukoid (10 mg / ml) ve BSA (10 mg / ml) çözelti içinde doku yerleştirerek, enzimatik sindirim durdurun. 16 ° C - Yıkama doku iyice aCSF ile inkübasyon sistemine aktarılmadan önce ve 15 sıcaklığını düşürmek.
  5. ihtiyaç kadar göz fincan retina dokusu korumak. mikroskop transfer için, göz bardaktan retina izole ve bir traş bıçağı ile 4 parçalar halinde kesilmiş. Tüm retina gerekiyorsa, düz yalan izin vermek için retinanın periferinde dört küçük kesikler yapın.
    NOT: görüntüleme deneyleri, kuluçka sistemine aktarılmadan önce kalsiyum boya ile yük için aşağıya bakın.

3. enkubatörde Doku bakımı

  1. PH ve sıcaklık ölçümleri için sondaları (Şekil 1A, B) içeren ana odasında Yeri doku.
  2. Çözelti içinde kayan bakteri saçmak için (5W / 2P sterilizatör UV lambası, 254 nm), ana bölmeden izole edilmiş ve UVC ışığı B 1.1 maruz (daha önce tarif edildiği gibi 12 inşa UVC odası), bir ikinci bölme ile aCSF sirküle (Şekil 1A). aCSF aşırı ısınmayı önlemek için 30 dakika - her 15 dk 15 ila 26 değişen zamanlarda ON döner rastgele özelliğini kullanarak programlanabilir zamanlayıcı ile kontrol UVC ışığı zamanlama.
  3. 12 ml UVC odasında akış hızını ayarlamak / dk önce olduğu gibi 12 bildirdiler. nöronal dokulara zarar verebilir odasının dışında UVC aydınlatma önlemek için alüminyum folyo ile UVC odasına örtün.
    NOT: koyu adapte retina dokusunun için, ışık dışlamak için ana odaya ısmarlama kapak uygulayın.
  4. Sirkü bir peristaltik pompa kullanmakte iki odaları aracılığıyla çözüm (CSF) ve 0 aralığında istenilen sıcaklıklara serin veya ana odayı ısıtmak birine soğutucu Peltier termoelektrik soğuk plaka - 50 ° C. Uzun vadeli canlılığı için 16 ° C - Optimum doku inkübasyon için, 15 kullanın.

4. Kalsiyum Boya Yükleme

  1. Bireysel araştırmacının tercihine göre kalsiyum boyalar seçin. Burada Fura-2AM, Flu-8 am veya Flu-4 am kullanın. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, diğer boyalar için uygulanabilir: 1 mM solüsyonu ve% 1 blok kopolimerleri DMSO içinde kalsiyum boyalar çözülür (örneğin, pluronik asit 127), 10 dakika boyunca son bir 50 uL hacmi ve sonikasyon.
  2. Retina 10 uM, beyin kesitleri% 0.01 blok kopolimerleri ve 20 uM (retina),% 0.02 blok kopolimerleri nihai konsantrasyona aCSF çözüm ekleyin. F; 37 ° C (Fura-02:00) ya da oda sıcaklığında (Fluo-4 AM genç hayvanlarda, 45 dakika için banyo yükten retinae (papain muamele edilmiş) ve beyin dilimleriluo-08:00).
    1. yetişkin hayvanların, (> 12 haftalık) için doğrudan beyin dilimleri üzerine boyalar (50 uL) pipet ve derin katmanlarına boyanın daha iyi nüfuz izin vermek için 75 dakika boyunca muhafaza edilir.
    2. Boya inkübasyon sırasında su altı dilim yeterli oksijen sağlamak için, aCSF 2.5 mL içinde seyreltilmiş kalsiyum boyalar ile kapalı bir kapak (çap 2.5 cm, dairesel kavanoz, 3,5 cm yükseklik) olan bir cam yükleme bölmesine hazırlar. % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli oksijen. kabarcık etmeyin.
  3. Deneysel kullanıma kadar 16 ° C - boya yükleme sonrasında yavaş yavaş 15 sıcaklığını düşürmek, kuluçka sisteminin aCSF ve transfer ile doku yıkayın.

5. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Görüntüleme

  1. mikroskop altında dalgıç bir kayıt odasına doku yerleştirin ve 4 bir akış oranında oksijenli ACSF serpmek - RT (~ 22 ° C) ya da fizyolojik sıcaklıkta 5 mL / dakika, ya (~ 35 ° C). Holgerilir ve altın veya platin tel U şeklinde bir parça üzerinde yapıştırılmış bir naylon veya altın parçacıkları imal 'harp' özel yapılmış kullanılarak yerine D dokusudur.
  2. elektrofizyoloji için:
    1. 5-6 MQ nihai direncini elde etmek için bir mikropipet çektirmenin kullanarak 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın.
    2. Daha önce 13 açıklandığı gibi iç çözümü 4 mcL ve bir CCD kamera kullanarak kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrast (IR-DIC) altında hücrelerin görselleştirmek - 3 pipet doldurun. Hücre içi çözüm dikkatlice deneysel sonuçlar elde etmek için her bir deney uygun olmalıdır.
    3. Pozisyon pipet, pozitif basınç korurken bir micromanipulator kullanarak bir hücre zarında yer alan, pipet tutucu bir emme portu aracılığıyla başvurdu. ILM retina kaldırıldı beri, önceden zar kazıma gereklidir. Pipet hücre üzerinde sonra, nazik negatif uygulamakpipet basınç gigaohm mühür elde etmek. Daha sonra bir negatif basınç kısa bir miktarı ile, hücre zarı yırtılabilir.
    4. uygun şekilde standart teknikler kullanılarak bütün hücre akım-veya voltaj-kelepçe kayıtları sağlayın.
  3. Kalsiyum-görüntüleme:
    1. Fura-2 oran ölçer görüntüleme için, 340 nm ve 380 nm düzeyindeki uyarıcı dalga uzunluklannda sağlamak için bir ultra-yüksek hızlı dalga değiştiriciyi kullanın. 510 ± 20 nm emisyon filtresi aracılığıyla tek tek hücrelerin yayılan ışığı geçirin ve bir yüksek hassasiyet, yüksek hızlı dijital kamera ile yakalamak.
    2. 550 nm bant geçiren filtre - Bir 515 ile 490 nm bant geçiren filtre ve yayılan ışık - Flu-4, filtre uyarma 460 ışığın tek bir dalgaboyu için. En hızlı ve en hassas kayıt için böyle bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanın. gerektiği gibi görüntü kazanır.
    3. zamanın bir fonksiyonu ya tek bir dalga boyunda (Fluo-4) ya da dalgaboyu oranı kullanılarak floresan değişiklikleri ölçmekyöntemi (Fura-2), daha önce, 14 8 hazırlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnkübasyon sırasında aCSF bakteri yükü ve sıcaklık sıkı regülasyonu nöronal doku canlılığını korumak için şarttır. 16 ° C (Şekil 1) - Bu UVC ışığı ile ışınlama ve 15 aCSF sıcaklık muhafaza ile optimize edilebilir. (Şekil 1C APS), takip edildiği takdirde arasındaki değişkenliği azaltacak nöronal doku, kuluçka sırasında böylece parametreler için bir altın standart sunan, çevre koşullarının bir rekor (pH ve sıcaklık.) Ile deneyci sağlar Ayrıca, aCSF damga p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, böylece deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması, görüntüleme ve elektrofizyolojik deneyler için akut nöronal doku canlılığını uzatmak için bir kuluçka yöntem açıklanır. İki ana süreçleri zamanla nöronal doku bozulmasını yöneten: i) artan bakteri düzeyleri ve serbest bakteriyel endotoksin eşlik eden artış ve travmatik dilimleme işlemi 10 aşağıdaki ii) eksitotoksi. Akut nöronal doku çevre savunmasız olduğundan, pH, sıcaklık ve bakteri seviyelerinin yakında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yossi Buskila ve Paul Breen, akut sinir dokusu için kuluçka sistemleri oluşturma konusunda uzmanlaşmış bir şirket olan PAYO Scientific Pty Ltd'nin ortak sahipleri olduklarını beyan ederler. Diğer tüm yazarlar, mevcut çalışmayla ilgili herhangi bir mali çıkar veya potansiyel çıkar çatışması bildirmemektedir.

Teşekkürler

Teknik yardım için Colin Symons ve James Wright'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Y.B.'ye ve Western Sydney Üniversitesi'ndeki inovasyon ofisine tohum finansmanı hibesi (WSU) ile desteklenmiştir. M.C., ARC bursu (DECRA) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sodyum KlorürSigma Aldrich VETECV800372
Potasyum klorürSigma AldrichP9333
N-Metil-D-glukaminSigma AldrichM2004 &
D-glikozSigma AldrichG5767
Sodyum bikarbonatSigma AldrichS6014
Sodyum fosfat monobazikSigma AldrichS2554
Magnezyum klorürSigma AldrichM9272 ve nbsp;
Kalsiyum klorür Sigma Aldrich223506
Papain Ayrışma SistemiWorthington 
Dimetil sülfoksit susuzSigma Aldrich276855
Pluronic F-127 Düşük UV emilimi*Yaşam teknolojileriP-6867DMSO'da %20 çözelti 
Fura-2   Anaspec84017
Fluo-4   Yaşam TeknolojileriF23917
Fluo-8AbcamAb142773
Titreşimli bıçak mikrotomu ve nbsp;Leica BiosystemVT1200 SLeica' ile Donatıldı s Vibrocheck ve ticaret; Ölçüm cihazı 
Titreşim önleyici tablaKinetik Sistemler Vibraplane Vibraplane 9100/9200 
Sabit Kademeli Dik MikroskopOlympusBX51WI 
Mikroskop ObjektifiOlympusXLUMPlanFLN 20x/1.00w20X 
Mikroskop ObjektifiOlympusLUMPlanFLN 60x/1.00w60X
CCD KameraAndorIxon +
Yüksek hızlı dalga boyu değiştiriciSutter cihazıLambda DG-4  
Yama kelepçesi amplifikatörüMoleküler CihazlarMultiClamp 700B
Veri toplama sistemiMoleküler CihazlarDigidata 1440AAxon Digidata® Sistem
Borosilikat cam kılcal damarlarSutter Instrument CoBF150-86-10
Mikroelektrot çektirmeSutter Instrument CoP-97Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirme
Kayıt/perfüzyon odasıWarner InstrumentsRC-40LPDüşük Profilli Açık Banyo Odaları
YazılımMoleküler CihazlarpClamp 10.2
Andor iQ Canlı Hücre Görüntüleme YazılımıAndorAndor iQ3
Beyin KüpüPayo ScientificBR26021976www.braincubator.com.au
Peltier-Termoelektrik Soğuk Plakalı SoğutucuTE TeknolojisiCP-121
Sıcaklık Kontrol CihazıTE TeknolojisiTC-36-25 RS232
LK003150,

Kaynaklar

  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
  4. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
  5. Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396(2014).
  6. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588(2015).
  7. Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
  8. Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  9. Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  10. Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
  11. Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
  12. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
  13. Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
  14. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
  15. Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).
  16. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Beyin Dilimi Haz rlamaRetina T m Da l m Haz rlUzat lm Doku nk basyonuUV I nlama Y ntemiKalsiyum G r nt leme ProtokolElektrofizyolojik Kay tBraincubator SistemiKarbogen OksijenlemesiS cakl k Kontrol
Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.