Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Summary

Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).

Abstract

Reaktif oksijen türleri (ROS) gen ekspresyonu, göç, farklılaşma ve proliferasyon da dahil olmak üzere gerekli hücresel süreçleri düzenler. Bununla birlikte, aşırı ROS seviyeleri, DNA'ya, lipitlere ve proteinlere geri döndürülemez oksidatif hasar eşlik eden bir oksidatif stres oluşturur. Böylece, ROS'un nicelendirilmesi, hücresel sağlık durumu için doğrudan bir vekil sağlar. Mitokondri, ROS'un başlıca hücresel kaynakları ve hedefleri arasında yer aldığından, patofizyolojik koşullarda arabağlantıyı daha iyi anlamak için aynı hücrelerde mitokondriyal fonksiyon ve ROS üretiminin ortak analizi önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin, mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔΨ _m ) ve mitokondriyal morfolojinin eşzamanlı olarak nicelendirilmesi için yüksek içerikli mikroskopi tabanlı bir strateji geliştirildi. Çok yönlü plakalarda yetiştirilen, yaşayan adherent hücrelerin otomatik geniş alan floresan mikroskobu ve görüntü analizine dayanıyor ve staineD hücreye geçirgen flüoresan haberci molekülleri CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (ΔΨ _m ve mitokondriyal morfoloji) ile karşılaştırıldı. Florimetri veya akış-sitometri aksine, bu strateji hem deneysel uyarı öncesi hem de sonrasında, yüksek spatiotemporal çözünürlük ile tek tek hücre seviyesinde subselüler parametrelerin miktarının belirlenmesine izin verir. Önemlisi, yöntemin görüntü temelli doğası, sinyal yoğunluğuna ek olarak morfolojik parametrelerin çıkarılmasına izin verir. Kombine özellik kümesi, alt popülasyonlar, hücre türleri ve / veya tedavileri arasındaki farkları saptamak için araştırma ve istatistiksel çok değişkenli veri analizi için kullanılır. Burada, kimyasal pertürbasyon sonrasında hücresel durumlar arasındaki belirgin ayrımcılık potansiyelini kanıtlayan bir deney deneyiyle birlikte, deneyin ayrıntılı bir tarifi verilmektedir.

Introduction

Hücre içi ROS konsantrasyonu, ROS üreten ve ROS sıyırma sistemleri arasındaki dinamik bir etkileşim vasıtasıyla titizlikle düzenlenir. İkisi arasındaki dengesizlik, oksidatif stres durumunu kışkırtır. ROS'un ana kaynakları arasında mitokondri ^{1 bulunur} . Hücresel solunumda rolleri göz önüne alındığında, hücre içi süperoksit (O ₂ ^{• -} ) moleküllerinden ² sorumludurlar. Bu, çoğunlukla elektron nakil zincirinin 1 kompleksinde elektron kaçağından kuvvetli negatif iç mitokondriyal zar potansiyeli (Δψ _m ) koşulları, yani mitokondriyal hiperpolarizasyon sonucu ortaya çıkar. Öt....

Protocol

Aşağıdaki protokol, NHDF hücreleri için ve materyal dosyasında belirtilen çoklu plakalar kullanılarak gerçekleştirildi. İş akışına genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.

1. Reaktiflerin Hazırlanması

1. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 v / v Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 100 IU / mL penisilin ve 100 IU / mL streptomisin (PS) ile takviye ederek komple ortam hazırlayın. 500 mL komple ortam için, 445 mL DMEM'ye 50 mL FBS ve 5 mL PS ilave edin.
2. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (magnezyum ve kalsiyum ile, fakat fenol kırmızısı olmadan) 20 mM HEPES ile takviye ederek HBSS-HEPES (H....

Results

Deney, çeşitli kontrol deneyleri kullanılarak kıyaslandı; bunların sonuçları Sieprath ve diğ. ¹ . Kısacası, CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin _, sırasıyla _, hücre içi ROS ve Δψ m'deki dışa bağımlı değişmelere karşı flüoresan yanıtı, dinamik aralığı belirlemek için nicelendirildi. CM-H ₂ DCFDA için NHDF, 10 uM ila 160 uM aralığında artan TBHP konsantrasyonları ile tedavi edildiğinde flüoresans sinyalinde doğrusal bir artış gösterdi. B.......

Discussion

Bu yazıda, NHDF'de hücre içi ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı olarak ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. SQV ile tedavi edilen NHDF üzerine bir vaka çalışmasıyla performansı gösterildi. Sonuçlar, ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler< / güçlü >
Tetrametilrodamin, Metil Ester, Perklorat (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (Genel Oksidatif Stres Göstergesi)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimetil sülfoksit	Sigma) Aldrich	D8418
MatriPlate 96 Kuyulu Cam Tabanlı MicroWell Plate 630 & L-Siyah 0,17 mm Düşük Cam Kapaklı	Brooks yaşam bilimleri sistemleri	MGB096-1-2-LG-L
HBSS, Fenol Kırmızısı olmadan 500 mL	Lonza	BE10-527F
L-glutaminli DMEM yüksek glikoz	Lonza	BE12-604F
Fosfat Bufered Salin (PBS), Ca ve Mg olmadan	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Tripsin-Versen (EDTA) Çözeltisi	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F (ab ') 2< / sub> Parça Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)		711-166-152	Düz alan görüntüsü elde etmek için kullanılan antikor
Alexa Fluor 488 AffiniPure F (ab') 2< / sub> Parça Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)		711-546-152	Düz alan görüntüsü elde etmek için kullanılan antikor
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Equipment
Nikon Ti tutulma geniş alan mikroskobu	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		donanım tabanlı otofokus sistemi
CFI Plan Apo Lambda 20X objektif	Nikon
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Software
NIS JOBS modülü ile Elelements Advanced Research 4.5	Nikon		Bu yazılım, mikroskobu yönlendirmek ve otomatik görüntü elde etme prototokolünü programlamak/gerçekleştirmek için kullanılır
ImageJ (FIJI) Sürüm 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Sürüm 1.0.44	Rstudio
R sürüm 3.3.2