Yöntem makalesi

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

16K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55436

⸱

11 Nisan 2017

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Graduate Program, The University of Western Ontario, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, The University of Western Ontario, 3Department of Chemical Engineering, Queen's University, 4Department of Chemical & Biochemical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Western Ontario

Bu makalede

Özet

dokuya özgü, hücre dışı matris (ECM) hücre fonksiyonunun önemli bir düzenleyicidir. Bu makalede, saf ECM türevli köpükler ve in vitro hücre kültürü modelleri ileri 3D uygulamaları için ya da ön-rejeneratif bioscaffolds gibi kimyasal çapraz bağlama yapılmasına gerek olmadan kültürdeki kararlı olan mikro taşıyıcıları sentezlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

Özet

Hücre işlev, karmaşık dokuya özgü bileşime ve yapıya sahiptir hücre dışı matrisin (ECM) ile etkileşim aracılık eder. Bu makalenin konusu in vitro hücre kültürü modellerindeki veya doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta pro-rejeneratif yapı iskeleleri ve hücre verme sistemleri gibi gelişmiş 3D biyolojik ilgili alt-tabakalar olarak kullanmak üzere ECM türevli gözenekli köpükler ve mikro taşıyıcılar imal edilmesi için yöntemler üzerinde. Bir başlangıç ​​malzemesi olarak hücresizleştirilmiş doku ya da saflaştırılmış çözünmeyen kolajen kullanılarak teknikleri özelleştirilebilir geometriye sahip dokuya özgü bioscaffolds geniş bir dizi sentezlenmesi için uygulanabilmektedir. yaklaşım, mekanik işleme ve kontrollü dondurma ve liyofilizasyon prosedürleri yoluyla, üç boyutlu köpükler ya da mikro taşıyıcılar imal etmek için kullanılan bir ECM süspansiyon elde etmek için, hafif enzimatik sindirim içerir. Bu saf ECM türevli iskeleleri kullanılan kimyasal gerek kalmadan oldukça gözenekli, ancak kararlıdiğerleri negatif hücre fonksiyonunu etkileyebilir maddeleri ya da başka katkı maddeleri çapraz bağlama. iskele özellikleri örneğin ECM süspansiyon konsantrasyonu, mekanik işleme yöntemleri ya da sentez koşulları gibi çeşitli faktörlere göre bir ölçüde ayarlanabilir. Genel olarak, iskeleler, sağlam ve kolay olan, ve doğal ECM bileşimi taklit eden bir çok yönlü ve kullanıcı dostu 3D hücre kültürü platform sağlayan pek çok standart biyolojik tahliller için dokular olarak işlenebilir. Genel olarak, özel ECM türevli köpükler ve mikro taşıyıcılar imal edilmesi için, bu basit yöntem, in vitro ve in vivo uygulamalarda dokuya spesifik hücre öğretici platformlar olarak iki biyologlar ve biyomedikal mühendisleri ilgi çekici olabilir.

Giriş

Hücre dışı matris (ECM) proteinleri, glikoproteinler ve polisakaritlerin 1 kompleks 3 boyutlu ağı meydana gelir. Bir kez bir ağırlıklı yapısal çerçeve olarak kabul, şimdi de ECM önemli fonksiyonel rolleri 2 biyoaktif moleküllerin çeşitli bir dizi içerir olduğu kabul edilmektedir. ECM etkileşimlerinde hücre yaşamını, yapışma, hareketi, çoğalması ve farklılaşması 3 yönlendirebilir. ECM makro moleküllerin ana sınıfı genel olarak iyi doku ve türleri boyunca muhafaza edilir iken, her bir doku özel bir matris bileşimi ve mimari 4 sahiptir. Genel olarak, dokuya spesifik ECM doku / organ ölçekli 5 alt hücresel fonksiyonunu aracılık eden bir öğretici mikro sağlar.

Mevcut hücresel fonksiyonuna aracılık ECM kritik rolüne, de ilgi var artmaktadırDoku mühendisliği ve rejeneratif tıpta uygulamalar için ECM türevli bioscaffolds arasında velopment. Özellikle, hücresizleştirme yöntem yoğun doku rejenerasyonu ve hücre teslimat 5, 6, 7 için bir iskele malzemesi olarak kullanım için dokuların geniş bir ECM elde etmek için bir araç olarak incelenmiştir. Hücresizleştirme tipik ideal ECM 8 3 boyutlu yapısına ve bileşime az değişiklik neden olurken, hücrelerin ve hücre bileşenlerinin çıkarılması hedefleyen mekanik, kimyasal ve / veya biyolojik işlem aşamalarının yanında bir dizi içerir. Literatür araştırması yoluyla, çeşitli hücresizleştirme protokolleri vücutta 7'de hemen hemen her doku için tespit edilebilir.

hücresizleştirilmiş doku implante iskeleler veya 3 boyutlu hücre kültür substrat olarak doğrudan kullanılabilir olsa da, hücre infiltrasyonu olabiliryoğun bir ECM yapı 9 dokularda sınırlı. Bundan başka, ECM doğal heterojenlik potansiyel hücresel yanıtı 10 etkileyebilir hücresizleştirilmiş matrisler, içinde hücre bağlanması ve dağıtımında değişkenlik neden olabilir. Genel olarak, bunların bütün halinde hücresizleştirilmiş doku uygulanması, bazı uygulamalar için umut verici sınırlı şekil, gözeneklilik, ve sertlik dahil olmak üzere ayarlama iskele özellikleri açısından çok yönlü, hem de in vivo uygulamalar için dağıtım modunu sunarken.

Bu sınırlamaları aşmak için, çok sayıda araştırma grupları, bir baz materyal olarak hücresizleştirilmiş dokular kullanılarak özel iskele biçimlerini üretmek için daha fazla işleme yöntemlerini uygulamak vardır. En basit formunda, bu enjekte dokuya özgü ECM parçacıkları 11 oluşturmak için hücresizleştirilmiş doku kryoöğütme kapsayabilir. Bu ECM partikülleri hücre Aletleri, olarak dahil edilebilirörneğin hidrojeller, 12, 13, 14 çapraz bağlama yerinde gibi diğer biyomateryallerle bileşik iskeleler, içinde ctive bileşeni. Mekanik işleme ilave olarak, hücresizleştirilmiş dokuları da 3 boyutlu baskı için enzimatik proteolitik ve / ya da ECM-türevli hidrojeller, köpükler, mikro taşıyıcıları imal etmek için glikolitik enzimler ve kaplamalar 15, 16, 17, sindirim ve aynı zamanda sentezlenmesi bioinks tabi tutulabilir 18.

Doku mühendisliği uygulamaları yanı sıra, ECM-türevli bioscaffolds biyolojik araştırmalar için in vitro bir model yüksek aslına uygunluk elde edilmesi için büyük bir potansiyele sahip. Daha iyi yerli hücresel mikroçevreyi 19 recapitulate 3D hücre kültürü sistemleri geliştirmek için önemli bir ihtiyaç vardır. En çok in vitro Cgüncel ell kültür çalışmaları canlı dokular 20 içinde bulunan biyolojik olarak karmaşık ve dinamik hücresel çevre ile küçük bir ilişki vardır doku kültür polistiren (TCPS) üzerinde yürütülmektedir. Bu basitleştirilmiş sert 2D substratlar üzerinde hücreleri, kontrollü bir ortam içinde hücresel etkileşimler üzerinde çalışmak kültürlenmesi için uygun olsa da 22 hücre bağlanması ve morfolojisini, hem de her iki hücre-hücre ve hücre-ECM değiştiren 21 etkileşimler de belirlenmiştir. 2D TCPS üzerinde gözlenen hücre uyarlamalar in vivo sistemler 23 modelleme 2D çalışmalar alaka sorulara neden sağkalım, çoğalma, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli hücre işlevlerini düzenleyen hücre içi sinyal yollarını etkileyebilir. Hücresel davranış 3D sistemleri 24 karşı 2D büyük ölçüde değişir ve biyokimyasal ve bi o ki giderek daha fazla fark olmuşturECM ile omechanical sinyal hücre fonksiyonunun 25 anahtar aracılardır. Birçok grup, kollajen, laminin, ve fibronektin gibi ECM bileşenleri ile TCPS kaplanarak kurulan 2D sistemlerin sınırlamalarını aşmak için çalışmışlardır. Bu stratejiler hücre tutunması ve hücresel tepkileri değiştirebilir olsa da, bu modeller doğal ECM 26, 27 kompleks mekansal kuruluş ya da biyokimya taklit etmez 2 boyutlu konfigürasyonu ile sınırlı kalmıştır.

Bizim biyoteknik laboratuar 3-D hücre kültürü ve doku mühendisliği uygulamaları için alt-tabakalar olarak ECM türevli bioscaffolds geliştirilmesine ilgi olmuştur. Özellikle, adipoz rejenerasyonu 28 için bir iskele platformu olarak hücresizleştirilmiş adipoz dokusunun kullanımı (DAT) öncülük etmiştir. Ayrıca, D kullanılarak 3D mikro taşıyıcıları ve gözenekli köpükler sentezlenmesi için yöntemler kurdukProteolitik enzim pepsin ya da glikolitik enzim ile sindirilmiş AT α-amilaz 29, 30, 31. Açıkça, yağ kaynaklı ECM kültüründe insan yağ türevi kök / stromal hücreler (ASC) arasında adipojenik farklılaşması için bir endüktif mikro sağlar Bu yapı iskelesi biçimlerinin her boyunca göstermiştir. Daha yakın bir zamanda, (32. Wainwright uyarlanan hücresizleştirme yöntemleri), sol ventrikül (DLV) hücresizleştirilmiş α-amilaz ile sindirilmiş domuz 3D gözenekli köpükler üretmek için üretim yöntemleri genişletilmiş ve erken cardiomyogenic uyarılması için destekleyici bir platform sağlar gösterdi insan perikardiyal yağ-türevi TSK 31 markör ifade.

Bu makalede ayrıntılı olarak tamamen türetilmiş olmayan kimyasal olarak çapraz bağlantılı 3D gözenekli köpükler ve mikro taşıyıcılar sentezlenmesi için yöntemlerden in vitro hücre kültürü yüzeylerin biyolojik olarak kompleks 3 boyutlu olarak kullanım için ve doku rejenerasyonu için biyolojik olarak ECM α-amilaz ile sindirilmiş. Teorik olarak, yüksek molekül ağırlıklı kolajen ihtiva eden herhangi bir ECM kaynağı bu teknikler için başlangıç ​​malzemesi olarak kullanılabilmektedir. Bu yaklaşım esnekliği göstermek için, yöntemler, insan DAT kullanılarak dokuya özgü bioscaffolds oluşturmak için uygulanmıştır, domuz hücresizleştirilmiş deri dokusu (DDT) 8 ve temsili örnekler olarak domuz DLV. Şekil 1, ECM-türevli köpükler ve mikro taşıyıcılar için fabrikasyon işlemi görsel bir bakış sağlar.

figure-introduction-1
Şekil Dokuya özgü ECM türevli Köpükler ve mikro taşıyıcılar Üretimi için Yöntem 1. Genel Bakış. 1. Hücresizleştirilmiş dokular, ofisler izleyerek, yavaşlamalularization protokolleri, dokuya özgü ECM türevli bioscaffold imalatı için de kullanılabilir. Makroskopik görüntüler, domuz DDT (Flynn 28 2010 de tarif edildiği gibi hazırlandı) (ReinG, JE ve arkadaşları tarif edildiği gibi hazırlanır. 2010 8) hidratlanmış insan DAT gösterilir ve Wainwright de tarif edildiği gibi, domuz DLV (hazırlanmıştır. 2010 32 ), başlangıç ​​malzemeleri olarak kullanılabilir ECM kaynaklarının temsili örnekler olarak. Ölçek çubukları 3 cm temsil eder. 2. hücresizleştirilmiş doku, liyofilize edilir ve daha sonra 3 mekanik olarak kıyılmış. Ölçek çubukları 1 cm temsil eder. 4. kıyılmış ECM daha sonra köpük imalatı için ve isteğe bağlı olarak, kriyobroyaja tabi tutulmuş, ancak mikro taşıyıcı sentezi için gerekli olabilir. Ölçek çubuğu 3 mm'yi temsil eder. 5. kıyılmış veya kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM daha sonra α-amilaz ile sindirildi ve homojen bir ECM süspansiyonu oluşturmak için homojenize edilir. Ölçek çubuğu 1 cm temsil eder. köpük imalatı için 6a), ECM süspansiyon iyi tanımlanmış geometri ile gözenekli bir 3D yapı iskeleti oluşturmak için bir kullanıcı tarafından tanımlanan kalıp, dondurulmuş ve liyofilize aktarılır. Ölçek çubuğu 1 cm temsil eder. 6b) mikro-taşıyıcı imal edilmesi için, kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM süspansiyon ayrı küresel mikro taşıyıcıları oluşturmak için electrosprayed edilir. Ölçek çubuğu 2 mm'yi temsil eder. 7. köpükler ve mikro taşıyıcılar daha sonra yavaş yavaş hidrate edilip hücreler ile tohumlanabilir. Temsilcisi görüntüleri (canlı hücreler = yeşil) insan TSK gösterilen bir DAT köpük (solda) ve DAT mikro taşıyıcı (sağda) üzerine ekilir. Ölçek çubukları 100 um temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Protokol

1. Hücresizleştirilmiş Doku İşleme

  1. Decellularization ve Liyofilizasyon
    1. kurulu bir protokol izlenerek ilgi konusu hücresizleştirilir doku (lar).
      NOT: Mevcut çalışmada Yapı iskeleleri insan DAT 28, domuz DDT 8 ve domuz Dlv 32 için yayınlanan decellularization protokolleri takip hazırlanmıştır. 50 mg / mL - ticari olarak temin edilebilen, çözünmeyen kolajen, aynı zamanda, 10 bir konsantrasyon aralığı üzerinde başarılı bir şekilde kullanılmış olan sığır tendon kaynaklı kolajen gibi köpükler ve mikro-taşıyıcılar, imal etmek için kullanılabilir. Diğer çözünmeyen kolajen kaynakları kullanılabilir, ancak kararlı yapı iskeleleri verecek konsantrasyon aralığını belirlemek için optimizasyon gerektirebilir.
    2. T, daldırın doku için yeterli iki kez damıtılmış su (GKD 2 O) forseps ile bir 50 ml lik santrifüj tüpüne hidratlanmış hücresizleştirilmiş doku ya da saflaştırılmış kolajen aktarın ve ekleme35 mL ed maksimum toplam hacim.
    3. daha sonra liyofilizasyon sırasında süblimasyon için yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak üzere, dondurma sırasında yatay bir şekilde yerleştirilmiş bir santrifüj tüpü ile, -80 ° C de bir gece boyunca örnek dondurun.
    4. santrifüj tüpüne kapağını çıkarın ve bir liyofilizasyon kavanozuna dondurulmuş örnek aktarmak.
    5. 72 saat ya da tamamen kuruyana kadar - 48, bir laboratuar dondurma kurutma kullanılarak örnek liyofilize edilir.
      Not: Kuruma süresi farklı lyophilizers ve hücresizleştirilmiş dokular için değişebilir.
    6. (- 2 ila 3 mm ~ 1) keskin cerrahi makas kullanılarak İnce küçük parçalar halinde liyofilize ECM kıyma.
    7. daha sonraki işlemler için hazır olana kadar bir desikatörde kıyılmış ECM saklayın.
      NOT: kıyılmış ECM ortamdan nem emilimini önlemek için hemen kullanılabilir önerilir.
  2. Kryoöğütme (köpük imalatı için isteğe bağlı)
    1. Bir Laborato için 25 ml paslanmaz çelik öğütme odası doldurunry ball değirmen kıyılmış liyofilize ECM ile sistem ve iki 10 mm paslanmaz çelik freze topları ekleyin.
    2. Kapatın ve tamamen 3 dakika süre ile sıvı azot içinde yüklenen öğütme odası daldırın.
    3. Değirmen 30 Hz (1,800 rpm) ile 3 dakika boyunca dondurulmuş numune.
    4. ECM, ince bir toz halinde öğütülmektedir kadar yineleyin 1.2.2 ve 1.2.3 adımları tekrarlayın.
      Not: Bu adımlar ECM kaynakları arasında değişebilir tekrar edilmelidir sayısı. Örneğin, DAT tipik olarak, ince bir toz üretmek üzere 3 öğütme döngüsü gerektirir.
    5. Bir cam şişe içine bir scoopula kullanılarak toz transferi sıkı bir şekilde yapışması ve bir kurutucuda saklayın.
  3. ECM, süspansiyon hazırlanması
    1. ECM (köpükler veya mikro taşıyıcılar için) ya da (köpükler için) kıyılmış veya kriyobroyaja tabi tutulmuş, 250 mg tartılır ve bir 15 mL santrifüj tüpüne transfer. sırasıyla, kıyılmış ECM ve kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM'nin hazırlanması için 1.1.6 ve bölüm 1.2 adıma bakınız.
      NOT: Bu protokol, 50 mg / mL, ECM Asma tavanlar hazırlamak için tasarlanmıştır, Sion insan DAT, domuz DDT ve domuz Dlv için tavsiye edilen. Belirli bir ECM kaynağına bağlı olarak, düzgün süspansiyonlar daha yüksek ya da daha düşük bir başlangıç ​​konsantrasyonlarda elde edilebilir.
    2. 0,22 M NaH2 4 (pH 5.4) bir santrifüj tüpüne tampon ve tüp sıvı seviyesini işaretlemek 5 ml ekleyin.
    3. 1 ml 0.22 M NaH2 4 (pH 5.4) tampon α-amilaz 7.5 mg eklenmesiyle bir α-amilaz bir stok çözelti hazırlayın. α-amilaz, stok çözeltisi 100 uL ilave et; numuneye (α-amilaz 0.75 mg% 0.3 / kuru doku ağırlık). 10 mL'lik bir son hacim elde etmek üzere 0.22 M NaH2 4 ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 72 saat boyunca 300 rpm'de sürekli süspansiyon çalkalayın.
    5. 10 dakika boyunca 1500 x g'de süspansiyon santrifüjleyin. Dikkatle toplayıp sindirilmiş ECM topağına zarar vermeden süpernatant atılır. GKD 2 O. içinde seyreltilmiş,% 5, 10 mL NaCI pelet malzeme yeniden süspanse
    6. GKD 2 O. içinde% 5 NaCI ile iki kez durulama toplam adımı tekrar 1.3.5
    7. Süpernatant atılır ve GKD 2 O 10 mL topak haline malzeme tekrar süspansiyon
    8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 rpm'de sürekli süspansiyon çalkalayın.
    9. 10 dakika boyunca 1500 x g'de süspansiyon santrifüjleyin. Dikkatle toplayıp sindirilmiş ECM topağına zarar vermeden süpernatant atılır.
    10. Adım 1.3.2 yapılan 5 ml işaretine kadar 0.2 M asetik asit ilave edin.
    11. 37 ° C'de 120 rpm, O / N sürekli süspansiyon çalkalayın.
    12. Görünür fragmanları kalmayıncaya kadar bir testere dişi 10 mm genişliğinde prob ile donatılmış bir el homojenleştirici kullanılarak on saniyelik aralıklarla oda sıcaklığında ECM süspansiyon homojenize edilir. Aşırı ısınmayı önlemek için homojenizasyon aralıkları arasında soğuk su dolu bir beher içinde süspansiyon yerleştirin.
      NOT: ECM kaynağına bağlı olarak, 0.2 M asetik asit içinde daha fazla seyreltme homojen bir süspansiyon elde etmek için gerekli olabilir. EECM, süspansiyon xcessive soğutma verimli homojenleştirmeye engelleyebilir viskozitesinde bir artışa neden olabilir. viskozitede bir artış not edilir, numune, 37 ° C'ye kadar ısıtılmadan ve daha ileri işleme tabi tutulabilir.
    13. en fazla bir ay önce, bir köpük ya da mikro-taşıyıcı üretimi için 4 ° C'de saklayın.

2. ECM-türevli köpük imalatı

  1. Süspansiyon ısınana kadar 120 rpm'de sürekli ajitasyon ile 37 ° C 'de aşama 1.3.13 ECM süspansiyonu (kıyılmış ya da kriyobroyaja tabi tutulmuş) inkübe edin.
  2. istenen konsantrasyona asidik, 0.2 M asetik ECM süspansiyon seyreltin.
    Not: DAT, DDT ve dlv için önerilen aralık olarak 50 mg / mL - - 15 ile 100 mg / mL, ECM kaynağına bağlı olarak, kararlı köpükler 10 aralığında hazırlanabilir. Tipik olarak, daha yüksek konsantrasyonlarda imal köpükler biraz daha az gözenekli fakat kültürde daha dengelidir ve idare edilmesi daha kolay olacaktır.
  3. 3 ml şırınga ağırlık kullanılarakECM, süspansiyon içinde kabarcık oluşumunun önlenmesi için bir 18 G iğne i ECM süspansiyonu ile arzu edilen, kalıbı doldurmak. , DAT, DDT, ve DLV köpüklerin imal 48-çukurlu bir hücre kültürü ile işlenmiş plaka içine 35 mg / ml, ECM süspansiyonu 400 uL dağıtmak için.
    NOT: Seçilen kalıbın şekli ile ECM süspansiyonun hacmi elde edilen bir köpük geometrisini belirler.
  4. Kapak ve yerleştirerek -20 ° C veya -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya ile gece boyunca kalıp dondurma.
    NOT: donma sıcaklığı köpüklerin gözenekliliği etkiler. -80 ° C ile karşılaştırıldığında örnekleri, daha büyük buz kristallerinin 33 oluşumuna, -20 ° C'de dondurulur zaman büyük gözenekler beklenmektedir. homojen bir gözenekli yapı ile köpükler imal etmek için, kalıp yönlü soğumasını önlemek için, iletken bir yüzey ile temas halinde olmayan olduğundan emin olun.
  5. bir toz haline getirici bir şişeye donmuş örnekleri içeren kalıplar yerleştirin. LABORAT için toz haline getirici şişeyi bağlayınory donma kurutma sistemi ve 24 saat kuru.
    NOT: Numune liyofilizasyondan önce donmuş vaziyette olması önemlidir.
  6. Gerekli kadar desikatörde liyofilize köpükleri saklayın.

Electrospraying ile 3. ECM türevli Mikro taşıyıcı İmalatı

Not: kurmak electrospraying genel bir bakış, Şekil 2'de gösterilmiştir.

  1. 100 rpm, O / N sürekli ajitasyon ile 37 ° C 'de aşama 1.3.13 den kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM süspansiyonu inkübe edin.
    Not: kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM süspansiyon içinde daha üniform olmasını sağlamak ve electrospraying sırasında tıkanmasını önlemek için ECM türevli mikro taşıyıcıları imal etmek için kullanılır.
  2. Yük 3 3 mL Luer kilit şırıngaya ECM süspansiyon ml ve şırınga deliğinin üzerine ayarlanmış bir kanatlı infüzyon ekleyin.
    Not: İğne ölçer bir dizi seçim elde edilen mikro boyutu ve şekli etkileyebilir kabul ederek, kullanılabilir. fabricat içine DAT, DDT, ve DLV mikro taşıyıcı, bir 25 G iğne kullanımı.
  3. Şırınga pompası içinde şırınga edin. bir otoklav standına iğne sabitleyin ve 4 bir mesafede dikey olarak iğne ucu konumlandırmak - düşük formu Dewar şişesi üstünden 6 cm (250-500 ml boyut aralığı tavsiye edilir).
  4. iğne ucu bir timsah klip elektrot takın ve yüksek-voltaj güç kaynağı pozitif kutbuna bağlayın.
  5. termos kenarının üzerine alüminyum folyo (12 x 5 cm) bir şerit katlayın.
  6. folyonun dış kenarına ikinci timsah klip elektrot takın ve güç kaynağının toprak kaynak terminaline bağlayın.
  7. Folyo daldırıldığından ¾ kadar, yaklaşık olarak üstten 1 cm kadar sıvı nitrojen ile Dewar şişesi doldurun.
    NOT: sıvı nitrojen dolu Dewar şişesi tutmak önemlidir. Sıvı azot yüzey electrospraying işlenme sırasında şişenin üstten 2 cm'den az olmalıdırs. sıvı nitrojen sürekli dolum electrospraying sırasında sabit bir seviyede tutmak için gereklidir.
  8. 30 ml / saatlik bir infüzyon hızı şırınga pompası ayarlayın.
    Not: infüzyon hızının değiştirilmesi mikro-taşıyıcı şekline ve çapma değiştirmez, ancak tavsiye edilen aralık 25 ise olabilir - 35 ml / sa. bu süspansiyonun viskozitesi oldukça bağımlıdır birlikte, 25 ml / s altındaki akış oranları daha büyük mikro üretilmesine yol açabilir. çok düşük akış hızlarında, mikro boyutu ve şekli, daha homojen bir hale gelebilir. 35 ml / s üzerinde bir infüzyon hızlarında, electrospraying yoluyla üretilen damlacıkların homojenliği, daha geniş bir boyut dağılımı 34 ile küresel olmayan mikro taşıyıcılar ile sonuçlanan, bozulabilir.
  9. 20 kV gerilim uygulayın ve electrospraying başlatmak için şırınga pompası açın.
    Not: gerilim ayarlamak için mikro boyuta değiştirilebilir ve eğilimi olabilir infusio daha çapı üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olduğuN oranı. 25 kV - tavsiye edilen gerilim aralığı 15'dir. Mikro taşıyıcı çapında bir azalma gerilimi 35 bir artış ile tahmin edilmektedir.
  10. infüzyon tamamlandıktan sonra, dikkatli bir dondurulmuş kalmasını sağlamak için sıvı azot ~ 25 mL içinde süspanse mikro taşıyıcıları bırakarak Dewar fazla sıvı azot dökün.
  11. Hemen tek bir hareketle dökülerek bir 50 ml santrifüj tüpüne sıvı nitrojen ile mikro taşıyıcıları aktarın. Bir scoopula ile Dewar kalan herhangi bir dondurulmuş olarak mikro-taşıyıcılar toplamak ve bir santrifüj tüpüne ekleyin.
    Not: Dewar boyutuna bağlı olarak, sıvı azot içinde mikro taşıyıcılar, başlangıçta orta büyüklükte bir kap içine döküldü ve daha sonra 50 ml lik santrifüj tüpüne hemen aktarılabilir.
  12. liyofilizasyon için hazırlanmasında küçük delikler ile delinmiş bir alüminyum folyo ile sıvı azot içinde mikro-taşıyıcılar içerir santrifüj tüpü örtün.
  13. örtülü santrifüj yerleştirinbir toz haline getirici bir şişeye borular. Hemen liyofilizatör için balon bağlamak ve örnekleri O / N kurutun.
    NOT: çözdürme çöküşü ve / veya toplama sonuçlanabilir gibi, bu adımdan önce cozundurmeden sağlamak için sıvı nitrojen içinde süspansiyon mikro taşıyıcıları tutmak için çok önemlidir. 500 um büyüklüğünde - yukarıda tarif edilen electrospraying koşulları kullanılarak 35 mg / mL'lik bir konsantrasyonda imal DAT, DDT ve DLV mikro taşıyıcılar tipik olarak hidre çapı 350 arasında değişen olacaktır. boyut dağılımı ECM kaynağına bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
  14. Gerekli kadar desikatörde liyofilize mikro taşıyıcıları saklayın.

figure-protocol-1
Şekil Mikro taşıyıcı üretiminde kullanılan Electrospraying cihaz 2. Genel Bakış. C: şırınga pompası dahil anahtar electrospraying ekipmanın düzenlemesini gösteren resimve yüksek voltaj güç kaynağı, aynı zamanda, sıvı azot Dewar iğne nisbetle konumlandırılması. B: gerilim, infüzyon hızı ve mesafe için tavsiye edilen aralıklar dahil olmak üzere, şematik Electrospraying. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Hücre Kültürü 4. Hazırlama köpükler ve mikro taşıyıcıların

  1. Su kaybını
    1. (: Etanol 1 oranında köpüklere ~ 5), fazla mutlak etanol (~% 99.9) ihtiva eden bir 50 mL santrifüj tüpüne forseps ile liyofilize köpükler aktarın. Benzer şekilde, toplama için kullanılan orijinal santrifüj tüp içinde fazla mutlak etanol liyofilize mikro taşıyıcıları tekrar süspansiyon. serolojik bir pipet kullanarak, herhangi bir agrega çıkması ve arzu edilen boyut aralığında seçilmesi için yeni bir 50 ml lik santrifüj tüpüne tanımlanmış ağ büyüklüğüne sahip bir paslanmaz elekten mikro taşıyıcıları filtre edin.
      NOT: köpükler TCPS plakaları içinde fabrikasyon, bunlar bu gemiler içinde doğrudan yeniden hidrallanabilir.
    2. 4 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edilir veya köpükler halinde veya mikro taşıyıcılar sahip olana kadar ağırlık santrifüj tüpünün dibine yerleşti. Steril reaktifler ve uygun aseptik teknik kullanılarak, bir laminar akış başlığı takip eden tüm adımlar gerçekleştirin.
    3. serolojik bir pipet kullanarak mutlak etanol çıkarmak ve aşırı ekleyin: iskelelerine (5: 1 oran), steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir,% 95 etanol. 4 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edilir ya da ECM-türevli iskeleleri rehidrasyon kabının tabanına batmış kadar.
    4. Yavaş yavaş (steril PBS ile seyreltilmiş 90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 ve% 0), bir etanol dizi iskeleleri rehidrate. iskeleler çözeltisi değiştirmeden önce kabın altına inmiştir kadar, her adımda, 4 ° C'de inkübe edin. iskeleler olan kabarcık oluşumu obs ise hafif vakum altında iskeleleri gazdan arındırınerved.
    5. geriye kalan etanolü atmak için ek iki durulama için steril PBS değiştirin.
    6. Hücre kültürü için hazır olana kadar 4 ° C'de,% 100 steril PBS içerisinde muhafaza edin. Rehidrasyondan aşağıdaki 2 hafta - 1 içindeki iskeleleri kullanın.
  2. Hücre tohumlama için hazırlık
    1. Önce tohumlamaya gün, hücre kültürü iyi tedavi plakalar veya Transwell uçlar halinde forseps kullanılarak köpükler transferi ve tam iskeleleri (örneğin, 2.5 ml / iskele olarak batırmak için (ilgi hücre tipine göre seçilir) yeterli hücre kültür ortamına ilave 12 çukurlu plaka). mikro taşıyıcılara ortamın: 1 oranını Benzer şekilde, ağırlık ile mikro taşıyıcılar dikkatli bir şekilde santrifüj tüp içinde yerleşmeye mikro taşıyıcıları rahatsız etmeden serolojik bir pipet kullanarak PBS kaldırmak ve 5 elde etmek için, hücre kültür ortamına ilave sağlar.
      Not: İnsan TSK tohumlama için, Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) kullanmaktadır: Ham F12 besin karışımı ile takviye edilmiş% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin.
    2. Bir durulama toplam hücre kültür ortamı değiştirin.
    3. 37 ° C'de hücre kültürü ortamı içinde iskeleler gece boyunca dengeye getirin. iskeleleri ertesi gün tohumlama hücre için hazır olacaktır.
      Not: köpükler, statik hücre kültürü ekler veya doku kültürü yuvalı plakalar 29 ekilmiş veya dinamik bir laboratuar çalkalayıcısı 36 kullanılarak tohumlanabilir. ECM, bir kaynaktan, işleme yöntemleri ve süspansiyon konsantrasyonuna bağlı olarak, dinamik tohumlama başlangıç ​​hücre eklenmesi, çoğalması ve infiltrasyonu arttırabilmektedir. Mikro taşıyıcılar topaç kültür sistemi 11 kullanılarak dinamik olarak ekilebilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, biz teknikler ECM kaynakları olarak hücresizleştirilmiş, çeşitli dokuların (kullanarak dokuya özgü bioscaffolds oluşturmak için uygulanabilir olduğunu gösteren temsili örnekler olarak insan DAT, domuz DDT, ve domuz dlv kullanılarak ECM-türevli köpükler ve mikro-taşıyıcılar fabrikasyon Şekil 1). Her iki köpük ve mikro-taşıyıcı imal edilmesi için, α-amilaz 37 glikolitik enzim ile kollajen çözündürme Nishihara tekniği kontrollü dondurma ve liyofilizasyon prosedürleri ile bioscaffolds sentezlemek için kullanılan hücresizleştirilmiş doku başlangıç malzemeleri, bir zor akışlı ECM bir süspansiyon oluşturmak üzere uyarlanmıştır.

köpükler imal etmek için, hücresizleştirilmiş doku mekanik kıyma haline gelme veya enzimatik sindirim önce yüzey alanını artırmak için kryoöğütme yoluyla ya işlenebilir. Takip etme45; tedavisi ve homojenizasyon-amilaz, Nihai ECM süspansiyon daha sonra dondurulmuş ve liyofilize edilerek bir kullanıcı tanımlı bir kalıp içine dağıtılır. iskeleler uzun bir süre boyunca kuru halde stabil bir şekilde depolanabilir. Hücre kültürleri çalışmalarında kullanılmadan önce, liyofilize iskeleleri saf ECM (Şekil 3A) elde edilen gözenekli ve yüksek hidratlı homojen köpükler veren bir kontrol rehidrasyon işlemine tabi tutulmaları gerekmektedir. köpükler çok hızlı bir şekilde yeniden hidrate durumunda, hızlı şişme bütünlüğü ve yapısal çökme kaybı ile sonuçlanan, hassas yapısal özelliklere zarar verebilir. Genel olarak, köpükler, orijinal küf aşağıdaki rehidrasyonu tanımlanan şeklini muhafaza edecektir ve kimyasal çapraz bağlama ihtiyacı olmadan stabildir. Şekil 3B DAT, DDT temsili taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri gösterilmektedir ve DLV 35 mg / mL'lik bir konsantrasyon ve -80 & # bir donma sıcaklığında kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM ile imal köpükler176 ° C.

figure-results-1
Şekil -80 ° C'de 35 mg / ml ve dondurulmuş bir Konsantrasyonunda kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM Süspansiyonlu DAT, DDT, ve DLV köpükler imal 3. Örnek görüntüler. C: DAT, DDT, ve dlv makroskopik görünüşüdür rehidrasyonun ardından bir 48 oyuklu doku kültürü plakası, bir kalıp içinde sentezlenen köpükler öğütülür. Ölçek çubukları 1 cm temsil eder. B: Bir homojen, gözenekli ultrastrüktürel gösteren DAT, DDT, ve DLV köpüklerin SEM görüntüleri. Ölçek çubukları 100 um temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM süspansiyonlar da Şekil 2 (electrospraying teknikleri ile saf ECM türevli mikro taşıyıcıları oluşturmak için kullanılabilir ). Kontrol rehidrasyonu (Şekil 4A), aşağıdaki çapı 500 um - her bir ECM kaynağı, süspansiyon konsantrasyonu, iğne göstergesi, infüzyon hızı, ve gerilim için 350 arasında değişen ayn küresel mikro taşıyıcıları oluşturmak için ayarlanmış olabilir. Mikro taşıyıcılar liyofilize bir halde saklanabilir birlikte, bunların dağıtılmış veya etanol içinde yeniden süspansiyon haline getirilmesi, aşağıdaki istenen boyut aralığına elenir bu kullanım kolaylığı için tavsiye edilir. SEM görüntüleme mikro taşıyıcı ince yapısı hücresizleştirilmiş doku kaynağı (Şekil 4B) bağlı olarak değişebilir düşündürmektedir.

figure-results-2
Şekil 35 mg / mL, 0.5 mL / dak lık bir aşılama oranı, 20 kV bir uygulanan voltaj, bir Konsantrasyonunda kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM Süspansiyonlu DAT, DDT, ve DLV Mikro taşıyıcılar imal 4. Örnek görüntüler. C: Makroskopik görünüm ohidratlı DAT, DDT ve DLV mikrotaşıyıcıları f. Ölçek çubukları 4 mm temsil eder. B: ince yapısı ve boyutu, ECM kaynağına bağlı olarak değişebilir gösteren DAT, DDT, ve DLV mikro SEM görüntüleri. Ölçek çubukları 100 um temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Iskelelerinin mekanik özellikleri ECM kaynağına bağımlı olan işleme göre bir yöntem (diğer bir deyişle kryoöğütme karşı kıyma) ECM süspansiyon konsantrasyonu ve donma sıcaklığı uygulanan. Genel olarak, iskeleler 1 aralığında Young modüllerine sahip, yumuşak ve uyumlu - (- 50 mg / 20 mL) 31 ve <1 5 kPa DAT (50, 100 mg / ml) 29 ve DLV köpükler için rapor mikro taşıyıcı için kPa. kriyobroyaja tabi tutulmuş köpükleri, inci tipik olarak daha yumuşak olanonların daha kesintiye doğası gereği bir kıyılmış köpükler. yüksek duyarlı yük hücreleri ile donatılmış uzmanlaşmış mekanik test sistemleri kompresif özellikleri doğru karakterizasyonu için ihtiyaç vardır. Tipik haliyle, köpük ve mikro taşıyıcılar olarak enzimatik sindirim ve homojenleştirme, hem de iskelelerinin kovalent olmayan bir şekilde çapraz bağlanmış yapısı dahil olmak üzere imalat için gerekli ek işleme adımlarına doğal hücresizleştirilmiş dokularda daha düşük modüle sahip olacaktır. Bununla birlikte, bu ilgi konusu dokuya bağlı olarak değişebilir. Örneğin, önceki çalışmada, kıyılmış DAT yüksek ECM konsantrasyonlarda imal köpükler (100 mg / ml) doğal yağ dokusu 29 benzer modüle olduğu bulundu.

Rehidre ECM türevli köpükler ve mikro taşıyıcılar, in vitro hücre kültür çalışmaları ve / o için bir hücre destekleyici bir platform temin etmek üzere, statik veya dinamik kültür koşulları altında hücreleri ile tohumlanabilmektedirin vivo hücre teslim r. iskeleleri, genellikle hücre eki desteklerken, tohumlama verim ECM kaynağı, iskele geometrisi ve gözeneklilik ve ilgili hücre tipine bağlı olacaktır. Bu şekilde, tohum yöntem ve yoğunluklar kullanıcı tanımlı koşullara bağlı olarak optimizasyon gerektirir. Hücre infiltrasyonu geliştirmek için bir orbital çalkalayıcı üzerinde dinamik tohumlama ile, 1 x 10 6 hücre / iskele - köpükler, yukarıda tarif edildiği için, 0.25 aralığında bir başlangıç hücre konsantrasyonunu önerilir. Dönen bir kültür şişesi 11 dinamik koşullar altında gerçekleştirilir tohumlama ile, 50,000 hücre mikro taşıyıcı / mg - mikro taşıyıcı için, 25,000 aralığında bir başlangıç tohumlama yoğunluğuna işaret etmektedir. Şekil 1 alt kısmında gösterilen resimler konfokal mikro ile gösterildiği gibi, insan TSK (sağ, bir amin-reaktif boya ile etiketlenir ve 13 mavi görünen) bir DAT bir köpük (sol) veya DAT mikrotaşıyıcı tohumlanmış temsilskopinin bir flüoresan hücre canlılığı, leke kullanılarak (kırmızı canlı hücreler = yeşil, ölü hücreler, =; Ölçek çubukları 100 um ifade etmektedir). Konfokal mikroskopi kalınlığı da 2 mm 'ye kadar köpüklerin yüzeyine serpildi hücreleri incelemek için kullanılabilir, ancak iskelelerinin merkezi bölgelere görselleştirme bunların bir nitelik ile sınırlıdır. Bununla birlikte, köpükler ve mikro taşıyıcılar dokular olarak tedavi edilebilir ve parafine gömülmüş veya kriyo-kesitli histolojik ve immünohistokimyasal hücre dağılımı ve işaretleyici ifade görselleştirmek için analiz eder.

Tartışma

2D TCPS göre sentetik iskeleler veya standart kültür modelleri ile karşılaştırıldığında genel olarak, hücresizleştirilmiş dokulardan türetilen bioscaffolds daha yakından doğal hücresel mikro ECM kompleks 3 boyutlu kompozisyonunu ve yapısını yaklaşık olarak belirleyebilir. Daha önce ele alındığı gibi, hücre-ECM etkileşimleri kültüründe ve gövdesi 1 hem de hücresel davranışı aracılık önemli bir rol oynamaktadır. ECM, biyokimyasal biyofiziksel ve biyomekanik özellikleri, her dokuya özgü olduğunu kabul ederek, aynı zamanda daha fazla gelişmesinde, doku mühendisliği için biyomalzeme tasarımında doku spesifik yaklaşımlar uygulayacağı gerekçesini destekleyen bulgular artmaktadır in vitro deneyler 20 için fizyolojik ilgili kültür modelleri. Bir başlangıç ​​malzemesi olarak hücresizleştirilmiş doku kullanan bizim yöntemler daha cust içinde dokuya özgü ECM kompleks bileşimi dahil olabiliromizable iskele biçimleri. mekanik ve enzimatik işlem adımları doğal ECM yapısı ile ilgili bir kayba neden olur ise, DAT önceki çalışmalar bioscaffold bileşimin önemli bir aracısı olduğunu gösteren, yağ kaynaklı ECM'nin öğretici etkiler, bu skafold biçimlerde korunmuş olduğunu göstermiştir hücre fonksiyonu 11, 29 arasında. sağlam hücresizleştirilmiş dokulara kıyasla hücre kültür substrat olarak ECM türevli köpükler ve mikro taşıyıcılar kullanılarak göre önemli bir avantajı, hücre dağılımı ve hücre-hücre / hücre-ECM etkileşimlerinde homojenliğini artırabilir, daha homojen olmasıdır.

Burada tarif edilen yöntemler, hücre kültürü, doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere dokuya özgü bioscaffolds geniş bir dizi oluşturmak için kullanılabilir. Örneğin, DAT, DDT ve Dlv ek olarak, bizim laboratuvar başarıyla 3D por oluşturmak için bu teknikleri uyguladıHücresizleştirilmiş kemik, kıkırdak, nucleus ve halka fibroz, hem de sığır tendon türetilmiş ticari olarak temin edilebilen, çözünmeyen kolajen kullanılarak lı köpükler. Bir in vitro bakış açısıyla, bu bioscaffolds yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama platformları 39 veya sapı gibi öğretici matrislerinde biyoaktif substratlar olarak, hücresel biyoloji, fizyoloji veya hastalık patolojisi 38 araştırmak için daha yüksek duyarlıklı 3D kültür modelleri için bir temel olarak kullanılabilir hücre farklılaşması, 40, 41. 25 konsantrasyonlarda imal DAT, DDT ve DLV köpükler - 50 mg / mL (28 güne kadar test edilmiştir) in vitro kültüründe uzun vadede stabildir. en az 2 hafta - (15 rpm'de 10) ayrıca, mikro üç tip düşük kesmeli değiştirici kültür sistemindeki dinamik koşullar altında hücre bağlanması ve çoğalmasını destekleyebilir. İn vivo uygulamalar için, biyolojik olarak uyumlu ve biodegradable ECM türevli köpükler ve mikro taşıyıcılar yapıcı, doku yeniden modellemesi ve rejenerasyonu 11, 29 uyarmak için off-the-shelf ürünler olarak ümit vaat etmektedir. Bundan başka, hücre-yapıştırma iskeleleri hücre tedavisi verme sistemleri 42, 43 olarak kullanılabilir. Bir örnek olarak, DAT köpükler allojenik TSK ile tohumlandı ve bir bağışıklığı yeterli bir sıçan modelinde 29 deri altından implant edildiğinde anjiyogenez ve adipogenezi teşvik ettikleri gösterilmiştir. 12 haftalık tarafından emilmesini konakçı dokuları ile entegre edilmiştir ve hemen hemen tam bir hale gelmiştir, bozulmamış DAT ile karşılaştırıldığında, daha yüksek işleme DAT hacminde% 50'lik bir azalma ile, çok daha hızlı bir şekilde parçalanır köpükler 3 hafta belirtti. Bununla birlikte, köpükler, aynı zamanda, enzim ile sindirilmiş ECM özgü ön-rejeneratif etkiye sahip olduğunu göstermektedir, daha güçlü bir anjiyojenik yanıt uyarmıştır. Benzer şekilde, ECM-türevli mikro taşıyıcılar, in vitro olarak kullanılabilir </ em> dinamik kültür sistemlerinde hücre kültürü substratlar ve enjekte edilebilir hücre verme araçları 11, 30, 44. Hücre canlılığı destek ve enjeksiyon 30 sahasında hücre tutulmasını artırmak için yardımcı olabilir bir matris sağlarken Daha özel olarak ise, mikro küçük çaplı ve geniş yüzey alanı, küçük bir hacim içinde hücrelerinin büyük bir miktarda verilmesini sağlayabilir. Bir canlı sisteminde kullanılmadan önce, kaynak ECM negatif konakçı tepkisi 7 tetikleyebilecek antijenik hücresel bileşenlerden ve / veya potansiyel olarak sitotoksik hücresizleştirme reaktiflerin ölçüde yoksun olduğundan emin olmak için önemlidir.

Proteolitik enzim pepsin yaygın ECM türevli hidrojellerin 15 hazırlanmasında kullanılır. Pepsin kolajen ve ECM proteinleri int sindirir spesifik olmayan bir proteazdırKüçük fragmanlar 45 o. Pepsin ile sindirilmiş ECM imal hidrojeller hücreye öğretici etkilere sahip olduğu rapor edilmiş olmasına rağmen, bir sınırlama, bu malzeme 46 çok mekanik olarak zayıf olma eğilimindedirler olmasıdır. DAT mikro eden ilk gelişimi olarak, pepsin sindirilmiş DAT aljinat ile bir araya getirilmiş ve küresel boncuklar 30 oluşturmak üzere CaCl2 içine damla damla ilave edildi bileşik bir yaklaşımıdır. Boncuklar daha sonra foto-çapraz bağlı ve aljinat, sodyum sitrat kullanılarak ekstre edilmiştir. 950 um - 30 kimyasal çapraz bağlama için şartına ek olarak, önemli bir sınırlama, bu yaklaşım ile üretilen mikro taşıyıcılar 900 bir boyut aralığında altında zayıf kararlılık vardı. pepsin yerine, burada sunulan yöntemler telope karbonhidrat gruplarının ayrılması için kabul edilmektedir α-amilaz glikolitik enzim ile ECM daha hafif bir sindirim kullanmaktadırkollajen ptide bölgeleri, bu şekilde asetik asit 37 içinde çözünürlüğü artar. Bu yaklaşım, kimyasal çapraz bağlama veya diğer katkı maddeleri ihtiyacı olmadan saf ECM türevli köpükler ve mikro taşıyıcıları oluşturmak için kullanılabilir yüksek polimerli kollajen izolasyonunu sağlar. Bu bioscaffolds doğal ECM mikro-kollajen benzer iyi korunmuş kolajen fibrilleri, arasındaki fiziksel etkileşimler ve hidrojen bağları yoluyla stabilize edilir.

köpükler seçilen özel kalıp bağlı geometriler aralığında imal edilebilir son derece esnek bir platformdur. Hücre kültürü çalışmaları için, köpükler, kaplamalar ya da değişen kalınlıkta 3D iskeleleri oluşturmak üzere, TCPS yuvalı plakalar doğrudan dökülebilir. çok düzgün yüzeyli 3D köpükler imal etmek için, bir özel kalıp plastik ya da cam lamlar ile her iki tarafta yalıtılabilmesi tasarlanmış olması önerilir. Ya kıyılmış veya kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM sentezlenmesi için kullanılabilirköpükler. Genel olarak, kriyobroyaja tabi tutulmuş köpükleri makroskopik olarak yumuşak olması ve daha düşük konsantrasyonlarda 31 de 36 daha kesintiye ultra yapısını sahip olma eğilimi olduğunu bulduk. doku kaynağına bağlı olarak, ek mekanik işlem aşamaları hücre fonksiyonunu etkileyebilir ECM bileşim içinde değişikliklere yol açar. Örneğin, daha önceki çalışmalarında, laminin kıyılmış DLV köpükler tespit, ancak DLV 31 köpükler kriyobroyaja tabi tutulmuş değildi. Bunun aksine, kolajen I, kolajen IV, laminin ve fibronektin kıyılmış hem de algılanabilir ve DAT 36 köpükler kriyobroyaja tabi tutulmuş edildi. Mekanik işleme adımlarına ek olarak, köpüklerin, gözeneklilik ve gözenek boyutu, ECM süspansiyon konsantrasyonu ve donma sıcaklığı 47 değiştirilerek bir ölçüde ayarlanabilir. Genel olarak, daha düşük bir konsantrasyon köpükler (~ 10-15 mg / mL) niteliksel olarak daha çok gözenekli, ama hızla büzülmesini sağlayabilir ve kötü olmasıuzun süreli kültürde 31 36 kararlılık. Benzer şekilde, tipik olarak, daha yüksek bir donma sıcaklığı ile elde yavaş dondurma oranı, imalattan 29 sırasında oluşan buz kristallerinin boyutu köpüklerde büyük gözenekleri neden olabilir. Bu parametrelerin tümü eki, sızma ve yeniden dahil malzemeler ile hücre etkileşimlerini etkileyebilir. Örneğin, daha yüksek ECM konsantrasyonları ile imal edilmiştir köpükler hücre büyümesi özellikle kıyılmış ECM kaynakları ile ve statik kültür koşulları 36 altında, yüzey bölgeleri ile sınırlı olabilir.

mikro taşıyıcı için, ayarlanabilir anahtar parametreler daha yüksek konsantrasyonlar tipik olarak uzun süreli dinamik kültürü altında daha kararlı olan mikro taşıyıcıları elde ile ECM süspansiyon konsantrasyonu, iğne ölçer ve uygulanan voltajı vardır. electrospraying başlatılmasından sonra, ECM Suspensiyon damlacıklar hızlı bir şekilde alüminyum folyo kolektör yönünde, şişenin merkezinde yer alması gerekir. toplanmasını önlemek için, boncuk önce folyoya sıvı azot temas önemlidir. iğne ve sıvı azot yüzeyi arasındaki mesafe, bu gereksinimleri karşılamak üzere ayarlanabilir. Kararlı bioscaffolds üretecektir konsantrasyon aralığını seçilmesinde bu optimizasyon, özellikle her bir spesifik ECM kaynağının özelliklerine bağlı olarak gerekli olabilir dikkat etmek önemlidir. Diğer bir önemli faktör ECM ya da olumsuz elde edilen köpükler ve mikro taşıyıcıların stabilitesini etkileyebilecek kalıntı reaktifler (örneğin, yüzey aktif maddeler) mevcut indirgeme hücresizleştirme yöntemleri olarak, başlangıç materyalleri üretmek için kullanılan hücresizleştirme protokolüdür. zorluklar bioscaffold stabilite, daha kademeli bir rehidrasyon işlemi kullanılarak içerir araştırılabilir amaç ECM susp artan karşılaşılırsaension konsantrasyonu ve kriyobroyaja tabi tutulmuş ECM karşı kıyılmış keşfetmek. Tüm bu seçeneklerin sorunu çözmek için başarısız olması halinde, hücresizleştirme protokolleri veya ECM kaynakları alternatif keşfetmek için gerekli olabilir.

iskele üretimi sırasında tekrarlanabilirliği sağlamak için, özel bakım protokolünde belli adımlarında alınmalıdır. hücresizleştirilmiş doku kryoöğütme zaman, öğütme ortamı nedeniyle nemin emilmesine hemen partikül agregasyonu olasılığını azaltmak için, kuru bir ortamda liyofilizasyondan sonra yapılması tavsiye edilir. mikro-taşıyıcı İmalat sırasında iğne tıkanmasına neden olabilir Örnek soğutma ile ilgili sorunları engellemek için, süspansiyon 3 mL maksimum hacmi ile, küçük miktarlar halinde electrosprayed olduğu ileri sürülmektedir. Dahası, mikro taşıyıcılar electrospraying işleminden sonra çözülmeye izin verilmez esastır. sferik geometri ve mekanik kararlılık, microcarri korumak içiners bir sıvı azot doldurulmuş bir kap içinde taşınan sıvı azot toplanan ve hemen, liyofilize edilmelidir. Son olarak, köpük ve mikro taşıyıcılara için, rehidrasyon adımlar, birden çok günlük bir süre boyunca yavaş yavaş gerçekleştirilir kritiktir. Hızlı rehidrasyon makro ve / veya mikro ölçekte Parçalanmaya neden olabilir. Bundan başka, rehidrasyon hafif vakum altında gazı giderilir zaman önemli miktarda gerektirebilir iskele içinde küçük hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yavaş yavaş gerçekleşmelidir.

Sonuç olarak, bu çalışmada sunulan yöntemler saf olmayan kimyasal olarak çapraz bağlantılı ECM oluşan dokuya özel köpük ve mikro çeşitli bir dizi üretmek için kullanılabilir. Biyolojik araştırmacılar için bir avantajı, bioscaffolds kullanımı kolay olan ve bu tür histoloji, immünohistokimya veya gen ve protein ekspresyon tahlilleri gibi tekniklerle analiz gerçekleştirilirken dokulara benzer şekilde işlenmiştir edilebilmesidir.Buna ek olarak, ECM-türevli iskeleleri tohumlanmış hücre popülasyonlarının çıkarmak için enzimatik olarak bozulmuş olabilir ya da biyolojik olarak parçalanabilen ve biyolojik olarak uyumlu bir hücre verme araçları olarak doğrudan kullanılabilir. Genel olarak, bu esnek bir platform teknolojisi hücre genleşme substratlar olarak hücre fonksiyonunu araştıran 3D hücre kültürü çalışmaları için dahil olmak üzere sayısız uygulamalar için büyük yarar, tutan ve pro-rejeneratif bioscaffolds.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) bu çalışma için fon sağlamıştır. Yazarlar, elektro püskürtme sisteminin kullanımı için Dr. Amin Rizkalla'ya, SEM görüntüleme ekipmanının kullanımı için Western Üniversitesi'ndeki Nanofabrikasyon Tesisi'ne, domuz dokusu örneklerinin sağlanması için Mount Brydges Mezbahası'na ve Dr. Aaron Grant, Brian Evans ve Robert Richards'a bu araştırmayı destekleyen klinik işbirlikleri için.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asit, buzulBioShopACE222.500
Timsah klipsi uçlarıVWR470149-728
Alüminyum folyoFisher Scientific01-213-101
&alfa;-amilazSigma101074694Aspergillus aryzae'den
Analitik teraziSartoriusCPA225D
SantrifüjThermo Scientific7500425115 ve 50 mL santrifüj tüpleri için sallanan kova rotorlu
Santrifüj tüpleri (15 mL)Sarstedt62.554.205
Santrifüj tüpleri (50 mL)Sarstedt62.547.205
Sığır aşil tendonundan kollajen (çözünmez)SigmaC9879 Veya benzeri çözünmeyen kollajen kaynağı; Köpükleri ve mikro taşıyıcıları imal etmek için hücreden arındırılmış dokulara alternatif olarak kullanılabilir
Kriyofrezeleme sistemiRetsch20.745.0001MM 400
DessicatorFisher Scientific8624426Liyofilize ECM ve biyoiskele depolama için
DMEM: F12 HamsSigmaD6421Proliferasyon ortamı için kullanılır
Dewar şişesiFisher Scientific10-196-6Düşük form; 250 - 500 mL hacim aralığı
Barnstead GenPure xCAD SuArıtma Sisteminden çift damıtılmış su (ddH2O
D-PBS (Fosfat Tamponlu Salin)Wisent311425125
ECM (Hücre Dışı Matriks)Flynn et al. 2010'da açıklandığı gibi insan yağ dokusu, domuz dermisi veya domuz miyokardından izole edilmiştir, Reing et al. 2010 ve Wainwright et al.< / em> 2010 (ref # 28, 8, 32)
EthanolGreenfield Özel Alkoller A.Ş.P016EAANMutlak
Fetal sığır serumu (FBS)Wisent80150Proliferasyon ortamı için kullanılır
ForsepsVWR 37-501-32Köpükleri aktarmak için
Dondurucu (-20 &°; C)VWR97043-346
Dondurucu ( -80 derece & derece; C)Thermo ScientificEXF40086A
Cam şişelerFisher Scientific03-339-26DLiyofilize kriyofrezelenmiş ECM
El tipi homojenizatörüFisher Scientific14-359-251Hız: 8.000 - 30.000 rpm
Homojenizatör aksesuarları: testere dişi tabanlı jeneratör problarıFisher Scientific14-261-1710 x 95 mm
Sıvı nitrojenElektropüskürtme için
LiyofilizatörLabconco7750021FreeZone4.5
Freze haznesiRetsch02.462.021325 mL hacim önerilir
Freze bilyalarıVWR16003-60610 mm çap, paslanmaz çelik önerilir
18 G iğneVWRC ABD305185ECM süspansiyonunu kalıplara dağıtmak için
Orbital inkübatör çalkalayıcıSciLogex832010089999Sıcaklık kontrollü (37 ° C; C)
Penisilin-streptomisinYaşam Teknolojileri15140-122Proliferasyon ortamı için kullanılır
Pipet-Aid XPMandel ScientificDRU-4-000-101
İmbik standıVWR470019-526
İmbik standı kelepçesiVWR21573-606
Güvenlik-Lok ŞırıngaBD309606Mikro taşıyıcı üretimi ve dağıtımı için 3 mL Luer kilitli şırınga ECM süspansiyonu
Serolojik pipetler (10  mL)Sarstedt86.1254.001
Serolojik pipetler (25 mL)Sarstedt86.1685.001
Sodyum klorürBioShop7647-14-5
Sodyum fosfat monobazikBioShop10049-21-5
ScoopulaVWR89259-968Mikro taşıyıcıları toplamak için
Cerrahi makasVWR82027-590
Şırınga pompasıVWR10117-490Mikroişlemci kontrollü
Yüksek voltajlı güç kaynağıGama Yüksek Gerilim AraştırmasıES30P-5W/DDPMÖnerilen 15 - 25 kV voltaj aralığında
12 kuyulu plakalarFisher Scientific12565321Köpük imalatı sırasında kalıp olarak kullanım için; Diğer boyutlar veya kullanıcı tanımlı kalıplar da seçilebilir
Kanatlı infüzyon setiTerumo2225809230 cm boru uzunluğu, 25 G 3/4" önerilir; Diğer iğne göstergeleri kullanılabilir ve mikro taşıyıcı çapını etkileyebilir
) saklamak için

Kaynaklar

  1. Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells? Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  3. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
  4. Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
  5. Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
  6. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  7. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  8. Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
  9. Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
  10. Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
  11. Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
  12. Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
  13. Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
  14. Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O'Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
  15. Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
  16. Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
  17. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  18. Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935(2014).
  19. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems - Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
  20. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  21. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  22. Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
  23. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro - A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
  24. Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
  25. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
  26. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122(2014).
  27. McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
  28. Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  29. Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
  30. Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
  31. Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
  32. Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
  33. Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
  34. Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
  35. Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
  36. Turco, B. Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , Queen's University. Kingston, Ontario, Canada. (2014).
  37. Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
  38. Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
  39. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  40. Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
  41. Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
  42. Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
  43. Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
  44. Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
  45. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
  46. Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
  47. Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D Matriks K p kleriECM Mikrota y c larDokuya zg skelelerDesell lize Doku lemeECM S spansiyon Haz rlamaKontroll Dondurma LiyofilizasyonuElektrosprey Tekni i3 Boyutlu H cre K lt r PlatformlarKimyasal Olarak apraz Ba lanmam skelelerRejeneratif T p letim Sistemleri

İlgili makaleler