Method Article

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/55450

⸱

May 31st, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Translational Skin Cancer Research, University of Duisburg/Essen, 2Institute for Experimental Immunology and Imaging, University of Duisburg/Essen, 3Imaging Center Essen, Electron Microscopy Unit, University Hospital of Essen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal temizleme protokolleri ile birlikte, ışık saçlı floresans mikroskobu (LSFM), büyük biyolojik örneklerde flüoresan etiketli yapıların analizi için altın standart haline geldi ve hücresel çözünürlüğe indirgendi. Bu arada, temel protokollerin sürekli arıtılması ve uzmanlaşmış ticari sistemlerin artan kullanılabilirliği, tüm fare organlarının mikroyapısını araştırmamızı ve hatta çeşitli canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında hücresel davranışın karakterizasyonuna izin vermemizi sağlıyor. Burada, iltihaplı fare kalplerindeki CD45 + lökosit popülasyonunun mekansal tüm montaj görüntüsü ve miktarının belirlenmesi için bir protokolü açıklıyoruz. Yöntem ölümcül kardiyak aritmilerle karakterize fulminan ölümcül miyokardit gelişimi için son zamanlarda sağlam ve endüklenebilir bir model olarak hizmet ettiği gösterilmiş bir transgenik fare soyunu (CD11c.DTR) kullanmaktadır. Bu protokol miyokardit indüksiyonu, intravitAl antikor aracılı hücre boyaması, organ hazırlığı ve LSFM'den sonra bilgisayar destekli görüntü sonrası işleme tabi tutulur. Belirli bilimsel sorunuz için oldukça uyarlanmış bir yöntem olarak sunulmasına rağmen, protokol, diğer organlarda ve hatta diğer türlerde bile tamamen farklı florasan yapıları hedefleyebilen kolayca ayarlanabilen bir sistemin planını temsil etmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık mikroskopisinin gelişimi sırasında, birçoğu özel formlar ortaya çıktı, bunların hepsi belirli örnekler için görselleştirme sürecindeki sınırlamaları en aza indirmek için geliştirildi. Böyle bir yöntem, ışık saçlı floresan mikroskobu (LSFM) 'dir. İlk olarak 1903'te Siedentopf ve Zsigmondy 1 tarafından geliştirilmiş ve 1990'ların başında ilk temel biyolojik uygulamaları bulan 2 , LSFM, flüoresan sinyal çözünürlüğü ile bozulmamış fare organları gibi büyük örneklerin görselleştirilmesi için şimdiye kadarki en güçlü mikroskopik araç haline gelmiştir Hücresel seviyeye iner. Bu avantajlardan dolayı, canlı hücr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, AB yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Essen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Almanya). Hayvanlar spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında kullanıldı ve muhafaza edildi.

1. Difteri Tehlikesi (DTX) ile Miyokardit İndüksiyonu

  1. DTX stok solüsyonunu 1 μg / mL çalışma solüsyonuna fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyrelterek miyokardın indüksiyonu için DTX solüsyonunu hazırlayın.
  2. Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi, bu solüsyondan 100 μL, 8 il....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan LSFM yaklaşımı, ciddi miyokarditin indüksiyonu üzerine murin kalplerindeki lökosit dağılımını ve miktarını analiz etmektedir. Şekil 1A , miyokardit indüksiyonu için transjenik CD11c.DTR farelerinin ön tedavi protokolünü açıklamaktadır. Bu aşama miyokarda lökositlerin alınması için gerekli tetikleyiciyi temsil eder. Başarılı bir DTX uygulamasından sonra, hayvanlar genel zayıflık, iştahsızlık ve 2-4 gün aralığında kilo kaybı gibi ciddi hastalık semptomları geliştir.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modern yaşam biliminde, biyolojik süreçlerin mikroskopik olarak görselleştirilmesi gittikçe önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, son iki yüzyılda bu noktaya kadar adreslenemeyen sorulara cevap bulmaya yardımcı olan birçok gelişme sağlandı. Birincisi, ışık mikroskoplarının çözünürlük yeteneğini temelde arttırma eğiliminde olmuştur. Yapısal aydınlatma mikroskopisi (SIM) 21 , 22 , stimulated emission-depletion (STED) mikroskopi 23 ve fo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gunzer laboratuarında yapılan araştırmalar Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (AD 0315590 no'lu hibe ile) ve Alman Araştırma Vakfı (hibe numarası GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) tarafından desteklendi. Teknik destek için IMCES'e, 3D karikatür modellemede yardım için Sebastian Kubat'a da teşekkür ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
difteri toksiniSigma AldrichD0564
fosfat tamponlu salinBiochromL182-10
ketamin [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
ksilazin [%2]Ceva
şırıngaBraunREF 9161502Braun Omincan F 
Gömülü venöz kateter Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
küçük hayvan solunum cihazıHarvard Aparatı73-0044MiniVent
anit-CD45 antikoru (AF647)BioLegend103124
etilendiamintetraasetik asit (EDTA) disodyum tuzu dihidratCarl Roth8043.2
kateter (21 G)BD BiosciencesREF 387455BD değer seti
paraformaldehitSigma AldrichP6148
PE tüp (5 mL)Carl RothEKY9.1Rotilabo
etanolCarl Roth9065.4
dibenzil eterSigma-Aldrich108014
tüp döndürücüMiltenyi Biotec130-090-753MACSmix
agaroz (düşük jelleşme)Sigma AldrichA4018
kalıp (15 x 15 x 5 mm)Doku Tek4566Cryomold 
ışık tabakası mikroskop sistemiLaVision BiotecUltramikroskop 
mikroskop gövdesiOlympusMVX10 
objektifOlympus0.5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm 
sCMOS kamera 5.5MPAndor Teknolojisi
488 nm OPSL (50mW) lazerTutarlı
647 nm  diyot lazer (50mW)Tutarlı
3D görüntü işleme ve analiz yazılımıBitplaneIMARIS Ver. 8.3
transgenik fare suşuSteffen Jung ve ark.CD11c.DTR
wt fare suşuEnvigoBalb/c Ola Hsd J
Lazer ModülüLaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objektif Lens

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
  2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light Sheet MicroscopyLeukocyte InfiltrateMurine MyocarditisFluorescence ImagingOrgan ClearingAntibody StainingImage ProcessingCardiac InflammationWhole Organ VisualizationCD45 Positive Cells

Related Articles