Yöntem makalesi

3D Bioprinting'i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

DOI:

10.3791/55438

⸱

2 Temmuz 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital, 2Division of Cardiology, Johns Hopkins Hospital, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, sadece hücreler kullanılarak, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. Kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar önce izole edilir, sayılır ve istenen hücre oranlarında karıştırılır. Bunlar, ultra-düşük ek 96 delikli plakalar içinde bireysel kuyularda birlikte kültürlenir. 3 gün içinde sopoidler atılır. Bu sfero daha sonra vakum emiş kullanarak bir meme tarafından toplanır ve bir 3D bioprinter kullanarak bir iğne dizisi üzerine monte edilir. Daha sonra sferoidlerin iğne dizisi üzerinde sigortalanmasına izin verilir. 3D biyoprintten üç gün sonra, sferoidler, bozulmamış bir yama olarak çıkarılır; bu zaten kendiliğinden dayaktır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D biyoprintleme için birçok farklı yöntem vardır 1 , 2 , 3 . 3D biyoprinting, mürekkep püskürtmeli biyoprint, mikro ekstrüzyon biyoprint, lazer yardımlı biyoprint, metotların bir kombinasyonu veya daha yeni yaklaşımlar gibi örneklerle baskı teknolojisi 1 ile sık sık sınıflandırılır. 3D biyoprinting, iskeleye bağlı olmayan veya iskeleye bağlı yöntemler olarak sınıflandırılabilir. 3D biyoprintinin çoğu metodu, biyo-materyallere, örn., Biyometrik bağlantılar 5 veya iskele 6'ya ihtiyaç duyulduğunda, iskeleye bağlıdır. Bununla birlikte, iskele bağımlı 3D biyoprinting, iskele materyalinin immünojenisitesi, patentli bioink maliyeti, bozunma ürünlerinin yavaş hızı ve toksisitesi gibi birçok konuyu ve sınırlamaları 4 , 7 ile karşı karşıya bırakıyor.

ScafKüresel olmayan kardiyak doku mühendisliği, iskeleye bağlı doku mühendisliğinin bu dezavantajlarının üstesinden gelebilecek potansiyele sahip 8 olarak denenmiştir. Bununla birlikte, yazarların bu makalede belirttiği gibi, biofabrikasyon sürecinde sferoidleri sabit yerlerde sağlam bir şekilde tutmak ve konumlandırmak zordu. 3D biyoprint ve sferoya dayalı doku mühendisliğinin birlikte kullanımı bu zorlukların üstesinden gelme potansiyeline sahiptir. Bu protokolde, yalnızca sfero formundaki hücreleri kullanarak, diğer biyomalzemeler olmadan kardiyak dokunun 3D biyoprintini açıklıyoruz.

İskeletsiz sferoid tabanlı 3B biyoeneratörler 9 , vakumlu emici kullanarak tekli sferoidleri alıp iğne dizisine yerleştirme özelliğine sahiptir. 3D biyoprintide bir iğne dizisine küre biçimlendirme konsepti , eski Japonya'da iğne dizilerinin (" kenzan " olarak bilinir) kullanılmasından esinlenmiştirÇiçek düzenleme düzenlemeleri, ikebana. Bu sistem, sferoidlerin herhangi bir konfigürasyonda tam olarak konumlandırılmasını sağlar ve bireysel sferoitler, bir 3D biyoprote edilmiş doku oluşturmak için kısa bir süre boyunca kaynaşarak sonuçlanır. Bu yöntem, bu sayede, sferoidlerin kolaylıkla manipüle edilmesine ve iskelesiz organ biyofabrasyonunun geleceği için potansiyel etkilere sahip olmasına izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kardiyomiyositlerin hazırlanması

  1. Tanımlanan temel zar matrisi ile kaplanmış 6 yuvalı plakalar üzerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSC'ler) üretin ve kültürleyin.
  2. Daha önce tarif edilen yöntemler 11 , 12 kullanarak hiPSC'leri hiPSC türevi kardiyomiyositlere (hiPSC-CM'ler) ayırt edin.
  3. Farklılaştıktan 19 gün sonra, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle her oyuğa 2 mL Tripsin / EDTA% 0.05'lik kardiyomiyosit sostantivoek izole edin.
  4. Hücrenin ayrışmasını izlemek için kardiyomiyositleri optik bir mikroskop altında izleyin.
  5. 2 mL Tripsin inhibitörü 0.0125% kullanarak tripsin nötralize edin.
  6. Izole edilmiş kardiyomiyositleri boşaltın ve bir motorize pipet dolgu kullanarak bir 50 mL konik tüp içine aktarın.
  7. Bir pellet elde etmek için hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 250 xg'de 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Pelleti 5 mL Roswell Park'a tekrar süspanse edinB-27 (RPMI / B-27 hücre ortamı) ile takviye edilmiş Memorial Institute (RPMI) hücre ortamı.
  9. Hücre ortamındaki hücrelerin 20 μL'sini pipetleyin ve eşit miktarda% 0.4 Trypan Mavi çözeltiyle leke uygulayın.
  10. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve hücre canlılığını saymak ve elde etmek için otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemositometre kullanın.

2. Fibroblastların Hazırlanması

  1. İnsan kalp fibroblast (HCF) (yetişkin ventriküler tip) hücre hattını 13 başlatınız.
  2. HCF kültürü protokollerine uygun olarak geçiş yapın ve izole edin 13 .
  3. Hücre ortamındaki hücrelerin 20 μL'sini pipetleyin ve Trypan Mavisi çözeltisinin% 0.4'lük eşit miktarda lekelenmesini sağlayın.
  4. Yeni hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve hücre yaşayabilirliğini saymak ve elde etmek için otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemositometre kullanın.

3. Endotel Hücrelerinin Hazırlanması

  1. Insan umn başlatmakAçıklandığı gibi ilik ven endotel hücresi (HUVEC) hattı. Geçiş yapın ve tarif edildiği gibi HUVEC kültürleme protokollerine uygun olarak izole edin.
  2. Hücre ortamındaki hücrelerin 20 μL'sini pipetleyin ve eşit miktarda% 0.4 Trypan Mavi çözeltiyle leke uygulayın.
  3. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve hücre canlılığını saymak ve elde etmek için otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemositometre kullanın.

4. Ortak kültür:

  1. Bir hiPSC-CM'de 50 mL'lik bir konik tüp içinde karışık hücre çözeltisi stoğu oluşturmak için RPMI / B-27 hücre ortamında üç hücre tipini (hiPSC-CM, HCFler ve HUVEC'ler) karıştırın: HCF: HUVEC hücre oranı 70:15:15 ve mL başına 165.000 hücre konsantrasyonu.
  2. Karışık hücre çözeltisini, çok kanallı bir pipet kullanarak, oyuk başına 200 μL ya da oyuk başına 33.000 hücre ile ultra-düşük ek 96-iyi U-alt plakalara dağıtın.
  3. 96 oyuklu plakaları 3 gün inkübe edin (37 ° C,% 5 karbon dioksIde,% 95 nem).
  4. Işık mikroskopisi altında bireysel kuyuların merkezinde ve altındaki karışık hücre çok hücreli sferoitlerin varlığını kontrol edin.
    NOT: İki boyutlu bir mikroskobik projeksiyonda, bu sfero şekli dairesel görünür ( Şekil 1 ). Sferoitler, ultra-düşük bağlanma 96 delikli plakalara hücre tohumlamasından sonra 24 saat içinde oluşmalıdır. Sferoidler, 96 gözlü plakalara hücre tohumlamasından sonra 48 saat içinde atmaya başlamalıdır. Dövülmeyen sferoitler, son 3D biyoprintili kalp yamasının işlevsel olmasını sağlamak için 3D biyoprinting için kullanılmamalıdır. Connexin 43 (Cx43) ve troponin için spermlerin immünfloresansı, sfero hücresel bileşimi ve kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir 15 .

5. İskele-Özlü Kardiyak Dokuların 3D Biyoprinti

  1. Sferoidleri içeren plakları, iskelesiz sferoid tabanlı 3D bioprinter dergilerine yerleştirin.
  2. 3D bioprinter'ı açın ve 3D bioprinting yazılımını çalıştırın.
    1. "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode" ve "Home Return" tuşlarına tıklayın.
    2. Sfero kontrolü başlatmak için "Başla" altındaki yeşil simgeyi tıklayın.
    3. Ekrandaki "(2) Dia (μm)" sütununun altında sferoid çaplarının görünmesini bekleyin.
  3. Ortalama sfero çapını en yakın 100 μm'ye çıkarmak için "Başlangıç ​​ayarları" nı tıklayın ve yığın Z aralığına (μm) ortalama küresel dönüş çapını girin.
  4. "Toplam" ı tıklayın, "Katmanlar" altındaki sayı otomatik olarak yeniden ayarlanmalıdır. Ayarları onaylamak için "Uygula" yı tıklayın.
  5. "İğne Dizisi Haritası" nı tıklayın, "Katman No" na gidin, 3B biyoprint için istenen katmanı seçin ve bireysel küre biçimlerini seçerek ekranın solundaki haritada harita üzerinde istediğiniz 3D biyoprint tasarımını çizin. ClicK "3D bioprinting tasarımını onaylamak için" Uygula "yı tıklayın.
  6. İğne dizisi incelemesine başlamak için "İğne Dizi Kontrolü" nü tıklayın. İğne dizisi odak dışındaysa, kamera odağı ayarlamak için 0 ila 500 μm arasında değişen değerleri "OffsetZ (μm)" içine girin, 500 μm'den başlayan ve 100 μm ila 0 μm'lik bir azalma.
  7. "Muayene Parametreleri", "Tip 1" i tıklayın ve "Çap (μm)" değerini istediğiniz çap aralığına ayarlayın. "Yuvarlaklık (%)" ve "Düzgünlük (%)" değerlerini istediğiniz yüzdelere ayarlayın. Ayarları onaylamak için "Uygula" yı tıklayın.
    NOT: Burada sfero çapları 450 μm ila 550 μm arasında ayarlanmıştır. "Yuvarlaklık (%)" ve "Düzgünlük (%)", her bir kürecik için bilgisayar tarafından hesaplanan değerlendirmelerdir. Burada "Yuvarlaklık (%)" için kullanılan ayarlar% 60 ve "Düzgünlük (%)" için% 70'tir.
  8. "Durum" u tıklayın ve "Çap (μm)" değerini aynı ayara güncelleyinS önceki adımda. Ayarları onaylamak için "Uygula" yı tıklayın.
  9. 3D biyoprinterin memesini vakumla emerek ve bir iğne dizisindeki belirli yerlere sferoid yerleştirerek sfero başlamak için "Yığın Modu" nu ve ardından "Başlat" altındaki yeşil simgeyi tıklayın.
    NOT: 81 sfero (9 küremsi x 9 küremsi) içeren bir kalp yaması için, 3B biyoprodizyonu yaklaşık 20 ila 30 dakika sürmelidir.
  10. Biyoprintten sonra, steril forseps kullanarak, 3 boyutlu biyoprote edilmiş yama içeren iğne dizisini topla ve 150 mL RPMI / B-27 hücre ortamı içeren 250 mL steril behergreye aktar.
  11. 3D biyoprote edilmiş yamayı iğne dizisi ile 3 gün inkübe edin (37 ° C,% 5 karbon dioksit,% 95 nem).

6. İğne Dizi ve Doku Matürasyonundan 3D Biyopetilen Düzeltme Bırakma

  1. Üç gün bekletildikten sonra bir eliniz iğne dizisinin tabanında, diğeri plastik kapakta tYama, ipliğin dizisinden 3D biyoprote edilmiş yamayı çıkarmak için plastik kapağı hafifçe kaydırın.
    NOT: Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yağlama işlemi, bu adımdan hemen önce iğnelere gerektiğinde uygulanabilir ve daha düzgün ve kolay bir şekilde çıkarılabilir.
  2. Bir çift steril forseps kullanarak, üzerine 3D biyoprote edilmiş yama ile plastik kapağı kaldırın ve yama ve plastik kapağı RPMI / B-27 hücre ortamı içeren 35 mm çanağa aktarın.
  3. Yamayı medyaya bırakmak için forseps hala plastik kapağı tutarak, RPMI / B-27 hücre medyasındaki yama ile plastik kapağı hafifçe sallayın.
  4. 3D biyopetilen yamanın işlevsel olduğundan emin olmak için dayak mı edip etmediğini görselleştirmek için ışık mikroskopisi altında 3D biyoprote edilmiş yamayı inceleyin.
  5. 3 boyutlu biyoprote edilmiş yamayı 3 gün veya daha uzun süre 35 mm çanağında inkübe edin (37 ° C,% 5 karbon dioksit,% 95 nem).
    NOT: 3 gün sonra sferoidler birbirine kaynaşır ve içindeki deliklerIğnelerin bulunduğu yama artık görünür olmamalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adım 4.4'ün (ortak kültür) sonunda, yerçekimi ile küre biçimlendirmek için her kuyucuktaki hücreler ultra-düşük ek 96-kuyucuk U-alt plakalarının tabanında birikmelidir. Bu sferoitler, hiPSC-CM, HCF'ler ve HUVEC'leri içerir ve iki boyutlu projeksiyon ile dairesel görünmeleri gereken ışık mikroskopisi altında görsel olarak incelenebilir ( Şekil 1 ). 6.3. Adımın sonunda, 3D biyoprote edilmiş kardiyak yama, iğne dizisi tarafından oluşturulan iğne deliklerine bağ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D biyobaskı için dövücü, fonksiyonel sferoidlerin kullanılması önemlidir. Sferoidler atmıyorsa, onları kullanmaya devam etmek her zaman işlevsel olmayan bir 3D biyobaskılı yama ile sonuçlanacaktır.

Bu yaklaşımın bir yararı, toplam hücre sayısını ve sferoidlerdeki kardiyomiyositlerin, endotel hücrelerinin ve fibroblastların yüzdesini değiştirerek yamanın hücre içeriğini manipüle etme yeteneğidir. Bu, değişen histolojik ve mekanik özelliklere sahip birçok farklı tipte kardiyak yamanın basılması...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: Kardiyovasküler Araştırmalar İçin Önemli olan Sihir ve Maryland Kök Hücre Araştırma Fonu (2016-MSCRFI-2735).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GeltrexInvitrogen 
Tripsin / EDTA %0.05Thermo Fisher15400054
Tanımlı Tripsin inhibitörü %0.0125Thermo FisherR007100
RPMI Hücre OrtamıInvitrogen11875-093RPMI, HIPSC-CM kültür ortamını oluşturur
B-27 TakviyesiThermo Fisher17504044B27 ile takviye edilmiş RPMI, HIPSC-CM'yi oluşturur kültür ortamı
Kontes Otomatik Hücre SayacıInvitrogenC10227
İnsan kardiyak fibroblastları (yetişkin ventriküler tip)Sciencell6310
İnsan göbek damarı endotel hücreleriLonzaCC-2935
PrimeSurface ultra düşük ataşman 96 oyuklu U-alt plakalar ve nbsp;Akita Sumitomo Bakalit A.Ş.MS-9096UZ
Regenova Bio 3D YazıcıCyfuse Biyomedikal K.K.N/Awww.cyfusebio.com/en/
Tripan Mavisi Çözeltisi,% 0.4Thermo Fisher15250061
Troponin T AntikoruThermo Fisher701620
Connexin 43 (Cx43) AntikorChemiconMAB3068
ProLong Altın Antifade Mountant ile DAPIThermo FisherP36935
A1413202 B27 ile takviye edilmiş

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
  2. Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
  3. Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
  4. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
  5. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  6. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
  7. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681(2015).
  10. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
  11. Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
  12. Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
  13. ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
  14. Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
  15. Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
  16. Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
  17. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002(2015).
  18. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
  19. Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Biyobas mH cre SferoidleriUltra D k Yap mane DizisiKonfokal MikroskopiSpontan At mDoku RejenerasyonuKalp Hastal Modelleri

İlgili makaleler